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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-11-08
基金项目 : 山东省自然科学基金资助项目（Y2007D56, ZR2010CQ008）
作者简介 : 全先庆 , 男 , 副教授 , 研究方向 : 植物耐逆分子生物学 ; E-mail: lytuquan@126.com
通讯作者 : 赵传志 , 男 , 硕士 , 研究方向 : 植物基因工程 ; E-mail: zhaochuanzhi@gmail.com,huyjh@126.com
花生金属硫蛋白基因 AhMT3a的克隆及其表达
全先庆1 高成香3 王兴军2 赵传志2
（1 临沂大学生命科学学院，临沂 276005 ；2 山东省农业科学院高新技术研究中心，济南 250100 ；
3 潍坊护理职业学院，青州 262500）
摘 要： 以鲁花 14号花生为材料，从花生 cDNA文库和基因组中筛选和克隆了花生的金属硫蛋白基因 AhMT3a。该基因全
长 785 bp，有 2个内含子，开放阅读框由 201个碱基组成，编码 66个氨基酸，其中包含 13个半胱氨酸（Cys），预测其分子量为 6.83
kD，等电点为 4.59。运用生物信息学手段对 AhMT3a蛋白的信号肽、跨膜区、亚细胞定位和疏水性进行了预测。与拟南芥、棉花
和草莓等植物 type 3 MTs的序列比对结果表明，花生和其他不同植物的 MT3在氨基酸序列上具有较高的同源性，从系统发育树中
可以看出 AhMT3a和蒿麦的金属硫蛋白亲缘关系较近。半定量 RT-PCR和芯片杂交结果显示花生 AhMT3a在花中表达量最高，在
种子中表达量最低；在 ABA、NaCl及 PEG等不同处理下，表达量变化不大。
关键词： 花生（Arachis hypogaea L.） 金属硫蛋白 基因克隆 表达分析
Cloning and Expression Analysis of AhMT3a in Peanut
（Arachis hypogaea L.）
Quan Xianqing1 Gao Chengxiang3 Wang Xingjun2 Zhao Chuanzhi2
（1College of Life Science，Linyi University，Linyi 276005；2High-Tech Research Center，Shandong Academy of Agricultural Sciences，
Jinan 250100；3Weifang College of Nursing Occupation，Qingzhou 262500）
Abstract: A type 3 MT gene AhMT3a was screened from cDNA library of peanut, and the full-length genomic DNA was cloned by PCR.
The length of AhMT3a is 785 bp with two introns. The ORF is 201 bp and encodes 66 amino acids which contains 13 cysteines. The predicted
molecular weight of AhMT3a is 683 kD. The signal peptide, transmembrane area, sub-cellular location and hydrophobicity were also predicted
by bioinformatic software. The phylogenetic tree showed that AhMT3a was closely related to cotton MT3 protein. Semi-quantitative RT-PCR
and microarray results showed that AhMT3a expressed in roots, stems, flowers and seeds while the expression level in flowers was high. The
expression level of AhMT3a did not change significantly upon ABA, NaCl and PEG treatment.
Key words: Peanut（Arachis hypogaea L.） Metallothionein Gene cloning Expression analysis
金属硫蛋白（metallothioneins，MTs）是一类富
含半胱氨酸（Cys）、具有金属离子结合能力的小分
子蛋白，广泛存在于动物、植物、微生物和人体中［1］。
一般认为，植物 MTs 参与金属离子的运输和供给，
维持细胞内环境稳定，在重金属耐受和解毒、植物
发育调节和活性氧清除等方面发挥着作用［2］。MTs
在植物体内以基因家族的形式存在，其成员大多以
单拷贝或双拷贝形式存在于基因组中［3］。Cobbett 和
Goldsbrough［4］根据 MTs 中 Cys 残基的位置及排列方
式，将植物 MTs 分为 4 类。目前，已在多种植物中
克隆到 MT 基因，并且证实铜、镉、锌等可以诱导
大多数植物 MT 基因的表达，ABA、H2O2、热激、冷、
伤害、病毒侵染、盐、高光、乙烯及糖饥饿等因素
也影响 MT 基因的表达［5, 6］。
花生是重要的油料作物之一。作为地上开花、
地下结果的植物，花生种子的发育、成熟和收获都
在土壤中进行，容易受到重金属污染。克隆和鉴定
