全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
Janus 激 酶 和 信 号 转 录 因 子 及 活 化 子（Janus
kinase/signal transducer and activator of transcription，
JAK-STAT）是最重要的细胞因子和生长因子信号通
路之一，JAK 激酶的活化刺激细胞生长、扩增、分化、
细 胞 迁 移 和 凋 亡［1］。 生 长 激 素（Growth hormone，
GH）通过与细胞表面受体结合激活胞内信号转导反
应，调控细胞生长和分化。GH 信号通路由细胞表
面的生长激素受体（Growth hormone receptor，GHR）
二聚体化引发，进入 JAK-STAT 信号通路引发磷酸
收稿日期 ：2012-10-22
基金项目 ：贵州省重大科技专项计划项目［黔科合重大专项字（2011）6009 号］
作者简介 ：龚俞，男，硕士，畜牧师，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ；E-mail ：yituo-28@163.com
通讯作者 ：刘若余，男，教授，研究方向 ：分子遗传与动物育种 ；E-mail ：liury04@163.com
牛 JAK2 基因启动子区多态及生物信息学研究
龚俞1  杨永强2  焦仁刚1  惠嫣婷2  刘若余2
（1. 贵州省畜牧技术推广站，贵阳 550001 ；2. 贵州大学动物科学学院 高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室
贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵阳 550025）
摘 要 ： 为筛选 JAK2 基因启动子区 SNP 及研究其对启动子功能元件的影响，选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑
牛构建不同 DNA 池，直接测序筛选 SNP 位点。结果表明，JAK2 基因 5 调控区及第 1 外显子存在 2 个 SNPs 位点，分别为 G+5A、
G+104A。生物信息学软件预测得到 JAK2 基因核心启动子区，SNP 位点导致 9 个转录因子结合位点消失，而产生 1 个新的转录因
子结合位点。G+5A 对转录因子结合位点、RNA 二级结构和 CpG 岛均有显著影响。
关键词 ： JAK2 SNP 启动子 贵州荷斯坦奶牛 务川黑牛
Study on the SNP and Bioinformatics of Promoter Region
of JAK2 Gene in Cattle
Gong Yu1 Yang Yongqiang2 Jiao Rengang1 Hui Yanting2 Liu Ruoyu2
（1. Animal Science and Technology Station of Guizhou，Guiyang 550001 ；2. College of Animal Sciences，Guizhou University，Key Laboratory
of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，Guizhou
Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction，Guiyang 550025）
Abstract:  In order to screen the polymorphisms of JAK2 promoter in cattle and analyze the effect of SNPs on function elements of
promoter. Two cattle breeds（Wuchuan black cattle and Guizhou Holstein cow）with significant difference in breeds property were selected
to construct DNA pools, SNP sites were screened by direct sequencing subsequently. Results showed that 2 single nucleotide polymorphisms
（SNPs）were found in the 5 flanking region and part of exon 1 which included G+5A and G+104A. Furthermore, bioinformatics tools were used
to predict the core region of the promoter. It demonstrated that 1 new transcription factors binding sites emerged while 9 previous transcription
factors binding sites disappeared based on the SNPs found in this study, and it also showed that SNP of G+5A could change the secondary
structure of RNA, transcription factors binding sites and range of CpG island dramatically by using various softwares.
