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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第12期
磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（phospholipid hyd-
roperoxide glutathione peroxidase，PHGPx or GPx4，
EC.1.11.1.12）是谷胱甘肽过氧化物酶家族中重要
的成员之一，能够有效清除机体内代谢产生的活性
氧 族（reative oxyen species，ROS） 和 自 由 基（free
radical），保护机体免受氧化应激的损害。PHGPx 也
是细胞内唯一一个能够直接清除磷脂氢过氧化物的
收稿日期 : 2012-04-26
基金项目 : 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（1630032012022）
作者简介 : 施力光 , 男 , 博士 , 助理研究员 , 研究方向 : 动物繁殖调控技术 ; E-mail: shiliguang123@126.com
通讯作者 : 荀文娟 , 女 , 博士 , 助理研究员 , 研究方向 : 动物繁殖营养调控技术 ; E-mail: xunwenjuan991@163.com
山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶生物信息学分析
施力光1，2  荀文娟1  周汉林1  侯冠彧1  岳文斌2  张春香2  杨茹洁3
（1 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，儋州 571737 ；2 山西农业大学，太谷 030801 ；
3 山西农业大学太原畜牧兽医学院，太原 030024）
摘 要 ： 旨在克隆山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPx）基因 cDNA 全序列并进行序列分析。提取山羊睾丸中总 RNA，
利用 RT-PCR 和 RACE 技术，扩增山羊 PHGPx 基因 cDNA 序列并对其生物信息学进行分析。结果表明，山羊 PHGPx 基因 cDNA 序
列全长 844 bp，共编码 199 个氨基酸 ；山羊与牛、猪、人和小鼠的氨基酸序列同源性均大于 90% ；山羊 PHGPx 蛋白二级结构功能
区域属谷胱甘肽过氧化物酶家族，预测 23-24 和 28-29 氨基酸位点有潜在的信号肽位点；UPGMA 算法构建该物种间分子系统进化树，
山羊与牛先聚为一类，再分别与猪、鼠、人、鸡聚类，最后与蜜蜂聚类，与物种动物学分类基本吻合。首次克隆了山羊 PHGPx 基因，
具有 GSH-Px 家族典型特征，研究结果将为 PHGPx 基因表达分子调控研究提供一定的理论依据。
关键词 ： 山羊 PHGPx 基因 RACE 克隆 序列分析
Bioinformatis Analysis of PHGPx Gene in Goat（Capra hircus）
Shi Liguang1，2 Xun Wenjuan2 Zhou Hanlin1 Hou Guanyu1 Yue Wenbin2
Zhang Chunxiang2 Yang Rujie3
（1Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Danzhou 571737 ；2Shanxi Agricultural
University，Taigu 030801 ；3College of Animal Science and Veterinary Medicine，Taiyuan 030024）
Abstract:  This study aimed to clone the full length cDNA of goat PHGPx gene. Total RNA was extracted from goat testis and the full
length cDNA was obtained by the reverse transcription PCR and RACE method. The results demonstrated that the full length of goat PHGPx
cDNA was 844 bp, which encode 199 amino acids. The multiple sequence alignments revealed that the identity of goat PHGPx amino acids
sequence were above 90% with other species. Bioinformatics analysis indicated that goat PHGPx belonged to GSH-Px family in the secondary
structure, and predicted the signal peptide at the position of 23-24 or 28-29. The molecular phylogenetic trees among species according the
UPGMA method indicated that goat and cow assembled, and then assembled with pig, rat, human and chicken, respectively and assembled with
bee last. This result of phylogenetic clustering was identical to the zoological classification. In summary, Capra hircus PHGPx gene has been
cloned, and it’s concluded that PHGPx has typical characteristics with the homologous genes in GSH-Px family. These results would be the
theoretical foundation for the further study on the genetic control of PHGPx gene expression.
