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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
收稿日期 : 2012-03-26
作者简介 : 武艺 , 女 , 本科 , 研究方向 : 重组蛋白表达 ; E-mail: ywu@chempartner.cn
通讯作者 : 方成 , 男 , 硕士 , 研究方向 : 重组蛋白表达 ; E-mail: chfang@chempartner.cn
BacMam 表达系统是对传统杆状病毒表达系统
的改良，20 世纪 90 年代，有研究者发现在昆虫细
胞表达载体中加入哺乳动物细胞表达框后，可通过
杆状病毒转导哺乳动物细胞实现基因的导入与表
达［1］。之后，对于不同类型的细胞和蛋白，均出现
了利用这一方法的研究。改良后的该方法既可采用
瞬时表达，适合毒性蛋白的生产，简便快捷，同时
也能通过筛选获得稳定表达的细胞系［2］。
成纤维细胞生长因子受体 1（fibroblast growth
factor receptor 1，FGFR1）是 4 大 FGF 受体之一，属
人 FGFR1的 BacMam系统构建、表达、纯化与鉴定
武艺1，2 罗志勇2 陈艳霞2 孟俊炜2 方成2
（1 同济大学生命科学与技术学院，上海 200092 ；2 上海睿智化学研究有限公司，上海 201203）
摘 要： 目前激酶类蛋白的表达大多由昆虫细胞表达系统实现，采用 BacMam系统来表达受体型酪氨酸激酶人 FGFR1，
旨在获得更接近天然结构与功能的重组蛋白。首先，将 pDEST20载体的多角体蛋白启动子替换成 CMV enhancer启动子，获得
BacMam表达载体 pDEST20-CMVe。通过 Gateway系统，将 FGFR1具有酪氨酸激酶活性的区域克隆至改造后的载体中。利用昆虫
细胞 Sf9产生病毒，P2代病毒转导哺乳动物细胞 FreeStyle 293-F进行表达，经亲和纯化后，成功获得了 75 kD的融合蛋白。通过
磷酸化底物的反应检测此 FGFR1激酶的活性。结果表明，BacMam系统是一个良好的表达重组激酶 FGFR1的平台，并且所表达的
激酶活性高于昆虫细胞表达的激酶蛋白。
关键词： BacMam 载体构建 蛋白表达 激酶活性
Construction，Expression，Purification and Characterization of
Human FGFR1 Using BacMam System
Wu Yi1，2 Luo Zhiyong2 Chen Yanxia2 Meng Junwei2 Fang Cheng2
（1School of Life Science and Technology，Tongji University，Shanghai 200092；2Shanghai ChemPartner Co.，Ltd.，Shanghai 201203）
Abstract: The baculovirus expression system is one of the most popular methods for kinase proteins. Due to the fact that insect cells are
not natural hosts for mammalian proteins, we used BacMam system to express the human FGFR1 for high yield and activity. After replacing PH
promoter with CMV enhancer promoter on pDEST20 vector, the BacMam expression vector pDEST20-CMVe was constructed successfully. Then
the intracellular region of FGFR1 as Tyr kinase was inserted under the control of CMV enhancer promoter by Gateway method. The FreeStyle
293-F cells were transduced with the BacMam viruses produced by Sf9 cells, and the recombinant protein expression was identified. Finally, the
75 kD fusion protein GST-FGFR1 was obtained after affinity purification. The result of phosphorylation reaction show that the activity of FGFR1
which expressed by BacMam system is higher than insect cell expression system.