花生的金属硫蛋白基因，分析其在花生重金属脱毒
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期76
和活性氧清除中的作用，对于花生生产和保障国家
粮油安全具有重要意义。本研究以花生为材料，通
过构建 cDNA 文库和大规模测序，克隆到 type 3 金
属硫蛋白基因 AhMT3a，利用生物信息学手段对其
信号肽、疏水性、跨膜区和亚细胞定位等进行预测，
通过 RT-PCR 和基因芯片对其在花生不同组织及在
不同胁迫处理下的表达特性进行分析，为 AhMT3a
的利用研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试花生为栽培的花生品种“鲁花 14”，由
山东省农业科学院高新技术研究中心保存。高保
真 Taq酶购自北京天根生化公司，反转录试剂盒、
RNAiso、PCR Mix 购自宝生物工程（大连）有限公
司 ；质粒提取和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自生工生
物（上海）工程技术有限公司。引物由生工生物（上
海）工程技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 花生种子 cDNA 文库的构建及 EST 测序 收
集不同发育阶段的未成熟花生种子，按照 RNAgent
试剂盒（Promega）的方法提取总 RNA，用 PolyA
Ttract mRNA Isolation Systems（Promega）试剂盒分离
并纯化 mRNA。cDNA 文库的构建按照 pBluescript II
cDNA（Stratagene，USA）文库构建试剂盒进行。从
cDNA 文库中随机挑取克隆，用 T3 或 T7 通用引物
进行测序 ；测序产生的载体序列、低质量序列手工
去除，EST 的聚类和拼接用软件 Cap3 完成，EST 的
功能注释通过本地化 BlastX 完成。
1.2.2 AhMT3a 基因的克隆 根据功能注释结果，
挑取与其他植物 MT3 同源的 EST 进行重新测序。
利用在线软件 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/projects/gorf）寻找花生 MT3 的编码区。根据编
码区和 5UTR、3UTR 的序列设计引物。pAhMT3aF:
CTACAGCTTACTTCATACCTT ；pAhMT3aR :
CACATTTGGCAATCGTA。利用 CTAB 法提取花生基
因组 DNA。分别以 cDNA 和基因组 DNA 为模板进行
PCR，反应程序 ：94℃ 3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，
72℃ 1 min，31 个循环 ；72℃ 5 min ；16℃结束反应。
PCR 反应结束后，以 1% 琼脂糖电泳检测结果。切
胶回收目的 DNA，连接到克隆载体（pMD18-T）上
进行测序。
1.2.3 AhMT3a 的基本性质预测和生物信息学分
析 用 DNAstar 预测花生和其他植物 MT3 的分子
量、等电点，并统计氨基酸数。利用 TMHMM 软件
（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）对 AhMT3a
编码蛋白进行跨膜预测 ；用 ExPASy 的在线软件
ProtScale（http://www.expasy.ch/tools/protscale.html）
计算蛋白的疏水图谱 ；用 SignalP 3.0 对 AhMT3a 的
编码序列预测进行信号肽预测 ；用软件 ProtComp v
8.0 预测蛋白在植物中的亚细胞定位。用多序列比
对软件 ClustalW 1.83 对 AhMT3a 和来自拟南芥、棉
花和草莓等植物的 MT3 蛋白（表 1）进行多序列同
源比对和进化树分析，输出的文件通过 BOXSHADE
3.21 进行着色。
表 1 文中使用的金属硫蛋白基因
金属硫蛋白 登录号 物种 分子量（kD） 等电点 氨基酸数
GhMt3 AAD22465 棉花（Gossypium hirsutum） 6.65 4.6 63
IaMt3 ADO12864 空心菜（Ipomoea aquatica） 6.93 4.23 66
PaMt3-like BAD95608 杨树（Populus alba×Populus tremula var. glandulosa） 6.83 5 66
OoMt-like AAX39388 药用野生稻（Oryza officinalis） 6.51 5.13 62
EgMt-like CAB52585 油棕（Elaeis guineensis） 6.77 4.73 65
FaMt-like AAW52725 草莓（Fragaria×ananassa） 6.50 4.6 63
AtMt3 AEE75655 拟南芥（Arabidopsis thaliana） 7.37 4.48 69
BjMt3 BAB85600 芥菜（Brassica juncea） 7.19 4.26 67
FeMt-like AAC13291 蒿麦（Fagopyrum esculentum） 6.41 4.86 59
HvMt3-like CAD88266 大麦（Hordeum vulgare subsp. vulgare） 6.66 4.72 62
RcMt-like XP002531714 蓖麻（Ricinus communis） 6.79 5.57 66
2012年第3期 77全先庆等 ：花生金属硫蛋白基因 AhMT3a 的克隆及其表达
1.2.4 AhMT3a 基因的的表达分析 花生 AhMT3a