Key words:  JAK2 SNP Promoter Guizhou Holstein cow Wuchuan black cattle
化级联反应，GHR 活化后导致 JAK2 激酶磷酸化，
进而磷酸化下游的 STAT 蛋白，STAT 蛋白以二聚体
形式进入核内，作为转录因子调控相关基因表达［2］。
基因启动子变异通过改变 RNA 聚合酶和转录
因子与调控序列的结合影响基因表达水平。目前对
于牛 JAK2 基因启动子多态性研究极少，DNA 池是
将同种属样本调整为相同浓度，一定数量的样本混
合成 DNA 池的方法，具有提高检测效率，降低成本
等优点［3］。本试验为筛选 JAK2 基因启动子区 SNP
2013年第6期 105龚俞等 ：牛 JAK2 基因启动子区多态及生物信息学研究
及研究其对启动子功能元件的影响，选择贵州地方
优良品种务川黑牛和贵州荷斯坦奶牛两种生长性能
差异明显的品种构建 DNA 池，直接测序后 DNAstar
软件进行序列拼接和校正，BLAST 分析 JAK2 基因
多态性，并与 NCBI 中 SNP 数据库进行比较生物信
息学软件预测序列核心启动子区和 CpG 岛，并分析
SNP 位点对转录因子结合位点和 RNA 二级结构等
影响。
1 材料与方法
1.1 材料
54 个贵州荷斯坦奶牛血样采自贵州贵阳三联乳
业公司第二奶牛场，务川黑牛血样 45 个采自贵州务
川仡佬苗族自治县仡佬牧业公司种牛场。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取与 DNA 池构建 血液基因组提取
试剂盒（生工生物工程有限公司）提取牛 DNA，1%
琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 提取效果，每个 DNA 样
品浓度使用紫外分光光度计测量 3 次，取平均值。
务川黑牛和贵州荷斯坦奶牛 DNA 样品分别调整相同
浓度至 100 ng/μL，各取 5 μL 混合构建成 2 个 DNA 池。
1.2.2 引物设计和 DNA 扩增 以牛 JAK2（GenBank
登 录 号 ：AC_000165.1）DNA 序 列， 利 用 Primer-
BLAST 设 计 1 对 特 异 性 引 物， 上 游 引 物 为 ：5-
ACACTGCCTCCCCACTTCCTG-3 ；下游引物为 ：5-
AGGCAAAGGTCCGAGTGTCCG-3。PCR 扩 增 JAK2
基 因 5 调 控 区 及 第 1 外 显 子， 构 建 DNA 池 进 行
PCR 反 应，PCR 反 应 体 系 为 25 μL ：2×Taq PCR
Master Mix 试剂 12.5 μL，上、下游引物（浓度为 10
pmol/μL）各 1.5 μL，基因组 DNA 2.5 μL，三蒸水 7
μL。采用 Bio-Rad 公司 PCR 扩增仪进行 DNA 扩增，
PCR 扩增条件为 ：94℃预变性 4 min ；94℃变性 40 s，
60.6℃退火 45 s，72℃延伸 50 s，35 个循环 ；72℃
延伸 10 min。1% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，
凝胶成像系统观察电泳结果。
1.2.3 序列分析 特异性好的 PCR 产物委托诺赛基
因组研究中心有限公司进行双向测序，特异性不好
的 PCR 产物利用 DNA 纯化回收试剂盒（北京博迈
德科技发展有限公司）进行纯化后测序，3 次独立
测序。DNAstar 软件对测序结果进行校正，BLAST
分析确定 SNPs。
1.2.4 生物信息学分析 启动子预测 ：http ：//www-
bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/ ；http ：//www.fruitfly.
org/seq_tools/promoter.html ；http ：//www.cbs.dtu.
dk/services/Promoter/。
转录因子结合位点预测 ：http ：//www.ifti.org/ ；
http ：//www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess ；http ：//
www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html ；http ：//
linux1.softberry.com/cgi-bin/programs/promoter/nsite.pl。
RNA 二 级 结 构 预 测 ：http ：//www.genebee.msu.
su/services/rna2_reduced.html ；http ：//wwwmgs.bionet.
nsc.ru/mgs/programs/2dstructrna/evolga.html。
CpG 岛 预 测 ：http ：//www.bio-soft.net/sms/cpg_
island.html ；http ：//www.urogene.org/methprimer/
index1.html ；http ：//zeus2.itb.cnr.it/cgi-bin/wwwcpg.
