全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
作为三大重要的有机酸之一，乳酸广泛应用于
食品，医药，环保和农业等诸多领域［1，2］。随着环
保意识的增强，乳酸更多的用于生产生物可降解的
聚合材料聚乳酸（PLA）。聚乳酸不但可以加工成
塑料，减弱对石化资源的依赖性，还可以制作多种
医用材料，具有生物可吸收性，发展前景良好的特
点［3］。2010 年“乳酸生产菌种分子改造与高效发酵
技术”再次被列入“十二五”重大攻关项目［4］，预
收稿日期 ： 2013-11-12
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（31070094），湖北省教育厅科研项目（Q20121405），湖北省科技厅科研项目（2011CDA008，2011CD-
B076）
作者简介 ：罗璇，女，讲师，研究方向 ：发酵工程与生物技术 ；E-mail ：luoxuan20051982@126.com
通讯作者 ：王金华，男，教授，研究方向 ：发酵工程 ；E-mail ：wangjinhua@mail.hbut.edu.cn
乳酸片球菌 L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在重组大肠
杆菌 JH12 中的过量表达
罗璇1 许丽媛2 王永泽2 赵锦芳2 赵筱2 王金华2
（1. 华中农业大学楚天学院 食品与生物科技学院，武汉 430205 ；2. 湖北工业大学发 酵工程教育部重点实验室 工业发酵湖北省协同创新中
心，武汉 430068）
摘 要 ： 以工程菌 Escherichia coli SZ85 基因组为模板，克隆得到乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的 L-乳酸脱氢酶基因
（ldhL），连接到 pUcm-T 载体后，双酶切然后将其连接到表达载体 pET-28a 上，重组质粒经筛选后转入染色体上含有 ldhL 基因（来
源 P. acidilactici）的工程菌 Escherichia coli JH12。 P. acidilactici 的 ldhL 基因过量表达体系 E. coli JH12（pET-28a-ldhL）能利用浓度 7%
的木糖为碳源进行厌氧发酵，过量表达 ldhL 使 L-乳酸产量提高了 10 g/L，达 64.86 g/L，糖酸转化率高达 96%。
关键词 ： 重组大肠杆菌 过量表达 L-乳酸
Cloning L-lactate Dehydrogenase Gene from Pediococcus acidilactici
and Overexpression of It in Recombination Strain E.coli JH12
Luo Xuan1 Xu Liyuan2 Wang Yongze2 Zhao Jinfang2 Zhao xiao2 Wang Jinhua2
（1. College of Food Science and Biotechnology，Huazhong Agricultural University Chutian College，Wuhan 430205 ；2. Key Laboratory of
Fermentation Engineering（Ministry of Education），Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation，College of
Bioengineering，Hubei University of Ttechnology，Wuhan 430068）
Abstract: Gene ldhL encoding L-lactate dehydrogenase was amplified by PCR technique using genome DNA of Escherichia coli SZ85
as temple. The PCR product was cloned into pUcm-T vector and double digested with restriction endonucleases, and then the DNA fragment of
ldhL was inserted into pET-28a（+）. The recombinants expression plasmid pET-ldhL was transformed into high purity L-lactate production of
E. coli. JH12, which inserted ldhL of P. acidilactici into chromosome. The overexpression system of ldhL of Pediococcus acidilactici gene E. coli
JH12（pET-28a-ldhL）could product L-lactic acid using 7% xylose. Overexpression of ldhL led to L-lactic acid yield of 64.86 g/L, which is 10
g/L higher than control without Overexpression of ldhL. Meanwhile, high sugar-acid ratio of 96% was achieved by overexpression of ldhL.