Key words:  Goat PHGPx gene RACE Clone Sequence analysis
含硒酶，它还能抑制线粒体亚油酸过氧化反应产生
的过氧化氢物造成的细胞凋亡。另外，PHGPx 对信
号转导、炎症反应以及胚胎和胎儿发育也有很大影
响［1，2］。PHGPx 作为精子重要的结构蛋白，对雄性
动物精子发生过程中染色质凝集、精子分化成熟等
也有重要的调控作用［3，4］。
1994 年，Rovery 等［5］首次克隆了小鼠 PHGPx
2012年第12期 107施力光等 ：山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶生物信息学分析
基因 cDNA 序列，随后牛［6］、螨［7］、水螅［8］和鲤
鱼［9］等物种 PHGPx 基因 cDNA 也被成功克隆，山
羊 PHGPx 基因是否也是一个单拷贝基因，是否像
某些物种有不同的转录副本，而且近年来有文献指
出 PHGPx 活性可以作为衡量精液质量的重要指标之
一［10，11］，对生产实践亦有指导作用，因此获得山羊
PHGPx 基因的序列是在分子水平研究山羊精子发生
过程中 PHGPx 调控作用的前提，同时也可为 PHGPx
基因在生物进化演变过程及谷胱甘肽过氧化物酶家
族其他酶之间同源性分析提供一定参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验动物选用 3 只 1.5 周岁、体况良好、健康
无病、平均体重 48.6 kg 的性成熟波尔山羊。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取 无菌条件下去势睾丸组织，
经预冷的生理盐水冲洗去除睾丸上的血渍和脂肪，
迅 速 置 于 液 氮 保 存。 依 照 TaKaRa RNAiso Reagent
说 明 书 操 作 要 求 提 取 山 羊 睾 丸 总 RNA，DNase I
（TaKaRa）对总 RNA 进行消化。紫外分光光度计检
测其浓度与纯度，1% 琼脂糖电泳检测其完整性，贮
存于 -80℃冰箱。
1.2.2 引物设计与合成 根据 GenBank 已登录的牛
（NM174770）、人（BC010157）、猪（NM214407）和
小鼠（BC106147）PHGPx 基因 cDNA 序列，DNAStar
软件进行同源性比对，得到 PHGPx cDNA 的保守
区 域， 在 此 保 守 的 CDS 区 设 计 引 物，5RACE 和
3RACE 引 物 根 据 SMART RACE cDNA amplification
kit（Clontech，USA）操作说明要求，通过 Primer 5.0
软件设计，引物由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成，试验所用到引物序列，见表 1。
1.2.3 PHGPx 基因全长 cDNA 克隆
1.2.3.1 RT-PCR 扩增克隆 PHGPx cDNA 中间片段
以提取的山羊总 RNA 为模板，构建 10 μL 反转录体
系 ：总 RNA 4.5 μL，10×RT-buffer 1 μL，MgCl2（25
mmol/L）2 μL，dNTP Mixture（10 mmol/L）1 μL，
RNase Inhibiter（40 U/μL）0.25 μL，AMV Reverse
Transcriptase X（5 U/μL）0.5 μL，Olig dT（2.5
μmol/L）0.5 μL，RNase Free dH2O 0.25 μL；反应程序：
30℃ 10 min，42℃ 30 min，95℃ 5 min，5℃ 5 min。
mRNA 转录为 cDNA 后用作后续 PCR 模板，扩增引
物P1/P2和P3/P4，构建15 μL体系：10×PCR Buffer 1.5
μL，dNTP Mixture（10 mmol/L）1.2 μL，Taq DNA 聚
合酶（125 U）0.3 μL，正反向引物（10 μmol/L）各
0.5 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 10 μL，反应程序 ：
94℃ 5 min ；94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，35 个