Key words: BacMam Vector construction Protein expression Kinase activity
于糖蛋白，由 3 部分组成 ：结构类似 Ig 的胞外域、
疏水性很强的跨膜域、含酪氨酸激酶活性的胞内域。
FGFR1 在不同细胞中表达相当普遍，序列在进化过
程中高度保守。当FGF与其结合后，受体形成二聚体，
自身磷酸化，继而激活下游的信号传递。FGFR1 与
许多疾病的发生发展相关，如前列腺癌［3］、乳腺
癌［4］、膀胱癌［5］、Pfeiffer 综合征、骨髓增殖综合症
（EMS）、胰腺癌及星细胞瘤等［6］。它所介导的信号
通路在体内发挥多种生物学效应，因此也成为许多
药物筛选的重要靶标［7］。目前商业化生产的 FGFR1
2012年第10期 115武艺等 ：人 FGFR1 的 BacMam 系统构建、表达、纯化与鉴定
均为传统的昆虫细胞表达，也有研究采用经典的哺
乳动物细胞表达方法［8］。本研究拟构建 BacMam 表
达载体，并对人 FGFR1 具有酪氨酸激酶活性的胞内
域进行重组表达与纯化，比较其与普通昆虫细胞表
达的 FGFR1 的活性差异，旨在为基于 FGFR1 的新
药筛选等相关研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒 pTT 和 ccdB survival 菌株为本室自存 ；质
粒 pENTR/D-TOPO、质粒 pDEST20、DH10Bac 感受
态、Sf9 昆虫细胞和 FreeStyle 293-F 细胞为 Invitrogen
公司产品 ；pCMV6-XL5-FGFR1 购自 OriGene 公司 ；
TOP10 感受态细胞购自 TIANGEN 公司。
AccuPrime Pfx DNA Polymerase 和 Gateway LR
ClonaseⅡ Enzyme Mix 购于 Invitrogen 公司；In-Fusion
HD Cloning Kit 购于 Clontech 公司 ；IPTG、Bluo-Gal、
Sf-900Ⅱ SFM、Grace’s Insect Medium、CellfectinⅡ
Reagent、FreeStyle 293 Expression Medium、iBlot
Tran-sfer Stack PVDF Regular，DAB Kit 均为 Invit-rogen
产品；GSTrap FF Column购自GE Healthcare ；GST-Tag
Mouse mAb 和 Goat Anti-Mouse IgG-HRP 购 于 Abm-
art 公司 ； FL-Peptide22 （5-FAM-EEPLYWS-FPAKKK-
CONH2） 购于 Caliper 公司。
1.2 材料
1.2.1 重组质粒 pDEST20-CMVe/FGFR1 的构建 设
计正向引物 5-CCGGAATATTAATAGGTTGACATTGA
TTATTGACTAG-3和反向引物 5-TAGGGGCCATGG
ATCGCCCAAACTTGGACCTGG-3扩增 CMV enhancer
启动子，以 pTT 为模板进行 PCR 反应。设计正向引
物 5-GATCCATGGCCCCTATACTAGG-3和反向引物
5-CTATTAATATTCCGGAGTATACGTAGCC-3，以pD-
EST20 为模板，扩增除去 PH 启动子后的载体部
分。将两部分片段进行 In-Fusion 反应后转化 ccdB
survival 感受态，获得以 CMV enhancer 替代 PH 启动
子的 pDEST20-CMVe 载体。
根据已知的 FGFR1 基因序列信息，设计引物扩
增 FGFR1 胞内具有酪氨酸激酶活性的部分，其中正
向 为 5-CACCATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAG-3，
反向为 5-TCAGCGGCGTTTGAGTCCGCCATTG-3，以
pCMV6-XL5-FGFR1 为模板进行 PCR 反应，纯化
1 276 bp的FGFR1片段。按照Invitrogen提供的方法，
与 pENTR/D-TOPO 进行 TOPO 克隆反应，再通过
LR 重组，将 FGFR1 导入 pDEST20-CMVe 载体，转
化 TOP10 感受态，获得 pDEST20-CMVe/FGFR1。对
照质粒则在 TOPO 克隆完成后，将供体质粒 pENTR/
FGFR1 与未经改造的 pDEST20 进行 LR 反应，得到
传统昆虫细胞表达质粒 pDEST20/FGFR1。
1.2.2 细胞培养及蛋白表达 根据 Invitrogen Bac-
to-Bac 系统的产品说明，将构建好的质粒 pDEST20-
CMVe/FGFR1 及对照 pDEST20/FGFR1 转化感受态细