pl ；http ：//linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cp
gfinder&group=programs&subgroup=promoter ；http ：//
www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx。
2 结果
2.1 DNA池的PCR产物测序
设计特异性引物分别扩增出务川黑牛和荷斯坦
奶牛 JAK2 基因目的序列共 1 216 bp（图 1）。扩增产
物经胶回收纯化后进行双向测序，BLAST 分析共发
现 2 个 SNPs（图 2）。以 JAK2 基因第 1 外显子第 1
位为 +1 位，SNPs 位点分别为 G+5A、G+104A。对
于 2 个生长性能差异明显的牛种，务川黑牛生长性
能优于荷斯坦奶牛，其在 +5 位点并未表现出多态性，
而荷斯坦奶牛出现杂合子，该突变位点是否造成其
生长性能差异需进一步研究。贵州荷斯坦奶牛和务
川黑牛在 G+104A 位点上均表现出多态性，该 SNPs
可能在不同牛种中普遍存在。
2.2 JAK2基因启动子预测
利用 3 种不同软件对测序得到的 JAK2 基因调
控区序列进行启动子预测，均预测得到启动子区（表
1）。Neural Network Promoter Prediction 软件发现 1 个
可能的核心启动子区域，第 -129- -79 bp 评分达到
0.97。Promoter 2.0 预测在 -426 bp 处存在核心启动子
区域，评分为 0.623。而 Promoter SCAN 软件预测在
远端 -801- -551 bp 存在 250 bp 长的启动子区域。本
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期106
研究所发现 SNP 位点并未处于核心启动子区域，但
G+5A 因靠近转录起始位点，可能在调控 JAK2 基因
表达中发挥重要作用，而不同牛种均具有连续的碱
基缺失突变，可能作用于其他调控区域而影响基因
表达水平。
表 1 启动子预测结果
软件 起始位点 终止位点 评分
Neural Network Promoter Prediction -129 -79 0.97
Promoter 2.0 -426 — 0.623
Promoter SCAN -801 -551 0.889
2.3 JAK2基因5调控区转录因子结合位点预测
采用 Tfsitescan、TESS、TFSEARCH 3 种生物学
软件对 JAK2 基因转录因子结合位点进行预测和综
合分析。结果（表 2）表明，递交序列包含 γ-IRE、
FOX protein、AP-1、C/EBP、NF-κB、SP1、c-Myb 等
对 JAK2 基因表达起重要调控作用的转录因子结合
位 点， 并 有 TATA box、GC box、CCAC box 等 启 动
子重要元件结合位点。将突变后的序列重新提交，
比较发现突变造成从 2-11 位，Ets-laminin、PEA3-
CAMLG、PEA3_CS、PEA3_RS 等 4 个转录因子结合
位点消失。这一变化主要由 G+5A 突变引起。而从
244 位 开 始 造 成 Sp1-erk1、c-Krox_CS、NFκB_CS2、
FRE_CS、Sp1-gamma-globi 结 合 位 点 的 消 失， 而 在
243 位产生一个新的 MED-1 结合位点（图 3，图 4）。
本研究发现的 SNP 所处位置均发生转录因子结合位
点的改变，其中因 G+5A 突变导致消失的结合位点
位于转录起始位点附近，可能对 JAK2 基因表达调控
发挥重要作用。
表 2 不同软件预测 JAK2 基因转录因子结合位点结果
软件
转录因子结合位点总数 评分为 10 的转录因子结合位点数
突变前 突变后 突变前 突变后
Tfsitescan 466 457 23 19
TESS 511 503 — —
TFSEARCH 563 555 9 9
2.4 JAK2基因RNA二级结构预测
突变前后 JAK2 基因的 RNA 二级结构预测结果
（图 5）表明，多态性位点导致 RNA 二级结构 +36
位点附近茎环结构和内部最小自由能发生改变，这
一变化主要由 G+5A 多态性位点引起，而其余碱基
缺失突变未对 RNA 二级结构造成影响。该突变导致
RNA 二级结构最小自由能发生变化，由 -1.631×106
J/mol 变为 -1.608×106 J/mol，影响 RNA 二级结构稳
定性，可能影响随后转录因子结合及后续转录翻译
过程。
2.5 JAK2基因5调控区CpG岛预测