在花生根、茎、叶、花和种子等不同组织中的表达
通过花生 cDNA 芯片的杂交检测完成［7］。以营养钵
中生长两周左右、长势一致的花生植株为材料，分
别用 100 μmol/L ABA、20% PEG6000 和 200 mmol/L
NaCl 处理花生 6 h，分别提取对照和不同处理下花
生根、茎、叶的总 RNA ；提取大田正常生长的花生
根、茎、叶、花和种子的总 RNA。用 PrimerScript 1st
Strand cDNA Synthesis 试剂盒合成第一链 cDNA，根据
AhMT3a和花生Actin基因的侧翼序列设计引物AhM-
T3aRTF：CCGTTGTCGCTTCAGCT，MT3aRTR：CAC-
ATTTGGCAATCGTATTT，ActinF: CTCTTCCGCATGC-
AATCT，ActinR：TGCTACTCGGTGCCAATG。以 cDNA
为模板进行 PCR，反应程序：94℃ 3 min，94℃ 30 s，
55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，26 个 循 环 ；72 ℃ 5 min ；
16℃结束反应。
2 结果
2.1 基因序列克隆及序列分析
从花生 cDNA 文库中克隆到 1 个编码 type 3 MT
的 cDNA，根据 Cobbett 和 Goldsbrough［4］对植物 MT
的分类法，将其命名为 AhMT3a。AhMT3a 开放阅读
框由 201 个碱基组成，编码 66 个氨基酸，其中有
13 个（Cys），预测其分子量为 6.83 kD，等电点为 4.59。
表 1 中还列举了其他植物 MT3 基因的相关信息，结
果显示 type 3 MTs 编码蛋白一般由 59-69 个氨基酸
组成，分子量为 6-7 kD，等电点介于 4.2-5.6 之间。
从花生 cDNA 和基因组 DNA 中扩增出 AhMT3a
的 cDNA 和基因组序列。电泳检测（图 1）显示，
包含侧翼序列的 cDNA 的扩增产物为 250 bp 左右，
基因组 DNA 为 800 bp 左右。
回收 AhMT3a 的 cDNA 和基因组 DNA，连接到
T 载体上测序。测序结果用 DNAstar 分析、去掉侧翼
序列，用在线软件 ClustalW2（http://www.ebi.ac.uk/To
ols/msa/clustalw2/）比对cDNA和基因组DNA。结果（图
2）显示，花生 AhMT3a 基因组 DNA 由 785 个碱基组
成，包含2个内含子，其长度分别为466 bp和 118 bp。
2.2 AhMT3a的基本性质和生物信息学分析
将 AhMT3a 的氨基酸序列提交到软件 SignalP
3.0， 预 测 结 果 显 示 该 蛋 白 没 有 信 号 肽 序 列 ；
1.cDNA 扩增结果 ；2. 基因组 DNA 扩增结果 ；M.DNA Marker DL2000 plus
图 1 从 cDNA和基因组中扩增 AhMT3a基因
Protcomp v9.0 预测结果显示 AhMT3a 为分泌蛋白，
定位在胞外，但是 TMHMM 软件预测 AhMT3a 没有
跨膜区 ；ProtScale 计算出 AhMT3a 的疏水性图谱，
结果显示 AhMT3a 蛋白疏水面较少，多为亲水性氨
基酸。与其他植物 MT3 蛋白的比对结果 （图 3） 表明，
花生AhMT3a和其他植物的MT3具有较高的同源性，
尤其是 Cys（以星号标出）的数量及其排列顺序非常
保守。大多数 MT3 均有 10 多个 Cys，并多集中在 N
端和 C 端。一般 N 端有 4 个 Cys，前 3 个多以 Cys-
Gly-Asn-Cys-Asp-Cys 方式排列，其他 Cys 多集中在
C 端。系统发育树结果（图 4）显示，花生 AhMT3a
和蒿麦的金属硫蛋白亲缘关系较近。
2.3 AhMT3a基因的表达分析
花生 cDNA 芯片杂交结果（图 5）显示，Ah-
MT3a 在花生根、茎、叶、花和种子中均有表达，在
花中的表达量最高，分别为茎、根、叶表达量的 3 倍、
4 倍和 11 倍，种子中表达量最低，还不及花中表达
量的 1/48。半定量 RT-PCR 结果（图 6）与芯片杂交
结果基本一致，AhMT3a 在花中表达量最高，在种子
中表达量最低，几乎检测不到。分别用 ABA、NaCl
和 PEG 等逆境处理，RT-PCR 结果（图 7）显示花
生 AhMT3a 基因在茎中的表达量都不同程序地高于
对照，在根和叶中的表达量变化不明显。
3 讨论
从现有的文献看，植物 type 3 MT 基因的组织表
达特异性不强［2］，如苹果、香蕉等的 MT3 在果实成
熟过程中高水平表达［4］；荞麦 MT3 在种子发育早期
到成熟晚期都有 mRNAs 表达，绿叶和老叶中 MT3
的 mRNA 水平都很高［8］。在本研究中，分别用基因
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期78
芯片和半定量 RT-PCR 方法对花生 AhMT3a 基因在
根、茎、叶、花、种子等组织中的表达情况进行分
析发现，AhMT3a 在各种器官中都有表达，在花中
的表达量最高，在种子中最低。
许多研究表明植物 type 3 MT 可能在 ROS 清除
中发挥重要作用［2］，ROS 可以取代 MT 的 Cys 残基
上的金属离子而与 MT 结合，从而减少胁迫条件下
体内 ROS 的积累 , 避免细胞损伤 ；不同植物的 type
3 MT 基因在胁迫条件下的表达差异性也很大。盐芥
TsMT3 基因在 ABA、NaCl、PEG 处理后表达上调［9］；
在高盐、干旱、低温、ABA 等胁迫条件下，棉花幼