Key words: Recombination E.coli Overexpression L-lactic acid
计 2016 年聚乳酸市场价值将达 38.31 亿美元。目前
我国 L-乳酸工业生产中的菌株在产量和质量方面都
远落后于国外，高纯度的 L-乳酸主要依靠进口。因
此提高我国乳酸工业中菌株生产 L-乳酸的发酵浓度，
发酵纯度，底物转化率以及扩大生产强度具有重大
意义。
目 前 L-乳 酸 的 菌 株 生 产 主 要 集 中 于乳 酸 菌
（Lactobacillus manihotivora-ns）［5］、肠球菌（Rhizopus
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期122
oryzae）［6］、 稻 根 霉 菌（Enterococcus casseliflivus）［7］
和重组大肠杆菌（E. coli）［4，8-11］。其中大肠杆菌由
于遗传背景清楚、便于操作调控、营养要求简单以
及生长迅速，理论转化率高等特点，近年来被广泛
开发研究以获得优秀 L-乳酸的生产菌株。野生大肠
杆菌不具备 L-乳酸的生长能力，只具有 D-乳酸脱氢
酶基因（ldhA），在无氧条件下能利用碳源生产 D-乳
酸。为了使大肠杆菌获得高纯度 L-乳酸的生产能力，
研究者将大肠杆菌中 ldhA 基因失活后，再引入外源
L-乳酸脱氢酶基因（ldhL），在大肠杆菌体内获得表
达［3，12，13］。本研究中选用的外源 L-乳酸脱氢酶基
因——乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici） 的 L-乳
酸 脱 氢 酶（L-lactate dehydrogenase，LLDH） 基 因，
不仅具有和 L-乳酸高产菌株 Lactobacillus plantarum
的 L-乳酸脱氢酶基因呈现出极大的核酸序列相似
性，且和大肠杆菌具有同样的植物性启动子序列，
利于基因的表达。此外，Pediococcus acidilactici 的
L-乳酸脱氢酶是非别构酶，减少了果糖 1-6 二磷酸
（FBP）对大肠杆菌产乳酸的影响，利于泛克隆到大
肠杆菌用于 L-乳酸的生产［14］。本研究以 Escherichia
coli SZ85［3］基因组 DNA 为模板，PCR 克隆得到 L-
乳 酸 脱 氢 酶（L-lactate dehydrogenase，LLDH） 基
因，并将其连接到表达质粒 pET-28a 中，获得重组
质粒 pET-28a-ldhL，将 pET-28a-ldhL 转化到利用木
糖生产 L-乳酸菌株 JH12［15，16］中实现 ldhL 的表达。
进一步用 7 L 的发酵罐初步检测 L-乳酸脱氢酶在 E.
coli JH12 中过量表达对 L-乳酸产量的影响，旨在为
高效利用木糖 JH12 的工业化应用的改造提供理论依
据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 菌株和质粒 L-乳酸脱氢酶（ldhL）来源菌
株 E. coli SZ85，Escherichia coli TG1 为实验室保存；E.
coli JH12 为本实验室构建及保存，质粒 pET-28a（含
有卡那霉素抗性基因）由实验室保藏，pMD-18T 载
体购于宝生物工程（大连）有限公司。
1.1.2 培养基和培养条件 LB 液体培养基（蛋白胨
10g/L 、酵母粉 5 g/L 、氯化钠 5 g/L）；LB 固体培养
基在 LB 液体培养基中加 20 g/L 的琼脂 ；培养 E. coli
TG1 的培养基中加 20 g/L 的葡萄糖作为碳源 ；培养
JH12 的 LB 培养基中加 20 g/L 木糖作为碳源。培养
条件 ：37℃，150 r/min。
1.1.3 酶和化学试剂 BamH I、Xho I 内切酶试剂，
pMD-18-T 载体、T4 DNA Ligase 购于宝生物工程（大
连）有限公司 ；DNA marker、 PCRMM 购于 Fermentas
公司，TBE 缓冲液购于上海双螺旋生物科技有限公
司 ；基因组提取试剂盒，质粒提取试剂盒，琼脂糖
凝胶 DNA 回收试剂盒购于 TIAN GEN BIOTECH 公
司 ；CaCl2·2H20 浓度为 1 mmol/L ；EB 工作浓度为
0.5 mg/L ；氨苄青霉素、卡那霉素在培养基中的工作
