全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
作物病虫害每年给农业生产造成了惊人的损失，
而合理有效地使用杀虫农药是控制害虫的有效途径
之一。生物农药由于具有防治效果好、特异性强、
选择性高、开发利用途径多、不易产生抗性等特点，
已成为发展绿色农业的理想选择，也是中国农业可
持续发展和生态环境保护的重要途径［1］。微生物源
农药作为生物农药的主要来源，具有明显的生态效
益、经济效益和社会效益。因此，开发研究新微生
物源农药已成为当前农药研究的热点［2］。
本研究从广西玉林土壤中分离筛选出一株真菌
收稿日期 ：2014-02-12
基金项目 ：国家科技支撑计划课题（2011BAE06B04-03 ）
作者简介 ：何海波，男，硕士研究生，研究方向 ：应用微生物学 ；E-mail ：chinahehaibo@qq.com
通讯作者 ：谭红，女，研究员，研究方向 ：工业微生物学 ；E-mail ：abath@cib.ac.cn
钟娟，女，助理研究员，研究方向 ：工业微生物学 ；E-mail ：zhongjuan@cib.ac.cn
一株具有杀虫活性真菌的筛选及活性物质稳定性研究
何海波1，3 钟娟1，2，3 杨杰1，2 周金燕1，2 谭红1，2
（1. 中国科学院环境与应用微生物重点实验室，成都 610041 ；2. 四川省环境微生物重点实验室，成都 610041 ；
3. 中国科学院大学，北京 100049）
摘 要： 以卤虫为初筛指示虫，以蚜虫为复筛指示虫，从广西玉林土壤分离筛选出具有杀虫活性的菌株 YLZ42。根据培养特
征、形态特征及 18S rDNA、ITS 序列分析，菌株 YLZ42 被鉴定为淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）。生物测定结果表明，
YLZ42 发酵液的乙酸乙酯萃取物对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾具有明显的毒杀活性，其校正死亡率在 78.9% 以上。YLZ42 发酵液
稳定性研究表明，其活性成分在 100℃处理 60 min，pH1-11 条件下仍具有较强的杀虫活性。
关键词 ： 真菌 卤虫 杀虫活性 淡色生赤壳菌
Screening of a Fungus with Insecticidal Activity and Measure of the
Stability of Its Bioactive Compound
He Haibo1，3 Zhong Juan1，2，3 Yang Jie1，2 Zhou Jinyan1，2 Tan Hong1，2
（1. Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology，Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041 ；
2. Environmental Microbiology Key Laboratory of Sichuan Province，Chengdu 610041 ；
3. University of Chinese Academy of Science，Beijing 100049）
Abstract: Using Brine Shrimp as primary screening assay and Aphid as second screening assay, the YLZ42 strain with insecticidal
activity were isolated and screened from the soil in Yulin, Guangxi Province. According to the culture features, morphological characteristics, 18S
rDNA and ITS sequence analysis, YLZ42 was identified as Bionectria ochroleuca. The ethyl acetate extract of YLZ42 fermentation broth have
insecticidal activity to Plutella xylostella, Helicoverpa armigera and Laphygma exiguat. Results of bioassay showed that the corrected mortalities
rate were more than 78.9%. The fermentation broth have high insecticidal activity under 100℃ for 60 min or pH1-11.