苗中 GhMT3a 基因的表达量增强［10］；在干旱条件下 ,
白杨的 type 3 MT 基因在叶中的表达量明显提高［11］，
以上结果表明植物 type 3 MT 基因在 ROS 清除中发
挥作用。Brkljacic 等［8］发现用 NaCl 处理荞麦后，
绿叶中 MT3 mRNA 水平降低，老叶和种子中的表达
图 2 花生 AhMT3a基因组序列的克隆（阴影部分为外显子）
图 3 花生 AhMT3a和其他植物MT3蛋白的序列比对
2012年第3期 79全先庆等 ：花生金属硫蛋白基因 AhMT3a 的克隆及其表达
水平不变。在本研究中，分别用 ABA、PEG、NaCl
处理花生幼苗，AhMT3a 基因在茎中的表达量都程
度不同地高于对照，其中用 PEG 处理后表达增强较
为明显，根和叶中 AhMT3a 基因的表达变化不大。
4 结论
本研究从花生 cDNA 文库中筛选并克隆了 type
3 金属硫蛋白基因 AhMT3a，进而克隆到其基因组
序列，并对编码蛋白的信号肽、跨膜区、亚细胞定
位和疏水性等进行了预测。通过半定量 RT-PCR 和
芯片杂交发现 AhMT3a 基因在花生各种组织中都有
表达，在花中的表达量最高 ；用 ABA、NaCl、PEG
等处理花生幼苗，AhMT3a 在茎中的表达量都有增
加。研究结果表明 AhMT3a 基因可在花生胁迫耐受、
ROS 清除中发挥一定的作用。
参 考 文 献
［1］ Otvos JD, Olafson RW, Armitage IM. Structure of an invertebiate me-
tallothioein from Scylla serrata. J Biol Chem, 1982, 257: 2427-2431.
［2］ 全先庆 , 张洪涛 , 单雷 , 等 . 植物金属硫蛋白及其重金属解毒机
制研究进展 . 遗传 , 2006, 28（3）: 375-382.
［3］ Blindauer CA, Schmid R. Cytosolic metal handling in plants: determ-
inants for zinc specificity in metal transporters and metallothioneins.
Metallomics, 2010, 2: 510-529.
［4］ Cobbett C, Goldsbrough P. Phytochelatins and metallothioneins:roles
in heavy metal detoxification and homeostasis. Annu Rev Plant Biol,
2002, 53: 159-182.
［5］ Roosens NH, Bernard C, Leplae R, et al. Evidence for copper homeo-
stasis function of metallothionein（MT3）in the hyperaccumulator
Thlaspi caerulescens.FEBS Lett, 2004, 577（1-2）: 9-16.
［6］ Zhou GK, Xu YF, Liu JY. Characterization of a rice class II metallo-
thionein gene: tissue expression patterns and induction in response
to abiotic factors. J Plant Physiol, 2005, 162（6）: 686-696.
［7］ Bi YP, Liu W, Xia H, et al. EST sequencing and gene expression
profiling of cultivated peanut（Arachis hypogaea L.）. Genome,
2010, 53:832-839.
［8］ Brkljacic JM, Samardzic JT, Timotijevic GS, et al. Expression analysis
of buckwheat（Fagopyrum esculentum Moench）metallothionein-like
gene（MT3）under different stress and physiological conditions. J
Plant Physiol , 2004 , 161（6）:741-746.
［9］ Quan XQ, Wang ZL, Zhang H, et al. Cloning and characterization of
TsMT3, a type 3 metallothionein gene from salt cress（Thellungiella
salsuginea）. DNA Sequence, 2008, 19（3）: 340-346.
［10］ Thomas JC , Davies EC , Malick FK, et al. Yeast metallothionein
in transgenic tobacco promotes copper uptake from contaminated
soils. Biotechnol Prog , 2003, 19（2）:273-280.
［11］ 范仲学 , 蔡利娟 , 杜瑞雪 , 等 . 龙葵 SorMT2a 和 SorMT2c 基因
的克隆及其转化烟草研究 . 山东农业科学 , 2010, 12 ：1-5.
（责任编辑 狄艳红）
图 4 AhMT3a 进化树分析
图 7 AhMT3a在不同胁迫处理下的表达研究
图 6 AhMT3a在花生不同组织中的表达
图 5 AhMT3a在花生不同组织中的表达