利 用 Webgene 和 MethPrimer 等 5 种 生 物 信 息
学软件预测目标序列 CpG 岛，以 G+C 含量 >50%，
Obs/Exp 比值 >0.6 和 CpG 岛范围 >100 bp 为判定标准，
以转录起始位点为 0 位，上下游分别以正负号标明，
各软件在目的序列中均预测有 CpG 岛存在（表 3，
图 6），说明 JAK2 启动子序列中 CpG 岛可能对其功
能发挥具有重要作用，本研究发现的 SNP 位点均处
于各软件预测的 CpG 岛区，其中 G+5A 位点突变导
致 Bio-soft 软件预测的 CpG 岛范围显著减小，可能
对其甲基化水平造成影响。
2000
bp
1 2
1216
bp
M
1000
750
500
250
100
M ：DL2000 Marker ；1 ：务川黑牛 DNA 池 PCR 产物 ；
2 ：贵州荷斯坦奶牛 DNA 池 PCR 产物
图 1 务川黑牛和贵州荷斯坦奶牛 JAK2 基因 DNA 池结果
T T C A A AGGG
W
G G G C T C A A TCG G C CGG
T T C A A AGG G G G C T C A G TCC G C CGG
G+5A G+104A
G+5A G+104A
G ：贵州荷斯坦奶牛 ；W ：务川黑牛
图 2 不同牛品种 JAK2 基因 DNA 池的 PCR 产物测序和
BLAST 分析结果
2013年第6期 107龚俞等 ：牛 JAK2 基因启动子区多态及生物信息学研究
3 讨论
JAK 激 酶 家 族 共 有 4 个 成 员， 分 别 为 JAK1、
JAK2、JAK3 和 TYK2［5］，GH 信 号 通 路 中 主 要 由
JAK2 发挥关键作用，而非 Src 家族激酶［6］。GH 首
先诱导细胞膜受体 GHR 二聚体化，进而导致 JAK2
激酶磷酸化而激活。激活的 JAK2 使自身及 GHR 的
Sp1-integr in-al˃
PPE˃
Sp1-ATP-syn-bet
Sp1-rVMAT-2-2˃
Sp1-KDR/flk-1-I˃
Sp1-KDR/ftk-1-I˃ PPE˃
Sp1-integr in-al˃ Sp1-ATP-syn-bet
Sp1-rV1AT-2-2˃
Sp1-KDR/flk-1-I˃
Sp1-KDR/ftk- -˃I˃
Ets-laninin
ケਈࡽ ケਈਾ
图 3 Tfsitescan 软件转录因子结合位点预测结果
901 TCCCCAAAGT GGGAGTGGTG TGGGTTG CAG GAAGGAGAGA GGAAGAGGAG entry
M00048
M00029
M00083
M00048
M00253
M00223
M00223
score
93.8
90.9
88.7
87.7
86.7
86.5
86.5
ケਈࡽ
ADR1
HSF
MZF1
ADR1
cap
STATx
STATx
entry
M00028
M00048
M00029
M00029
M00283
M00048
M00253
M00223
M00271
M00048
score
95.3
93.8
93.7
90.9
88.7
87.7
86.7
86.5
85.4
84.6
ケਈਾ
HSF
ADR1
HSF
HSF
MZF1
ADR1
cap
STATx
AML-1
ADR1
901 TCCCCAAAGT GGGAGTGGTG TGGGTTG CAA GAAGGAGAGA GGAAGAGGAG
图 4 TFSEARCH 软件转录因子结合位点预测结果
图 5 JAK2 基因 RNA 二级结构预测结果
6.4
12.78.3 6.712.26.79.2
24.4
1 7.314.0 6.21
11
6.4
12.78.319 13. 9.68.9
10.4
24.4
1 7.314.0 6.21
1110801080
ケਈࡽ ケਈਾ
表 3 不同软件预测 JAK2 基因启动子区 CpG 岛
软件
CpG 岛数 大小（bp） 起始位置 G+C 含量（%）
突变前 突变后 突变前 突变后 突变前 突变后 突变前 突变后
MethPrimer 2 2
117 117 -604--488 -604--488 57.26 57.26
716 712 -481-+234 -481-+230 70.25 70.37
Bio-soft 1 1 1031 949 -741-+291 -741-+88 66.37 65.63
CpG Island Searcher 1 1 1152 1148 -861-+291 -861-+287 63.37 63.1