Key words: Fungus Brine Shrimp Insecticidal activity Bionectria ochroleuca
菌株 YLZ42，通过形态特征，18S rDNA、ITS 序列
测定和系统发育分析对其进行鉴定。同时，为研究
该菌株是否具有潜在杀虫利用价值和田间应用前景，
测定其发酵液乙酸乙酯萃取物对小菜蛾、棉铃虫、
甜菜夜蛾的杀虫活性，并对 YLZ42 发酵液活性物质
稳定性进行初步研究，旨在为菌株 YLZ42 的进一步
研究和应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集 于 2012 年 9 月从广西玉林等采集
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期110
土壤样品 17 份，自然风干，备用。
1.1.2 供试虫 卤虫卵 ：购于成都益友水族，人工
海水孵化 ；蚜虫 ：由四川省农科院植保所提供 ；小
菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾 ：购于河南济源白云实业
公司，由其提供的饲料孵化。
1.1.3 主要培养基 分离真菌培养基 ：孟加拉红培
养基（购于北京奥博星生物技术有限责任公司）；真
菌培养基 ：PDA 培养基 ；发酵培养基 ：葡萄糖 1%，
可溶性淀粉 1%，花生饼粉 0.2%，黄豆饼粉 0.2%，
蛋白胨 0.1%，KH2PO4 0.08%，pH7.0 ；大肠杆菌培
养基 ：LB 培养基。
1.1.4 主要试剂 DNA Marker、2 TransStartTM FastPfu
PCR SuperMix、pEASY-blunt 载体、E.coli Trans-T1 感
受态细胞均购于北京全式金生物技术有限公司 ；真
菌基因组 DNA 提取试剂盒，18S rDNA、ITS 通用引
物由上海生工生物工程技术服务有限公司提供 ；其
他常规试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离 将土壤样品制成菌悬液，进行梯
度稀释后涂布在孟加拉红培养基平板上，26℃恒温
培养。待长出菌落后，适时挑取形态、颜色不同的
单菌落，在 PDA 培养基平板反复划线培养，直至获
得菌落形态一致的纯菌株，作为待测菌株，4℃保藏，
备用。
1.2.2 杀虫活性菌株的筛选
1.2.2.1 样品制备 挑取待测菌株，接种于发酵培
养基中，置于 26℃、180 r/min 摇床连续振荡培养 5
d，过滤除去菌体，收集滤液。取 40 mL 滤液用等体
积乙酸乙酯萃取两次，35℃减压浓缩后得浸膏，用
1 mL 二甲基亚矾（DMSO）溶解（发酵液 /DMSO ：
40/1），再加入 19 mL 体积的无菌水，充分混匀后得
到 A 类样品，备用。另取 10 mL 滤液，作为 B 类样品，
备用。
1.2.2.2 初筛 参考 Solis 的方法［3］，取 A 类和 B 类
样品各 100 μL，分别置于 96 孔板的微孔中，再加入
200 μL 的卤虫培养液（约 15-35 只卤虫），每个样品
3 个重复。同时，以蒸馏水及相同浓度的 DMSO 做空白
对照。28℃放置 24 h 后，用双目解剖镜观察，记录
卤虫死亡数。在统计总数时，向孔板中滴入 1 滴浓
度为 40% 的盐酸处死所有的卤虫，计算校正致死率。
校正致死率（%）＝（X-CK）/（1-CK）×100%
其中，X 为样品孔致死率，CK 为对照孔的致
死率。
1.2.2.3 复筛 采用喷雾法，从田间采取菊科植物
上沾有大量蚜虫的叶片，将其放置于铺有滤纸的培
养皿中，将 A 类样品喷雾于叶片上，重复 3 次，室
温（15℃-25℃）培养 24 h 后进行观察，计算校正
死亡率。
1.2.3 活性菌株的鉴定
1.2.3.1 培养特征和形态特征 将菌株接种到 PDA
培养基 26℃倒置培养 3-10 d，观察菌株的气生菌丝、
基内菌丝、孢子颜色等特征。将菌株接种于 PDA 培
养基上，26℃插片培养，分别于 3、5 和 7 d 取出玻片，
通过光学显微镜观察菌株的形态特征。
1.2.3.2 18S rDNA、ITS 序 列 测 定 和 系 统 发 育 分
析 采用真菌基因组 DNA 提取试剂盒提取菌株基因
组 DNA，作为 PCR 扩增的模板，序列扩增采用真菌
通用引物对 ：18S rDNA 引物（NS1 ：5-GTAGTCAT-
ATGCTTGTCTC-3 ；NS8 ：5-TCCGCAGGTTCACCTA-
CGGA-3），ITS 引 物（ITS1 ：5-TCCGTAGGTGAAC-
CTGCGC-3 ；ITS4 ：5-TCCTCCGCTTATTGATATG-