循环 ；72℃ 10 min。
1.2.3.2 3RACE 和 5RACE 扩增 以提取的山羊睾
丸组织总 RNA 为模板，SMART RACE cDNA amplifi-
cation kit 提供的试剂反转录，体系为 ：总 RNA 3 μL，
5CDS Primer/3CDS Primer 1 μL，SMART Oligo 2 μL，
70℃ 2 min，冰浴 2 min，再加入 5×First-Strand Bu-
ffer 2 μL，Dithiothreitol DTT（20 mmol/L）1 μL，dNTP
Mixture（10 mmol/L）1 μL，MMLV Reverse Transc-
riptas 1 μL，42℃ 1.5 h，用 Tricine-EDTA Buffer 稀释
cDNA，72℃ 7 min。-20℃贮存。
5RACE 和 3RACE ：以上述 cDNA 为模板，构
建 RACE 反应体系 ：Master Mix 41.5 μL（包括 PCR-
Grade Water 34.5 μL、10×Advantage PCR Buffer 5
μL、dNTP Mix 1 μL、50×Advantage 2 Polymerase
Mix 1 μL），5/3RACE Ready cDNA 2.5 μL，UPM
（10×）5μL，GSP1/ GSP2 1 μL）。 反 应 程 序 ：94 ℃
30 s，72℃ 3 min，5 个循环 ；94℃ 30 s，70℃ 30 s，
72℃ 3 min，5 个循环 ；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃
3 min，30 个 循 环。 将 第 一 轮 PCR 产 物 用 Tricine-
EDTA Buffer 稀释 50 倍作为模板，以 NGSP1/NGSP2
为引物进行 PCR 反应，反应程序 ：94℃ 30 s，68℃
30 s，72℃ 3 min，20 个循环。
1.2.4 PCR 产物克隆测序 1% 琼脂糖凝胶电泳检
表 1 试验中所用引物序列
引物名称 引物序列（5-3）
P1 GGACATCGACGGGCGCAT
P2 CCTTGGGCTGGACTTTCA
P3 CAGTTTGGGAGGCAGGA
P4 CAGCAGGCTTGGGTAGG
5RACE GSP 1 AAAGAGTTCGCTGCTGGCTAT
5RACE GSP 2 ACCCTCTGTGGAAATGGATG
3RACE GSP 1 AGGCCAGCTCCTGAGAGCCC
3RACE GSP 2 GCTGGGTGAGTGGGCCGAAC
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期108
测 PCR 扩 增 结 果， 用 Qiagen 公 司 的 QIA quick gel
extraction kit 回收纯化，克隆到 TaKaRa 的 pMD18-T
载体。筛选阳性克隆送大连宝生物工程有限公司
测序。
1.2.5 序列分析 DNAStar 软件拼接所得序列，得
出山羊 PHGPx 基因 cDNA 全序列，并通过 http ：//
www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/、http ：//swissmodel.
expasy.org/ 等网站预测山羊 PHGPx 二级、三级结构
及功能区。采用 Mega 4.0 软件 UPGMA 算法构建系
统进化树。
2 结果
2.1 山羊总RNA提取
总 RNA 提取经核酸紫外分管光度计检测 OD260/
OD280 在 1.8-2.0 之间，浓度大于 1 μg/μL，经 1% 琼
脂糖电泳结果（图 1）显示，28S 和 18S 完整，RNA
无污染、降解发生，可用于后续试验。
2.3 山羊PHGPx基因 cDNA5和3RACE结果
RACE 扩增 PHGPx 基因 cDNA 5-和3-末端结果，
如图 3 所示，琼脂糖凝胶电泳检测到 5RACE 扩增
得到长 500 bp 左右的片段，3RACE 扩增得到长 700
bp 左右的片段。将所得产物纯化，克隆测序，得到
PHGPx 基因 cDNA 5-和3-末端序列。
28S
18S
5S
图 1 山羊总 RNA 检测结果
