全 文 ：　第 29卷增刊 分析试验室 Vol.29.Suppl.
2010年 5月　 ChineseJournalofAnalysisLaboratory 2010-5
HPLC法测定熏倒牛中山羊豆碱的含量
王维恩 1＊ , 杨晓艳 2 , 张晓峰2
(1.青海师范大学化学系 ,西宁 810008;2.中国科学院西北高原生物研究所 ,西宁 810008)
摘　要:分析并比较了青海省九个不同产地的熏倒牛中山羊豆碱的含量 。采用
HPLC法 ,色谱柱为 ThermoC18(4.6mm×200mm, 5μm),流动相为甲醇 -0.5%磷
酸水溶液(50∶50),流速 1.0mL/min,柱温 40℃,在 205nm,进样量 20.0μL。发
现不同产地的熏倒牛中山羊豆碱的含量差别较大 ,同仁县样品含量最高 ,为 0.
365%;玛多县样品含量最低 ,为 0.113%。
关键词:熏倒牛;山羊豆碱;HPLC
　　熏倒牛 [ B.heterostemon]的藏名译音为明见赛
保-臭蚤草的代用品 ,民间又称臭花椒 、狼尾巴 。是
蔷薇纲牻牛儿苗亚纲熏倒牛科的植物 ,熏倒牛科
(Biebersteiniaceae)是一单型科 ,仅 1属即熏倒牛属
Biebersteinia,我国 3种 。熏倒牛 B.heterostemon为
甘 、宁 、青 、川西北(诺尔盖)特有 ,生于海拔 1000 -
3200 m的黄土山坡 、河滩地 、杂草坡地和公路两
旁 ,浓烈腥臭 [ 1] 。熏倒牛植物资源十分丰富 ,就青
海省内资源分布而言 ,以青南高原的河谷附近和东
部信风区的河湟流域分布较广 ,野生生物量相当可
观。由于其气味浓烈腥臭 ,牛羊不食 ,而其药用价
值又鲜为人知 ,该植物没有病害侵蚀的现象 ,显现
了较强的抗应激能力。其味辛 、苦 ,性寒 ,具有消炎
止痛 ,清热解毒 ,清血热 ,祛风毒的作用;用于治疗
各种炎症 、结核症 、丹毒 、疟疾 、咽喉肿痛 、胃痛 、全
身水肿 、中风 、虫蛇咬伤等症 [ 2] 。植化研究发现熏
倒牛植物干燥全草含多量鞣质和多糖 ,分离纯化得
到 β -谷甾醇 、伞形花内脂 、槲皮素 、hypolaetin7-O
-β-xylopyranoside(黄酮苷)、山羊豆碱 、反式 -4 -
羟基山羊豆碱 、甘露糖醇等生理活性物质 [ 3] 。国
外对山羊豆碱的研究较早 , [ 4, 5, 6]早在三十年代就
有山羊豆碱分离和相关活性研究 ,但国内外资料尚
缺乏 HPLC法测定山羊豆碱的文献 , 本实验用
HPLC法测定了熏倒牛中山羊豆碱的含量 ,该法简
便 、快速 、灵敏 、准确 ,可用于藏药熏倒牛药材及其
制剂中山羊豆碱的含量分析 。
1　仪器与试剂 　
Agilent1100高效液相色谱仪:Thermo C18(4.
6mm×200mm, 5μm)色谱柱 , Agilent1100 G1315A
二极管阵列检测器 , Agilent1100 G1311A四元泵 ,
Agilent1100配套化学工作站 。KQ-250DE超声波
清洗器 (昆山市超声仪器有限公司), METTLER
TOLEDOXS205电子天平 , TU-1901紫外可见分
光光度计 。
对照品山羊豆碱为分离鉴定后制备色谱纯化
得到。甲醇为色谱纯 ,其它试剂均为分析纯 ,水为
超纯水。山羊豆碱样品分别采自循化县 、化隆县 、
同仁县 、民和县 、湟源县 、大通县 、同德县 、玛沁县 、
玛多县 ,于 8月盛花期采集阴干备用 ,由西北高原
生物研究所张晓峰研究员鉴定为熏倒牛。
2　方法与结果　
2.1　色谱条件　
色谱柱:Thermo-C18(4.6mm×200mm, 5μm),
流动相:甲醇 -0.4%磷酸(50∶50),流速 1 mL/min,
柱温 25℃,检测波长 205nm,进样量 20μL。对照品
及样品在此色谱条件下的色谱图 ,见图 1 ～ 4。
2.2　样品溶液的制备　
将本品全草粉碎 ,过 60目筛 , 70 ℃烘干至恒
重 。精密称取 0.5 g,置于具塞三角瓶中 ,精密加入
甲醇 10mL,加塞后称重 ,超声处理 1 h,取出冷至室
温 ,称重 ,用甲醇补足减失的重量 ,摇匀 ,滤过 ,取滤
液以 0.45μm滤膜过滤 ,作为样品溶液。
2.3　对照品溶液的制备　
精密称取山羊豆碱对照品 4.45 mg,置 10mL
容量瓶中 ,加甲醇溶解并定容至刻度 ,摇匀 ,制成
0.445mg/mL的对照品溶液。
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DOI :10.13595/j.cnki .issn1000-0720.2010.0456