C-3）。PCR 反应体系为 50 μL ：基因组 DNA 1 μL，
正 向 引 物 1 μL， 反 向 引 物 1 μL，SuperMix 25 μL，
ddH2O 22 μL。PCR 反应条件为 ：94℃预变性 5 min ；
94℃变性 20 s，55℃退火 20 s，72℃延伸 40 s，共
35 个循环 ；72℃终延伸 5 min。扩增产物用 1% 琼
脂糖凝胶电泳检测后割胶回收纯化，回收产物连接
pEASY-blunt 载 体 并 转 化 至 E.coli Trans-T1 感 受 态
细胞，PCR 验证阳性克隆子后，交由华大基因科技
有限公司测序。测序数据经过拼接后，通过 NCBI
网站在线 BLAST 比对分析，调取相关序列。序列
经 CLUSTAL X（1.8） 比 对 分 析 后， 用 MEGA5 软
件 以 邻 接 法（Neighbor-Joining） 构 建 系 统 进 化 树，
Bootstrap 设置为 1 000 次重复。
1.2.4 生物测定 将菌株发酵液滤液用等体积乙酸
乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，减压蒸馏浓缩 30
倍后，与人工饲料混拌均匀，通风厨中蒸发干燥 2 h
后，分装于 24 孔板微孔中，再分别加入小菜蛾、棉
铃虫、甜菜夜蛾 3 龄幼虫，每个孔一头，每种昆虫
2014年第9期 111何海波等：一株具有杀虫活性真菌的筛选及活性物质稳定性研究
重复 20 孔，于 26℃、相对湿度 60%-70% 的条件下，
避光培养，48 h 后观察、记录昆虫状态和死亡情况。
1.2.5 发酵液活性物质稳定性研究 以卤虫为指示
虫，按照 1.2.2.2 的方法测定发酵液在不同条件下处
理后的杀虫活性，根据校正死亡率的改变确定其稳
定性［4］。
1.2.5.1 对紫外线和蛋白酶 K 稳定性的测定 取少
量 YLZ42 发酵液滤液，在 25 W 紫外灯下（距离约
10 cm）照射 3 h，以未处理发酵液滤液为对照测定
其杀虫活性，重复 3 次 ；YLZ42 发酵液滤液中加入
蛋白酶 K，使其终浓度为 100 μg/mL，以未处理发
酵液滤液为对照，37℃水浴 3 h 后测定其杀虫活性，
重复 3 次。
1.2.5.2 热稳定性分析 将待测发酵滤液分别置于
室 温（25℃） 及 40℃、60℃、80℃、100℃ 四 个 温
度水浴 30 min 和 60 min，降至室温后，以卤虫为试
虫测定杀虫活性，计算校正死亡率。
1.2.5.3 酸碱稳定性试验 分别用 1 mol/L 的 HCl 或
1 mol/L 的 NaOH 调节 pH，分别调到 pH 为 1、3、5、7、9、
11 和 13，然后将各 pH 调回 7 左右，测定杀虫活性，
计算校正死亡率。
2 结果
2.1 菌株分离与杀虫活性筛选
从土样中分离出 165 株真菌。杀虫活性初筛
结果（表 1）表明，发酵产物对卤虫校正死亡率在
60%-100% 的菌株有 6 株，占初筛菌株总数的 40%，
其中 YLZ42 的发酵液滤液及乙酸乙酯萃取物对卤虫
的校正致死率均为 100%。
表 1 杀虫活性初筛部分结果
处理
发酵液滤液 乙酸乙酯萃取物
死虫数 / 总虫数 死亡率（%） 校正死亡率（%） 死虫数 / 总虫数 死亡率（%） 校正死亡率（%）
YLZ6 43/63 68.3 63.2 87/87 100.0 100.0
YLZ13 82/83 98.8 98.6 87/87 100.0 100.0
YLZ42 75/75 100.0 100.0 80/80 100.0 100.0
SLZ14 85/85 100.0 100.0 89/89 100.0 100.0
SLZ46 86/86 100.0 100.0 86/86 100.0 100.0
SLZ62 81/81 100.0 100.0 96/96 100.0 100.0
选取初筛杀虫效果最好的 4 株菌株，进行复筛，
结果（表 2）表明，有 3 株菌株发酵产物对蚜虫的
校正死亡率在 80% 以上，其中 YLZ42 对蚜虫的致死
率 91.4%，校正死亡率为 90.1%。
表 2 杀虫活性复筛部分结果
处理 平均头数 平均死虫数 死亡率（%） 校正死亡率（%）
SLZ14 33 31 94.5 93.9
SLZ46 55 49 85.3 83.6
YLZ42 57 51 91.4 90.1
2.2 菌株YLZ42的鉴定
2.2.1 培养特征和形态特征 菌株在 PDA 培养基上
26℃培养 3-10 d，其菌丝生长较缓慢，菌落圆形，
具轮纹，白色至灰白色，气生菌丝不发达，边缘呈
轮纹状向外扩散，平板背面产生淡黄褐色色素 ；菌
丝具隔，分生孢子呈椭圆形、淡色，分生孢子梗为