2.2 山羊PHGPx基因 cDNA中间片段RT-PCR产物
1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 RT-PCR 扩 增 引 物
P1/P2 和 P3/P4 产物，紫外灯下观察到长为 250-300
bp 左右的 PCR 扩增产物（图 2），TA 克隆测序后证
实克隆片段与预期相符。DNAStar 软件 SeqMan 程序
拼接，得到山羊 PHGPx 基因 cDNA 部分序列。
300
bp
M 1 2 3 4
250
M. DNA Marker ；1，2. 引物 P1/P2 扩增结果 ；3，4. 引物 P3/P4 扩增结果
图 2 RT-PCR 扩增引物 P1/P2、P3/P4 结果
1500
bp
500
100
M M M 1 2 3 4
M. DNA Marker ；1，3. 5RACE 扩增结果 ；2，4. 3RACE 扩增结果 ；
1，2. 无模板阴性对照
图 3 山羊 PHGPx 基因 5 和 3RACE 扩增结果
2.4 山羊GPx4基因cDNA序列分析结果
拼接 5 和 3 端序列与 RT-PCR 序列，获得山羊
PHGPx 基因 cDNA 的全长序列 ：山羊 PHGPx 基因
cDNA 全长 844 bp，共编码 199 个氨基酸，等电点（pI）
为 8.91，分子量约为 22.5 kD，起始密码子为 ATG，
终止密码子为 TAG，编码区碱基组成：A 为 22.72%、
G 为 30.02%、T 为 20.07%、C 为 27.20%，加尾信号
位于 814-819 bp，PolyA 尾巴含 12 个腺苷酸（图 4）。
PHGPx cDNA 编 码 氨 基 酸 二 级 结 构 预 测 分 析
结果（图 5）显示，包括 α-螺旋（41.71%），β-折叠
（17.09%）和卷曲螺旋（43.22%）3 种模块，卷曲螺
旋是通过疏水性接口相互缠绕而形成的稳定结构，
山 羊 PHGPx 包 括 17 个 卷 曲 螺 旋， 证 明 PHGPx 蛋
白具有稳定的结构保证正常生物功能发挥 ；功能结
构域位于 44-150 位氨基酸，编码磷脂氢谷胱甘肽
过氧化物酶（图 6）；SignalP-NN 和 SignalP-HMM 分
析 PHGPx cDNA 编码的氨基酸序列 23-24 或（和）
28-29 之间有可能存在信号肽位点（图 7 和图 8）；
PHGPx 跨膜区分析结果，如图 9 所示，山羊 PHGPx
蛋白无跨膜区 ；采用同源建模法（CPHmodels）预
测山羊 PHGPx 蛋白三级结构，选定 PDB 数据库中
2obiA（1.55Å）模板，相似性为 92.73%，且符合建
模标准，预测模型见图 10，包括 1 个核心螺旋，另
2012年第12期 109施力光等 ：山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶生物信息学分析
外在连接区还存在 3 个短螺旋和若干卷曲结构。
山羊 PHGPx 核苷酸序列、氨基酸与 GenBank
中已登录的牛（NM 174770）、人（BC 010157）、猪
（NM 214407）、小鼠（BC 106147）、猴（NM 00111-
8889）和鸡（AF 498316）的序列进行比对，结果（表
2 和图 11）显示，山羊 PHGPx 核苷酸序列与推导
的氨基酸序列与牛相似性最高，分别达到 95.7% 和
99%，第 2、4、5 为增加了异亮氨酸（I）、精氨酸（R）
和色氨酸（W），第 6 位由苯丙氨酸（F）变为色氨
酸（W）；与人、猪、小鼠 PHGPx 氨基酸序列相似
性亦都大于 90%，分别为 91.8%、93.4% 和 95.9%，
与鸡氨基酸序列差异较大，相似性仅为 76.3%。
ATG . 起始密码子 ；*. 终止密码子 ；……引物 P1/P2 ； 引物 P3/P4 ； 硒代半胱氨酸插入序
列（SECIS）；▲ . 硒代半胱氨酸（Sec）位点 ；阴影区 . 加尾信号 ；方框部分 . 线粒体前导序列
图 4 山羊 PHGPx 基因 cDNA 及其推导氨基酸序列
表 2 山羊 PHGPx 基因核苷酸及氨基酸序列与其他物种的相似性（%）
GPx4 牛 NM_174770 猪 NM_214407 人 BC010157 小鼠 BC106147 猴 NM_001118889 鸡 AF498316