浓度都为 50mg/L。
1.2 方法
1.2.1 ldhL 的扩增 将重组大肠杆菌 SZ85 基因组
利用基因组提取试剂盒提取后，以乳酸片球菌 L-
乳酸脱氢酶基因（ldhL）序列两端设计引物，ldhL
基 因 的 扩 增 引 物 如 下 ：ldhL 基 因 上 游 引 物 ：5-
GCGGATCCATGTCTAATATTCAAAATCA -3，ldhL
基因下游引物 ：5-CGCTCGAGTTATTTGTCTTGTTTT-
TCAG-3， 带 有 下 划 线 的 碱 基 分 别 为 BamH Ⅰ 和
Xho Ⅰ 酶切位点。以提取的基因组为模板，对乳
酸脱氢酶进行扩增 ：95℃预变性 3 min ；94℃ 30 s，
45℃ 30 s，72℃ 3 min 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10
min。PCR 产物经 1% 琼脂糖电泳检测。
将 回 收 的 PCR 产 物 亚 克 隆 到 pMD18-T 连 接，
转化到大肠杆菌 TG1 中，筛选阳性转化子，将得到
的转化子进行质粒抽提，通过酶切和 PCR 验证。
1.2.2 重组质粒 pET-28a-ldhL 的构建及鉴定 将连
接有 ldhL 基因载体 pMD18-T 用 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ
双 酶 切 后， 回 收 ldhL（～ 1 kb） 基 因 的 片 段， 再
将此片段连接到经同样酶酶切的 pET-28a 上，得到
乳酸脱氢酶表达载体 pET-28a-ldhL。以 CaCl2 法将
pET-28a-ldhL 转化到大肠杆菌 JH12 中，所得转化子
经卡那霉素抗性筛选后，抽提阳性转化子质粒，酶
切验证目的基因是否已导入重组质粒 pET-ldhL 中。
1.2.3 ldhL 基因在重组大肠杆菌中的诱导表达 取
阳性转化子，并以转入 pET-28a 的 JH12 为对照，接
种于 5 mL 含卡那霉素抗性的 LB 培养基中，37℃培
养过夜，以 1% 的接种量接种于新鲜的培养基中，
2014年第4期 123罗璇等 ：乳酸片球菌 L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在重组大肠杆菌 JH12 中的过量表达
培养到 OD600 为 0.4-0.6 后加入 1 mmol/L IPTG，30℃
诱导 8 h。取 1 mL 菌液处理后进行 SDS-PAGE 电泳
分析。
1.2.4 7 L 发酵罐发酵检测 L-乳酸浓度 从平板上
分离出成功表达的重组大肠杆菌 JH12（pET-ldhL）
单菌落，以重组大肠杆菌 JH12 为对照。接入 LB
培养基（含有 100 μg/mL 卡那霉素）重组大肠杆菌
JH12（pET-ldhL） 中，200 r/min，37℃ 条 件 下 摇 瓶
培养。当种子菌体浓度（OD600）达到 1.0-1.5 左右，
以 5% 的接种量接于装有 4 L LB 培养基的 7 L 发酵
罐中，发酵罐条件：初始糖含量 7%，转速 200 r/min，
37℃，以 6 mol/L KOH 作为中和剂，采用流加方式
控制 pH 稳定在 7 左右。定时取样，检测 OD600 值、
木糖浓度、L-乳酸产量及其他杂酸浓度。
1.2.5 发酵产物分析 OD 值采用紫外分光光度计测
量，波长选定 600 nm；所取发酵液样品在 10 000 r/min
条件下离心 10 min，去除细胞残留，收集上清液用
于测定残糖及其他代谢产物的含量。残糖含量和有
机酸检测采用高效液相色谱法（HPLC）检测。检测
条件 ：Agilent 1200 series 反相高效液相色谱仪，色
谱柱为 Bio-Rad HPX 87H ；流动相 ：4 mmol/L H2SO4
（pH2.5）；流速 ：0.5 mL/min ；进样量 ：10 μL ；示差
检测器检测 ；柱温 ：35℃［17］。乳酸的光学纯度检
测条件为 Agilent 1200 series 反相高效液相色谱仪，
手性柱为 EC 250/4 NUCLEOSIL Chiral-1，紫外检测
器，波长 250 nm ；柱温 35℃，流动相为 0.2 mmol/L
CuSO4，流速为 0.5 mL/ min
［18］。
2 结果
2.1 ldhL基因的扩增
以大肠杆菌 SZ85 基因组 DNA 为模板，扩增 P.