胞 DH10Bac 抽提 Bacmid。分别用 2 μg Bacmid DNA
转染 8×105 个处于对数生长期的 Sf9 细胞，27℃避
光培养 4 d，收集 P1 代杆状病毒。1 100（V/V）接
种 50 mL 处于对数生长期的 Sf9 细胞，于 27℃摇床
中以 120 r/min 的转速避光培养 4 d，收获 P2 代病毒。
对照组用 P2 代病毒 1 100（V/V）感染 2×106/mL
的 Sf9 细胞 100 mL，BacMam 系统则用其 P2 代病毒
以同样比例感染相同密度相同体积的 293-F 细胞并
加入终浓度为 5 mmol/L 的丁酸钠，分别在 27℃和
37℃条件下，以 120 r/min 的转速振荡培养 2 d 后收
集细胞。
1.2.3 蛋白 FGFR1 的纯化 上述分别得到的细胞超
声破碎后用GSTrap FF进行亲和纯化，主要试剂包括：
裂解缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，2
mmol/L EDTA，0.1% Triton X-100，1 mmol/L DTT，0.1
mmol/L PMSF，Protease inhibitor cocktail，pH7.5）、 结
合与洗涤缓冲液（PBS，140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L
KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，
pH7.3）、洗脱液（50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，
10 mmol/L glutathione，10% glycerol，pH8.0）。分管
收集洗脱液体，SDS-PAGE 和 Western blotting 分析
蛋白的表达和纯化情况。其中所用一抗为小鼠 GST-
Tag 单克隆抗体，二抗为 HRP 标记的羊抗鼠多克隆
抗体。
1.2.4 FGFR1 的活性鉴定 检测不同方式获得的
FGFR1 酶在相同时间内磷酸化底物的能力，反应条
件为：50 mmol/L HEPES、0.015% Brij-35、10 mmol/L
MgCl2、2 mmol/L DTT，底物 FL-Peptide 22 浓度为 1.5
μmol/L，ATP 浓度为 0.5 mmol/L，FGFR1 酶均设置
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期116
成两倍浓度梯度 （50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、
0.78 和 0.39 nmol/L），每浓度 3 个重复，28℃反应 1 h，
LabChip EZ Reader 读取转化率。GraphPad Prism 5 进
行方差分析，组间比较采用 2way ANOVA。
2 结果
2.1 FGFR1的BacMam载体构建
分 别 以 pTT 和 pDEST20 为 模 板， 成 功 扩 增
出约 1.1 kb 的 CMV enhancer 启动子和约 6.9 kb 的
pDEST20（图 1），其中 pDEST20 去除了 PH 启动子，
通过 In-Fusion 将 CMV enhancer 插入 pDEST20 上原
有 PH 启动子的位置，得到 BacMam 载体 pDEST20-
CMVe。将 FGFR1 胞内具有酪氨酸激酶活性的片段
约 1.3 kb（图 2）扩增后插入 pENTR/D-TOPO，通
过 LR 反应及测序确认，成功得到最终的重组表达
质粒 pDEST20-CMVe/FGFR1 和对照质粒 pDEST20/
FGFR1。
2.2 FGFR1的表达和纯化
在 P2 代杆状病毒感染细胞 2 d 后，收集全部
100 mL FreeStyle 293-F 细胞和 100 mL Sf9 细胞，根
据蛋白所携带的 GST 标签进行亲和纯化（图 3），得
到了 1.8 mg 约 75 kD 的 GST 融合 FGFR1 蛋白，并
经 Western blotting 验证（图 4），BacMam 系统表达
的样品在 75 kD 处出现特异杂交条带。传统昆虫细
胞系统表达 FGFR1 的情况也基本一致，同样经亲和
纯化后得到了 1.6 mg 的 GST-FGFR1。
图 1 CMV enhancer与 pDEST20删除 PH启动子的
PCR电泳结果
M. DNA Marker ；1. pDEST20 去除 PH 启动子后的 PCR 片段 ；
2. CMV enhancer 启动子 PCR 产物
图 2 FGFR1胞内域的 PCR电泳结果
M. DNA Marker ；1. FGFR1 胞内具有酪氨酸激酶活性部分的 PCR 产物