核苷酸序列 95.7 87.2 85.3 84.2 83.7 69.8
氨基酸序列 99.0 93.4 91.8 95.9 - 76.3
运 用 Mega 4.0 软 件 对 NCBI 已 登 录 的 牛、 猪、
小鼠、人、猴、鸡和蜜蜂等物种 PHGPx 核苷酸序列
采用非加权组平均法（UPGMA）构建物种间分子系
统进化树，结果（图 12）所示，牛和羊首先聚在一
起，再与猪聚为一类，而后分别与鼠、人、猴、鸡、
金枪鱼、霉菌、稻、水螅和鲑鱼聚类，最后与蜜蜂
聚为一类。
3 讨论
RACE 技术是一种快速扩增 cDNA 全长的方法，
该技术方法简单，是目前获得 cDNA 全序列广泛应
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期110
用的技术。影响 RACE 及 RT-PCR 扩增结果的重要
因素包括高质量的 RNA 模板和特异性引物的设计
等，选用目的基因表达丰度高的组织提取总 RNA
是后续试验的必要保障。Lei 等［12］研究证实，睾
丸中的 PHGPx 活性和 mRNA 表达量分别是肝脏的
15 倍和 45 倍，因此本研究选用了高表达丰度的山
羊睾丸组织用于克隆试验，从而保证总 RNA 的质
量。以山羊总 RNA 为模板，通过对 GenBank 中已
登录的 PHGPx 序列进行同源性分析，RT-PCR 扩增
相互交叉的中间片段（引物 P1/P2 和 P3/P4），克隆
测序得到山羊 PHGPx 的部分序列，在此基础上结合
SMART RACE cDNA amplification kit 推荐的引物设计
要求及引物接头序列信息，设计特异性引物，成功
扩增出了山羊 PHGPx 基因 cDNA 的全长，具有完整
的 CDS 结构，GenBank 收录号为 GQ302986。
山 羊 长 844 bp 的 PHGPx cDNA 序 列， 共 编 码
199 个氨基酸。与其他物种比较发现，山羊氨基酸
序列与牛、猪、人和鼠高度同源。同时通过二级结
构分析和功能分析，分子量、等电点预测也可证明
克隆得到的序列为山羊 PHGPx 基因，属谷胱甘肽过
氧化物酶家族。预测 1-23 位氨基酸为信号肽位点，
分别在 23-24 位和 28-29 位氨基酸也可能存在潜在
切割位点，功能区结构域位于 44-155 位氨基酸，无
跨膜结构。与其他物种 BLAST 比对发现，牛在起始
第 2、4、5 位点缺失了异亮氨酸、精氨酸和色氨酸，
第 6 位点赖氨酸突变为苯丙氨酸，与猪编码的序列
1
0.5
0
1 11 21 31 41
51 61 71 81 91
101 111 121 131 141
151 161 171 181 191
prob.
ss
disorder
1
0.5
0
prob.
ss
disorder
1
0.5
0
prob.
ss
disorder
1
0.5
0
prob.
ss
disorder
Secondary Structure & Disorder prediction
H. α-螺旋 ；E. 延伸链 ；C. 无规则卷曲
图 5 山羊 PHGPx 二级结构元件组成
Name
signal peptide
Pfam: GSHPx
intrinsic disorder
Begin
1
44
183
End
23
150
199
E-value
-
6.60e-70
-
Pfam
GSHPx
1 100 200
图 6 结构功能域分析
1-23 位氨基酸为信号肽位点 ； 183-199 位氨基酸为本征无序态 ；
44-150 为 GSHPx 特征结构域
2012年第12期 111施力光等 ：山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶生物信息学分析
100
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
20 30 40 50 60 70
Sc
or
e
Position
S score
Y score
C score
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 10 20 30 40 50 60 70
Sc
or
e
Position
Cleavage prob.
n-reaion prob.
h-reaion prob.
o-reaion prob.