acidilactici 的乳酸脱氢酶（ldhL）基因。经 1.0% 琼
脂糖凝胶电泳检测，结果见图 1，扩增片段大小与
预期大小相符。
将 PCR 产物纯化后与 pMD-18T 简易载体连接，
经抗性平板筛选、双酶切、PCR 扩增及序列分析鉴
定重组质粒，提取质粒经 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切
后，回收 ldhL 片段。
2.2 pET-28a-ldhL重组质粒的构建与鉴定
将 pET-28a 的 BamH I、 Xho I 双酶切体系酶切，
M ：分子量标准 Marker（λDNA/EcoR I/Hind Ⅲ）；1 ：ldhL 基因扩增产物
图 1 ldhL 基因 PCR 产物凝胶电泳图谱
21226
bp
5148
4973
2027
1375
947
1 M
564
与回收的 ldhL 片段在 T4 连接酶催化下连接，构建
重组质粒 pET-28a-ldhL，提取的质粒经 BamH I、 Xho
I 双酶切、电泳验证，结果见图 2，表明已成功构建
重组质粒，命名为 pET-ldhL。
M ：分子量标准 Marker（λDNA/EcoR I/Hind III）；1 ：空白质粒双酶切 pET-
28a（+）/BamH Ⅰ + Xho Ⅰ ；2 ：重组质粒 pET-ldhL / BamH Ⅰ + Xho Ⅰ
图 2 重组质粒 PET-ldhL 酶切验证电泳分析
21226
~5000
~1000
bp
5158
3530
2057
1375
947
831
1 2
564
2.3 SDS-PAGE分析
将含有重组质粒的 E.coli JH12 在 LB 培养基中
培养，当菌体进入对数生长期时加入 IPTG 诱导，收
集菌体处理后进行 SDS-PAGE 电泳，结果如图 3 所示，
表明重组菌株 JH12 与对照菌株相比，有明显的特征
蛋白带出现，分子量大小约为 39 kD，除去融合表达
前端的整合标签，与文献报道［9］的分子量一致，表
明外源的 ldhL 在重组大肠杆菌中得到有效的表达。
2.4 7 L发酵罐发酵试验
为了初步了解重组菌株 E. coli JH12（pET-ldhL）
相对于出发菌株在发酵罐中产 L-乳酸的水平，采用
带有 pH 自动调节器的 7 L 发酵罐为反应器进行厌氧
发酵培养。采用 LB 液体培养基，装液量为 4 L，初
始糖浓度为 7%，控制发酵罐转速为 200 r/min，温
度为 37℃，发酵过程中用 6 mol/L KOH 作为中和剂。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期124
由图 4-A 可以看出，重组菌株 E. coli JH12（pET-
ldhL）和出发菌株 E. coli JH12 都在 36 h 达到生物量
的最大值，重组菌株 E. coli JH12（pET-ldhL）的生
长比出发菌株 E. coli JH12 在前 24 h 相对较快，在之
后的 12 h E. coli JH12（pET-ldhL）生长缓慢，到 36
h 菌体总量小于出菌株。
由图 4-B 可以看出，两株菌在整个发酵过程中
呈现出相同的产酸趋势，在 24-30 h 之间乳酸生成
速率最大，约在 84 h 乳酸生成速率趋于平稳，此时
乳酸积累量达到最大。重组菌株 E. coli JH12（pET-
ldhL）产酸能力相对于出发菌株 E. coli JH12 略有增
强，经 96 h 发酵，E. coli JH12（pET-ldhL）最终乳
酸的积累量为 64.86 g/L，相对于 E. coli JH12（55.09
g/L）增长了约 10 g/L。
在整个产酸过程中，乳酸生成的最大速率相差
不大，都在 30 h 左右乳酸生成速率最大，约为 1.60
g/（L·h）；到 96 h 发酵结束，E. coli JH12（pET-ldhL）
木糖的残余量为 4.81 g/L，明显低于对照菌株 13.73
g/L，两株菌的糖酸转化率都在 96% 左右。整个产酸
过程中，两菌株木糖的最大消耗率约为 1.0 g/（L·h）。
菌株 E. coli JH12（pET-ldhL）保持了 E. coli JH12 杂
酸少的优点，整个过程中，乙酸产量始终保持在 1 g/L
以下。
2.5 L-乳酸的光学纯度
取发酵培养得到的菌液经过过滤处理后，在高
效液相色谱上利用手心柱分离，在液相图谱上只有 L-
乳酸的峰出现。而在 L-乳酸标准品中添加 0.5% 的 D-
乳酸标准品，可以观察到 D-乳酸的峰。结果表明菌
液中的 L-乳酸纯度高于 99.5%。
3 讨论
国内外关于利用代谢工程的方法生产 L-乳酸
报道并不少见。1999 年 Chang 等［18］将干酪乳杆菌