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2.4　标准曲线制备　
精密称取山羊豆碱对照品 11.15 mg, 置
50mL容量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇匀作为储
备液;精密吸取上述储备液 2, 4, 6, 8, 10mL,质量
浓度分别为 0.0446, 0.0892, 0.1338 , 0.1784 ,
0.2230mg/mL的对照品溶液 ,精密吸取上述溶液
各 10μL,按上述条件分别注入色谱仪测定 ,以进
样量对峰面积进行回归 , 得回归方程 Y=2E+
06X+41225 , r=0.999 9 ,山羊豆碱在 0.446 μg
～ 2.230μg的范围内线性关系良好。山羊豆碱对
照品和熏倒牛样品色谱图 (1号峰为山羊豆碱
峰)如图 1所示 。
2.5　精密度试验　
精密吸取 “2.3节”配制的对照品溶液 10μL,重复
进样 5次 ,按上述色谱条件操作 ,测峰面积 ,以峰面积
计算 RSD=0.46%,本方法精密度良好。
2.6　重现性试验　
分别精密称取 4号样品 0.5 g,按 “2.2节 ”样
品溶液的制备方法制备 6份供试液 ,按上述色谱条
件分别测定 ,测得峰面积 ,计算 RSD=0.63%,本方
法重现性良好 。
图 1　山羊豆碱及熏倒牛样品色谱图
2.7　回收率试验　
精密称取已测含量的 4号样品 6份 ,各 0.25 g,
分别精密加入山羊豆碱对照品 0.4788 mg,按 “2.2”
样品溶液的制备方法制备 ,按上述色谱条件测定 ,计
算加样回收率 ,结果平均回收率 99.10%, RSD=1.
64%,本方法回收率良好 ,见表 1。
表 1　回收率实验结果(n=6)
样品含量
m/mg
山羊豆碱添加量
m/mg
测出总含量
m/mg
回收率
/%
平均回收率
/%
RSD
/%
0.4495 0.4788 0.9208 98.43
0.4504 0.4788 0.9228 98.66
0.4516 0.4788 0.9232 98.50
0.4509 0.4788 0.9190 97.77
0.4495 0.4788 0.9395 102.34
0.4491 0.4788 0.9230 98.98
99.10 1.64
2.8　样品测定　
分别取不同地区熏倒牛样品按样品溶液制备
方法处理后在上述色谱条件下测定 ,以外标法计算
样品中山羊豆碱的含量 ,结果见表 2。
3　讨论　
3.1　提取方法及提取时间的选择　
分别将样品用不同浓度的甲醇 、乙醇超声 、回流
提取的方法 ,结果表明用甲醇超声提取含量高 ,而以
其它浓度的甲醇 、乙醇提取含量较低 ,且超声提取省
时 、方法简便 ,效果佳 ,故选择甲醇超声提取方法;考
表 2　样品含量测定结果
编号 产地 山羊豆碱含量 /% RSD/%
1 同仁县 0.365 1.41
2 循化县 0.312 1.47
3 化隆县 0.253 1.46
4 民和县 0.345 1.64
5 大通县 0.226 1.38
6 湟源县 0.291 1.41
7 同德县 0.213 1.52
8 玛沁县 0.178 1.51
9 玛多县 0.113 1.33
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察了 40 min与 60 min超声时间对样品提取结果的影
响 ,超声 40 min含量略偏低 ,故选择超声 60 min。
3.2　流动相的选择　
由于山羊豆碱极性较大 ,出峰时间太早导致与杂
质峰重叠 ,本文曾用甲醇-水(40∶60)、甲醇-水(20∶
80)、甲醇-水(10∶90),发现其效果均不理想。参照文
献 [ 7]并经实验摸索发现 ,升高甲醇在流动相的比例 ,
加入磷酸可以推迟山羊豆碱的出峰时间 ,并通过优化
柱温等色谱条件 ,可以使本品中的山羊豆碱的峰与其
它杂质峰达到良好地分离。
3.3　山羊豆碱检测结果及意义　
山羊豆碱含量测定显示出海拔较低 、气候温暖
湿润的青海东部地区含量较高 ,青南高原相对其含
量相对偏低 ,这与植物次生代谢产物积累时间相关。
山羊豆碱是熏倒牛中的主要活性成分之一 ,用 HPLC
法测定熏倒牛药材中山羊豆碱含量的报道尚未见。
本实验建立的熏倒牛药材中山羊豆碱的高效液相分
析法 ,可准确快速的测定山羊豆碱且与其它组分完
全分离 ,为熏倒牛质量标准研究提供了一个很好的
色谱参考条件。
参考文献
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