帚状分枝（图 1）。与 Rossman［5］，张向民等［6］对
生赤壳科（Bionectriaceae）真菌的描述一致。
图 1 菌株 YLZ42 培养特征及在显微镜下的形态（400×）
2.2.2 18S rDNA、ITS 序列测定和系统发育分析 测
序所得序列经校对后提交 GenBank，并在 NCBI 上进
行 Blast 比较分析。菌株 YLZ42 的 ITS 序列长度为
570 bp，登录号为 KJ145326，与 Bionectria ochroleuca
（EU273558） 序 列 相 似 度 为 99% ；18S rDNA 长 度
为 1 767 bp， 登 录 号 为 KJ145325， 与 Bionectria
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期112
ochroleuca（GU112755）序列相似度为 99%。以 18S
rDNA 和 ITS 序列为基础，根据序列同源性从高到低
的顺序选取有效菌株序列，经 CLUSTAL X（1.8）比
对分析后，利用 Mega5.0 软件构建系统发育树（图
2）。从构建的系统发育树可以看出，菌株 YLZ-42 与
Bionectria ochroleuca 处于同一分支，亲缘关系最近。
Nectriopsis violacea AY489687
99
68
90
Fusarium oxysporum AB110910
Chamaeleomyces granulomatis HM635076
Myrothecium roridum FJ231214
Nectria cinnabarina AB003949
Bionectria pityrodes AY489696
Bionectria ochroleuca GU112755
YLZ42
A
YLZ42
94
100
72 Clonostachys pseudochroleuca KC806264
Gliocladium roseum AJ309334
Clonostachys rhizophaga KC806275
Clonostachys byssicola KC806268
Fusarium oxysporum DQ889176
Bionectria compactiuscula AF210690
Bionectria ochroleuca EU273558 B
图 2 基于 18S rDNA（A）和 ITS（B）的菌株 YLZ42 与相关菌株的系统发育树（Neighbor-Joining）
2.3 生物测定
菌株 YLZ42 发酵液的乙酸乙酯萃取物对 3 种
供试虫有明显的毒杀效果，其中，对棉铃虫的毒杀
效果最好，校正死亡率达 100%，对小菜蛾及甜菜
夜蛾的毒杀效果次之，校正死亡率分别为 84.2% 与
78.9%，结果如表 3 所示。
表 3 YZ-42 生物测定结果
菌株 死亡率（%） 校正致死率（%）
小菜蛾 85.0 84.2
棉铃虫 100.0 100.0
甜菜夜蛾 80.0 78.9
2.4 发酵液活性成分的稳定性研究
2.4.1 对紫外线和蛋白酶 K 的稳定性 YLZ42 发酵
液滤液分别经紫外线照射 3 h 和蛋白酶 K 处理 3 h 后，
其杀虫活性不变（校正死亡率为 100%），说明杀虫
活性物质对紫外线和蛋白酶 K 不敏感。
2.4.2 热 稳 定 性 YLZ42 发 酵 液 在 40℃、60℃ 和
80℃三个温度水浴处理 30 min 和 60 min 后，杀虫活
性几乎不变。而在 100℃水浴处理 60 min 后，略有
降低（图 3），表明 YLZ42 发酵液杀虫活性在 40℃-
100℃内基本稳定。
2.4.3 pH 稳定性 YLZ42 发酵液在 pH1-11 条件下
校正死亡率几乎没有变化，表明其杀虫活性物质在
pH1-11 条件下稳定，当 pH 为 13 时，YLZ42 发酵
液杀虫活性消失（图 4）。
0
20
40
60
80
100 ᇔ 40 60 80 100 30 min60 minṑ↓↫ӑ⦷ % ༴⨶ᓖ ć
图 3 发酵液的热稳定性
0
20
40
60
80
100
1 3 5 7 9 11 13
pH
ṑ↓↫ӑ⦷ %
图 4 发酵液的 pH 稳定性
2014年第9期 113何海波等：一株具有杀虫活性真菌的筛选及活性物质稳定性研究
3 讨论
随着人们环保意识的提高，对无公害农产品的
需求越来越高。由于微生物源农药具有明显的生态
效益、经济效益和社会效益，开发研究新微生物源
农药已成为当前农药研究的热点［7］。本研究在进行
杀虫活性筛选时，选用了卤虫作为初筛指示虫，主
要是考虑到卤虫模型具有检测快速、操作简单、廉
价等特点和优势［8］，适于杀虫活性物质的高通量筛