L. casei 的 ldhL 基因转入磷酸转乙酰酶（pta）和 D-
乳酸脱氢酶（ldhA）双缺失大肠杆菌中，获得的菌
株 RR1 经过两阶段发酵得到 45 g/L L-乳酸 ；2001 年
Dien［12］ 将 Streptococcus bovis 的 ldhL 引 入 大 肠 杆 菌
中，在 10% 的木糖发酵中得到 63 g/ L 的 L-乳酸 ；为
了提高乳酸脱氢酶的活力进而提高乳酸的产量，2010
年 Mulok 等［11］将 Enterococcus facelis KK1 的 ldhL 基
因转入自身染色体被插入 P. acidilactici 的 ldhL 基因
的 E.coli SZ85（ △ focA-pfLB、 △ frdBC、 △ adhE、
△ ackA、△ ldhA∷ldhL）中，实现 L-乳酸脱氢酶的
过量表达，最终在 1 g 果糖中实现 0.62 g/L 的乳酸生
产。研究都能从一定层面上反映了在大肠杆菌中引
入 L-乳酸脱氢酶的可能性，并能得到较高浓度的 L-
乳酸，同时国内的相关技术也可以实现 L-乳酸脱氢
M ：蛋白质分子质量标准 ；1 ：E.coli JH12（pET-28a）（+）；
2 ：E.coli JH12（pET-ldhL）
图 3 重组质粒 pET-ldhL 表达产物的 SDS-PAGE 分析
116
kD
M 1 2
66.2
45
35
25
18.4
14.4
6048
Time h 3624120
0
10
20
30
40
50
60
70
La
ct
ic
a
ci
d
pr
od
uc
tio
n g/
L
72 84 96
6048
Time h 3624120
0
1
2
3
4
5
B
A
O
D
60
0
72 84 96
Ƶ E. coli JH12（PET-ldhL）ƻ E. coli JH12
Ƶ E. coli JH12（PET-ldhL）ƻ E. coli JH12
A ：两菌株 OD600 ；B ：两菌株乳酸含量
图 4 70 g/L 木糖发酵结果
2014年第4期 125罗璇等 ：乳酸片球菌 L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在重组大肠杆菌 JH12 中的过量表达
酶在大肠杆菌中表达。L-乳酸脱氢酶的过量表达促
使菌株在代谢过程中的碳源流入生成乳酸的途径，
从而使糖酵解过程中的流入三羧酸循环的碳源减少，
最终导致细胞生物量的减少［19］。2011 年袁剑等［4］
将 干 酪 乳 杆 菌 G-02（Lactobacillus casei G-02）ldhL
基因的转入大肠杆菌 BL21（DE3）中实现 L-乳酸脱
氢酶的表达，并对 L-乳酸脱氢酶的活性进行了研究。
2008 年，杨登峰等［10］将鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus
rhamnosus）的 ldhL 基因转入 ldhA 和 pflB 双缺失的
大肠杆菌 FMJ144，发酵得到 3.5 g/L L-乳酸 ；于振海
等［20］于 2010 年将丙酮丁醇梭菌 ldhL 基因转入到大
肠杆菌 FMJ144 中，发酵得到 2.4 g/L L-乳酸。和国
外相比，同内的乳酸积累量都处于较低水平，出发
菌株高纯度生产乳酸不够成熟，杂质多不易分离。
研究以实验室自主构建的工程菌 JH12 为出发
菌株，该菌株通过 Red 重组系统敲除了乳酸生产的
竞争性途径中的 5 个基因（ΔfrdBC，ΔldhA，ΔackA，
ΔfocA-pfLB，ΔadhE）并通过染色体插入法插入了 P.
acidilactici 的 ldhL 基因，利用木糖高效率生产 L-乳
酸，发酵液中 L-乳酸的含量占有机酸的总量的 95%
以上，为了进一步提高 L-乳酸的产量，试图通过过
量表达催化丙酮酸生成 L-乳酸的关键酶基因——L-
乳酸脱氢酶基因来实现。
4 结论
研究以 E.coli SZ85 基因组为模板克隆乳酸片球
菌的 L-乳酸脱氢酶基因，通过一系列纯化过程后
与表达载体 pET-28a 连接，构建了重组质粒 pET-
28aldhL ；将重组质粒转入到工程菌 E.coli JH12 中，
实现 P. acidilactici 的 L-乳酸脱氢酶基因的过量表
达。在 7% 木糖浓度的 7 L 发酵罐中厌氧发酵培养比
较过量表达前后乳酸积累量，结果表明过量表达 P.
acidilactici 的 L-乳酸脱氢酶菌株相对于出发菌株 L-
乳酸产量有明显提高。
参 考 文 献
［1］ 白冬梅 , 赵学明 , 李鑫钢 , 徐世民 . 米根霉发酵生产 L（+）-乳
酸研究进展［J］. 现代化工 , 2002, 22（6）：9-13.