Y score 峰值大于阈值 0.5 表示 23、29 位氨基酸存在潜在信号肽切割位点
图 7 山羊 PHGPx 蛋白信号肽预测分析 NN-法 图 8 山羊 PHGPx 蛋白信号肽预测分析 HMM-法
28-29 位氨基酸存在潜在信号肽位点
1.2
0.8
0.6
0.4
0.2
0
20 40 60 80 100 120 140 160 180
1
pr
ob
ab
ili
ty
transmembrane inside
outside
图 10 山羊 PHGPx 蛋白三级结构
建模信息及预测模型图 9 山羊 PHGPx 蛋白跨膜区域分析
1 Goat
2 Cow
3 Pig
4 Human
5 mouse
6 Chicken
1 Goat
2 Cow
3 Pig
4 Human
5 mouse
6 Chicken
1 Goat
2 Cow
3 Pig
4 Human
5 mouse
6 Chicken
1 Goat
2 Cow
3 Pig
4 Human
5 mouse
6 Chicken
·. 相同氨基酸 ；-. 空缺
图 11 山羊 PHGPx 基因编码的氨基酸序列与其他物种比较
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期112
㵌㴲FJ895870
勁劬NM_001146603
にNM_001056680
⥤NM_001118889
⥚NM_214407
⢋NM_174770ኡ㖺CQ302986
ሿ啐BC106147
ӪBC010157
呑AF498316
䠁ᷚ劬EF452498
≤㶵DQ286041
䴹㧼DQ149729
0.05
57
95
95
98
97
97
96
100
100
100
相同 ；这些增加或突变位点多位于前体肽区，可能
由物种特异性决定，参与维持前体折叠和空间构
象，前体肽切除后蛋白才由失活状态变为活化状态，
这些位点变化对蛋白活性影响不明显［13，14］。在功
能区结构与发生氨基酸变异如 55 位 H → R、79 位
E → D 等多为同性氨基酸变化，可能造成活性中心
构象改变甚至空间构象变化，但是不影响正常发挥
相似的生物学功能［15］。山羊 PHGPx 氨基酸序列与
其他物种比对发现，与牛和猪的亲缘关系最近，与
人和鼠的次之，与鸡亲缘关系较远，这与 Hermesz
报道的结果相似［9］。
PHGPx 存在于线粒体中，通过硒代半胱氨酸活
性位点在体内发挥生物学功能［16］，山羊 PHGPx 基
因编码的氨基酸序列包含了线粒体前导序列和硒代
半胱氨酸编码的位点 ；在 3 非翻译区，还存在特异
性的硒代半胱氨酸插入序列（selenocysteine insertion
sequence，SECIS），确保翻译至 TGA 密码子时，识
别为硒代半胱氨酸（Sec）密码子继续转录而终止密
码子。在 Dash 和 Nam 等［8，17，18］ 报道的其他物种
cDNA 序列中，均有此特征序列。
国内目前对硒蛋白磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶
研究的报道较少，关于山羊 PHGPx 基因结构、序列
特点及硒对 PHGPx 的调控更为空白，山羊 PHGPx
基因与其他物种 PHPGx 基因 cDNA 序列的比对分析，
将为 PHGPx 表达分子调控研究奠定一定的基础。
4 结论
本研究利用 RACE 和 RT-PCR 方法了山羊睾丸
组织 PHGPx 基因 cDNA 序列（GenBank GQ302986），
运用生物信息学技术对序列详细分析，预测了二级
结构、空间结构及功能区域，通过与其他物种的同
源性及进化树分析，PHGPx 具有 GSH-Px 家族同源
基因的典型序列特征和关键结构域，分子系统进化
分析揭示了山羊与其他物种进化的一致性，同时也
符合动物学分类的结果。
参 考 文 献
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图 12 山羊 PHGPx 与其他物种进化关系
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（责任编辑 马鑫）