选。钟佳等［9，10］就曾以卤虫为靶标，对海洋放线菌、
植物内生菌代谢物的杀虫活性进行了筛选。除此之
外，在应用该方法进行杀虫活性快速筛选时，同时
测定了菌株的发酵液滤液及其乙酸乙酯萃取物的杀
虫活性，这样做既能够保证测量结果的准确性，又
为进一步分离纯化杀虫活性物质提供了依据。
生 赤 壳 属（Bionectria） 是 1999 年 由 Rossman
等［5］根据形态学及分子生物学特征，从丛赤壳科菌
种独立出来而建立的一个新属，被归类为生赤壳科
（Bionectriaceae），肉座菌目（Hypocreales）。由于是
新定义的一个属，所以国内外对其研究相对较少。
目前，国内研究报道主要集中于淡色生赤壳菌对植
物病原菌的防治，如陆铮铮等［11］报道了淡色生赤
壳菌对烟草青枯菌的拮抗作用，余艳等［12］报道了
淡色生赤壳菌的抗菌和杀细胞作用，但鲜有人对其
杀虫活性进行过研究和报道。通过卤虫模型，本研
究分离筛选出一株具有杀虫活性的淡色生赤壳菌
（Bionectria ochroleuca）YLZ42。生物测定表明该菌
株发酵液的乙酸乙酯萃取物对小菜蛾、棉铃虫、甜
菜夜蛾有较好的毒杀效果，具有潜在的杀虫利用价
值和田间应用前景。同时，利用卤虫为指示虫，对
YLZ42 发酵液稳定性进行了初步研究，丰富了淡色
生赤壳菌的研究内容，也为后续研究中对杀虫活性
物质的功能研究和结构解析等提供了参考。
4 结论
通过卤虫筛选模型，筛选了一批具有杀虫活性
的真菌菌株。其中 YLZ42 的代谢物对卤虫的校正致
死率为 100%，对蚜虫校正死亡率为 90.1%。通过培
养特征、形态特征以及 18S rDNA、ITS 序列系统发
育分析，鉴定菌株 YLZ42 为淡色生赤壳菌（Bionectria
ochroleuca）。YLZ42 发酵液乙酸乙酯萃取物对小菜
蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾具有明显的毒杀活性，其校
正死亡率在 78.9% 以上。YLZ42 发酵液的稳定性分
析表明活性成分在 100℃处理 60 min，pH1-11 条件
下仍具有较强的杀虫活性。
参 考 文 献
［1］贺伟华 , 黄长干 . 生物农药对我国农业发展的影响及对策分
析［J］. 农业考古 , 2007, 6 ：315-317.
［2］施跃峰 . 微生物杀虫剂研究进展［J］. 植物保护 , 2000, 5 ：32-
34.
［3］Solis PN, Wright CW, Anderson MM. A microwell cytotoxicity assay
using Artemia salina（brine shrimP）［J］. Plant Med, 1993, 59（3）：
250-253
［4］李涛 , 覃拥灵 , 陈桂光 , 等 . 一株杀虫抗生素产生菌的筛选、鉴
定及活性物质稳定性研究［J］. 中国生物工程杂志 , 2007, 4 ：
54-58.
［5］Rossman AY, Samuels GJ, Rogerson CT, et al. Genera of
Bionectriaceae, Hypocreaceae and Nectriaceae（Hypocreales,
Ascomycetes）［J］. Stud Mycol, 1999, 42 ：1-248.
［6］张向民 , 庄文颖 . 生赤壳科和丛赤壳科的中国新记录种［J］.
菌物系统 , 2003, 4 ：525-530.
［7］施跃峰 . 微生物杀虫剂研究进展［J］. 植物保护 , 2000, 5 ：32-
34.
［8］Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, et al. Brine shrimp ：a
convenient general bioassay for active plant constituents［J］.
Planta Medica, 1982, 45 ：31-34.
［9］钟佳 , 李敏湘 , 王兴红 , 等 . 两种八角莲内生真菌的生物活性研
究［J］. 天然产物研究与开发 , 2006, 4 ：535-540.
［10］肖永堂 , 郑忠辉 , 黄耀坚 , 等 . 海洋真菌杀虫活性的初步研
究［J］. 厦门大学学报 ：自然科学版 , 2005, 6 ：113-116.
［11］陆铮铮 , 杨先权 , 彭杰 , 等 . 烟草青枯菌土壤拮抗真菌的筛选
及鉴定［J］. 贵州农业科学 , 2012, 1 ：86-89, 175.
［12］余艳 . 南方红豆杉新内生真菌 Bionectria sp. 的分离、鉴定及
代谢物活性分析［D］. 重庆 ：西南大学 , 2007.
（责任编辑 马鑫）