M. 预染蛋白 Marker ；1. 细胞阴性对照 ；2. 胞内可溶总蛋白 ；
3. 流穿蛋白 ；4. 洗脱蛋白
图 4 重组人 FGFR1蛋白的Western blotting分析
图 3 人 FGFR1蛋白纯化结果的鉴定
M. 蛋白 Marker ；1. 纯化前细胞内可溶总蛋白 ；2. 流穿蛋白 ；3. 洗脱蛋白
2.3 FGFR1激酶活性鉴定
对纯化得到的 FGFR1 蛋白进行酪氨酸激酶活
性测定，结果表明不同浓度的 FGFR1 在 ATP 存在
的条件下，能使底物 FL-Peptide22 发生磷酸化反
应，在一定酶浓度范围内磷酸化程度呈剂量效应。
BacMam 系统表达的样品与对照相比，底物磷酸化
程度相同时，所用酶的浓度更低 （图 5）。经 t检
验，在 FGFR1 浓度为 0.78 nmol/L 和 50 nmol/L 时，
P<0.05，浓度为 0.39、3.13、6.25、12.5 和 25 nmol/L
时，P<0.01，再采用 2way ANOVA 分析比较两种来
2012年第10期 117武艺等 ：人 FGFR1 的 BacMam 系统构建、表达、纯化与鉴定
源的 FGFR1 酶活性，P=0.0002，差异有统计学意义。 度升高而增加。如果需要大量高效表达，除了 MOI
的值有待摸索外，不同的 BacMam 表达载体、病毒
转导的细胞种类、转导方法、添加物 （如丁酸盐、
EDTA、曲古霉素 A 等） 的用法等，都可以根据目的
蛋白的不同情况进一步优化。
BacMam 有广泛的转导细胞谱，除了常用的
CHO、HEK293、HeLa、COS 等哺乳动物细胞外，
甚至还包括原代细胞和干细胞，大大增加了其在生
物学研究中的应用。目前，已有许多种类的蛋白利
用 BacMam 系统实现了高表达，包括膜蛋白［10］、分
泌蛋白［11］、离子通道［12］、核受体［13］、溶酶体蛋白［14］
等。尤其对于 GPCR 蛋白的表达，已有相当多的研
究，大大推动了以 GPCR 类蛋白为靶标的新药筛选
和全细胞 GPCR 功能研究的发展。此外，BacMam
系统还可以应用在多种蛋白共表达、抗体或疫苗的
制备［15］、RNA 干扰［16］、系统生物学和功能基因组
学等领域，是一种强大的生物学研究工具。
杆状病毒作为 DNA 导入哺乳动物细胞的载体工
具仍旧刚刚起步，很多机理还有待进一步研究，比
如对病毒转导具体机制的理解，如何利用病毒细胞
相互作用来提高基因的导入效率等。如果应用到工
业生产中，对于可重复功能验证、建立标准化过程
还需要更多共享的数据和经验。
4 结论
本研究构建了 BacMam 表达载体 pDEST20-CM-
Ve，并对人 FGFR1 的酪氨酸激酶部分成功进行了表
达与纯化。与传统昆虫细胞表达的 GST/FGFR1 相
比，来源于哺乳动物细胞 FreeStyle 293-F 的融合蛋
白 GST/FGFR1 表现出更高的激酶活性。
参 考 文 献
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图 5 不同来源的 FGFR1激酶活性比较
3 讨论
传统的昆虫细胞表达有一定的缺陷，由于杆状
病毒的感染，细胞会在几天内死亡裂解，就在细胞
死亡前，由多角体蛋白启动子或 p10 启动子所启动
的蛋白表达达到最大值，而蛋白的翻译后修饰机制
和分泌路径却已遭到破坏，这使得定位在细胞膜上
的蛋白和分泌蛋白的表达受到严重影响。有些蛋白
在成熟前以没有活性的前体蛋白形式存在，在最初
的合成完成后，昆虫细胞无法进行合适的或高效的
加工处理，致使活性蛋白的表达受到限制。另外，
从昆虫细胞中表达的糖蛋白 N 端寡糖常被截短，仅
留有 3 个甚至 2 个甘露糖残基，也没有明显的唾液
酸化作用，导致其在体内的半衰期大大减小，作为
治疗蛋白有一定的障碍［9］。基于以上问题，BacMam
系统是一个良好的替代解决方案。本试验也证明了
BacMam 系统来源的受体型激酶 FGFR1 活性确实更
高，与预期相符。在 P2 代病毒感染细胞后 2 d，从
293-F 细胞纯化得到的蛋白也略微高于昆虫细胞，并
且推测，如果表达全长的 FGFR1 膜蛋白，BacMam
在表达量上会有更大的优势，但这一结论尚有待进
一步验证。
通过 BacMam 系统表达激酶 FGFR1 胞内区的过
程中，我们尝试了用不同滴度的病毒转导 293-F 细胞，
Western blotting 检测表达量，MOI 在 1-15 （MOI=1，2，
5，10，15）的范围内，FGFR1 的表达量随病毒滴
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期118
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（责任编辑 马鑫）