Webgene 1 1 1031 1027 -741-+291 -741-+287 66.37 65.98
Softberry 1 1 — — -219- -219- — —
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期108
酪氨酸残基磷酸化，活化的 JAK2 和 GHR 构成复合
物吸引 STAT 蛋白等下游蛋白与其高亲和力位点结
合，激活的 STAT 蛋白形成同源或异源二聚体进入
核内作为转录因子诱导相关基因表达［7，8］。GH 诱导
的信号转导过程被精确调控，GHR 在体内会因胞吞
作用而降解，而 JAK2 可在细胞表面与生长激素受
体结合，防止 GHR 在非催化阶段被降解［9］，并能
显著提高成熟 GHR 在体内的稳定性［10］。对于 JAK2
基因多态性研究主要集中在人类免疫性疾病上［11］。
畜禽研究方面，Liu 等［12］研究鸡 JAK2 多态性位点
与生长和繁殖性能间相关性。通过 DNA 池技术鉴定
到 14 个 SNP 位点，其中 5 个由 768 个体确定基因
型。并证实 SNP 位点与体重显著关联。JAK2 多态
性可能作为改善鸡生长性状的分子标记。但目前对
牛 JAK2 基因启动子多态性研究尚未见报道。
本试验首次在 JAK2 基因 5 调控区及第 1 外显
子鉴定得到 2 个 SNP 位点，对于 2 个生长性能差异
明显的牛种，务川黑牛生长性能优于荷斯坦奶牛，
其在 +5 位点并未表现出多态性，而荷斯坦奶牛出现
杂合子，该突变位点是否造成其生长性能差异需进
一步研究，可扩大牛品种数对同一 SNP 位点进行鉴
定。贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛在 G+104A 位点上
均表现出多态性，该 SNPs 可能在不同牛种中普遍
存在。
不同软件预测核心启动子区域有差异，利用多
种软件综合分析可最大限度提高预测准确性，本研
究所发现 SNP 位点并未处于核心启动子区域，但
G+5A 因靠近转录起始位点，可能在调控 JAK2 基因
表达中发挥重要作用，而不同牛种均具有连续的碱
基缺失突变，可能作用于其他调控区域而影响基因
表达水平。2 个 SNP 位点突变均导致不同转录因子
结合位点消失和产生新结合位点，其中 G+5A 对其
附近的转录因子结合位点影响较大，说明突变位点
可直接影响特异转录因子与调控序列的结合，该位
点还对 JAK2 基因二级结构有影响。此外，多态性
位点的突变还导致远端不同转录因子结合位点的生
成和消失，说明上述 SNP 位点还可影响远端转录因
子结合活性。DNA 甲基化可显著降低靶基因表达水
平，5 种生物信息学软件均预测 JAK2 基因启动子区
域具有范围较大的 CpG 岛，说明 DNA 甲基化水平
对 JAK2 基因表达调控有重要作用，G+5A 位点突变
导致 Bio-soft 软件预测的 CpG 岛范围显著减小，可
能对其甲基化水平造成影响，G+5A 突变可能是重要
的功能突变，这一变化是否影响 JAK2 基因表达需要
进一步研究，对 JAK2 基因 SNP 研究结果为进一步
分析 JAK2 启动子功能奠定试验基础。可在此基础上
开展深入研究，考查启动子区 SNPs 位点对 JAK2 基
因表达水平的影响以及 2 个牛种不同多态性表现与
生长性状差异是否有关联。
4 结论
采用 DNA 池技术结合直接测序快速筛查到不同
CpG
0
0
20
40
60
80
G
C
P
er
ce
nt
ag
e
200 bp 400 bp
F1
Input Sequence Bisulfite PCR primer
Methylated-Specific
MSP Primer Set CpG Island
Unmethylated-Specific
R1
F2
F3
F4
F5 R5
R4
R3
R2
600 bp 800 bp 1000 bp 1200 bp
图 6 MethPrimer 软件预测 CpG 岛结果
2013年第6期 109龚俞等 ：牛 JAK2 基因启动子区多态及生物信息学研究
牛种 JAK2 基因启动子区 2 个 SNPs，不在预测的核
心启动子区域，但 G+5A 靠近转录起始位点，贵州
荷斯坦奶牛和务川黑牛在 2 个位点表现出不同的多
态性特征。2 个 SNPs 位点导致 9 个转录因子结合位
点消失，而产生 1 个新的转录因子结合位点。多态
性位点造成 RNA 最小自由能和二级结构显著改变，
不同软件预测目标序列均发现 CpG 岛，多态性位点
对 CpG 岛范围有影响。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）