［2］ Wee YJ, Kim JN, Ryu HW. Biotechnological production of lactic
acid and its recent applications［J］. Food Technology and
Biotechnology, 2006, 44（2）：163-172.
［3］ Zhou S, Shanmugam KT, Ingram LO. Functional replacement of the
Escherichia coli d-（-）-lactate dehydrogenase gene（ldhA）with
the l-（+）-lactate dehydrogenase gene（ldhL）from Pediococcus
acidilactici［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2003,
69（4）：2237-2244.
［4］ 袁剑 , 秦浩 , 葛向阳 , 张伟国 . 干酪乳杆菌 L-乳酸脱氢酶在大
肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质［J］. 微生物学通报 , 2011,
38（10）：1482-1487.
［5］ Taniguchi M, Tokunaga T, Horiuchi K, et al. Production of L-lactic
acid from a mixture of xylose and glucose by co-cultivation of lactic
acid bacteria［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004,
66（2）：160-165.
［6］ Yang CW, Lu Z, Tsao GT. Lactic acid production by pellet-form
Rhizopus oryzae in a submerged system［J］. Applied Biochemistry
and Biotechnology, 1995, 51（1）：57-71.
［7］ Iyer PV, Thomas S, Lee YY. High-yield fermentation of pentoses into
lactic acid［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2000, 84
（1）：665-677.
［8］ Zhou S, Causey TB, Hasona A, et al. Production of optically pure D-
lactic acid in mineral salts medium by metabolically engineered Esc-
herichia coli W3110［J］. Applied and Environmental Microbiology,
2003, 69（1）：399-407.
［9］ 黄彦 , 韦宇拓 , 张黎 , 等 . 乳酸片球菌 L-乳酸脱氢酶基因的克
隆及在大肠杆菌中的表达［J］. 应用与环境生物学报 , 2006,
12（1）：68-71.
［10］ 杨登峰 , 潘丽霞 , 关妮 , 黄日波 . 产高纯度 L-乳酸大肠杆菌
基因工程菌的初步研究［J］. 现代食品科技 , 2010, 26（2）：
126-128.
［11］ Mulok T, Chong M, Yoshihito S, et al. Engineering of E. coli for
increased production of L-lactic acid［J］. African Journal of
Biotechnology, 2010, 8（18）：4597-4603.
［12］ Dien BS, Nichols NN, Bothast RJ. Recombinant Escherichia coli
engineered for production of L-lactic acid from hexose and pentose
sugars［J］. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,
2001, 27（4）：259-264.
［13］ Dien BS, Nichols NN, Bothast RJ. Fermentation of sugar mixtures
using Escherichia coli catabolite repression mutants engineered for
production of L-lactic acid［J］. Journal of Industrial Microbiology
& Biotechnology, 2002, 29（5）：221-227.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期126
［14］ Wyckoff HA, Chow J, Whitehead TR, Cotta MA. Cloning,
sequence, and expression of the L-（+）lactate dehydrogenase of
Streptococcus bovis［J］. Current Microbiology, 1997, 34（6）：
367-373.
［15］ 赵锦芳 , 许丽媛 , 王永泽 , 等 . 利用五碳糖产高纯度 L-乳酸
大肠杆菌基因工程的构建［J］. 微生物学报 , 2013, 53（4）：
328-337.
［16］ 许丽媛 , 赵锦芳 , 王永泽 , 等 . 重组大肠杆菌利用木糖产高纯
度 L-乳酸的研究［J］. 生物加工过程 , 2013, 11（3）：24-28.
［17］ Wang Y, Tian T, Zhao J, et al. Homofermentative production
of d-lactic acid from sucrose by a metabolically engineered
Escherichia coli［J］. Biotechnology Letters, 2012 ：DOI 10.1007/
s10529-012- 1003-7.
［18］ Chang DE, Jung HC, Rhee JS, Pan JG. Homofermentative
production of d-orl-lactate in metabolically engineered Escherichia
coli RR1［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65
（4）：1384-1389.
［19］ Wang D, Li Q, Li W, et al. Improvement of succinate production
by overexpression of a cyanobacterial carbonic anhydrase in
Escherichia coli［J］. Enzyme and Microbial Technology, 2009,
45 ：491-497.
［20］ 于振海 , 杨登峰 , 郭媛 , 等 . 丙酮丁醇梭菌 ldhL 基因的克隆及
其在大肠杆菌中的表达［J］. 生物技术通报 , 2010（3）：81-
84.
（责任编辑 李楠）