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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
SNP 是人类基因组中大量存在的单个核苷酸的
变异。在分子水平上，SNP 影响基因的转录、翻译
及翻译后蛋白质的折叠，从而引起基因功能的改变
以及个体间和群体间对疾病的易感、抵抗程度、药
物反应和遗传表型的差异［1，2］。
作为第三代 DNA 遗传标记，SNP 具有分布广、
数量大、易于检测和在基因组中相对稳定的特点，
这一巨大优势使其成为疾病研究特别是多基因疾病
研究领域中的热点。目前，常用的 SNP 检测方法虽
收稿日期 ：2013-07-01
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31200979），福建省自然科学基金项目（2011J 05080），泉州市科技技术研究与发展项目（2011Z5）
作者简介 ：王清瑶，女，硕士，研究方向 ：与痛风相关 SNP 的多态性分析 ；E-mail ：qyao_2007shy@163.com
通讯作者 ：杨会勇，助理研究员，研究方向 ：分子诊断，基因药物 ；E-mail ：shyhy@hqu.edu.cn
等位基因特异性扩增法在 SNP 分型中的研究进展
王清瑶  饶华春  刁勇  杨会勇
（1. 华侨大学分子药物研究院，泉州 362021 ；2. 华侨大学生物医学学院，泉州 362021）
摘 要 ： 单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）因其分布广、数量大而在疾病研究特别是多基因疾病研究
领域显示出巨大的优势，因此临床研究和诊断需要一种快速、简易、准确、经济的 SNP 检测方法。近年来，等位基因特异性扩增
法（Allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR）因其操作简单、成本低廉和结果准确而在 SNP 检测领域显示了巨大应用潜力，
并受到越来越多相关科研和医务工作者的关注。系统的对 AS-PCR 技术在 SNP 分型中的研究进展和应用作了全面综述，对其发展
方向和应用前景进行了展望。认为通过与其他检测平台联合，AS-PCR 可促进 SNP 检测技术由实验室向临床应用转化的进程，为
诸多疑难疾病的防治提供新的思路和参考。
关键词 ： 单核苷酸多态性 基因分型 等位基因特异性扩增
Recent Development of Allele-specific Amplification in
SNP Genotyping
Wang Qingyao Rao Huachun Diao Yong Yang Huiyong
（1. Institute of Molecular Medicine，Huaqiao University，Quanzhou 362021 ；2. Biomedical Sciences，
Huaqiao University，Quanzhou 362021）
Abstract:  Single nucleotide polymorphism（SNP）shows huge advantages in disease research, especially in the multi-gene diseases
because of its wide distributions and large quantities. Clinical diagnosis and research need a fast, simple, accurate and economical method to
detect SNP. In recent years, Allele-specific polymerase chain reaction（AS-PCR）have been concerned by more and more researchers and
medical workers due to its simplicity, low cost, accuracy and a great potential. Based on the reasearch results, this paper reviewed the latest
development and applications of As-PCR in genotyping as well as its prospects. AS-PCR combined with other detection platforms, could promote
the conversion process of SNP detection to clinical applications and provide new ideas and references for prophylaxis and treatment in various
difficult diseases.
Key words:  Single nucleotide polymorphism Genotyping Allele-Specific amplification
然检测通量高，但存在成本高、操作繁琐、对相关
操作人员要求高的特点，因此 SNP 与疾病的相关性
研究多局限在实验室。但以实验室为主体的 SNP 分
型检测研究仍存在着临床样本收集困难、储藏不便
和交叉污染等问题，而且检测样本不足则使得 SNP
基因型与相关疾病的分析易出现偏差［3］。因此，
SNP 检测及 SNP 基因型与疾病风险关联研究要想有
较大突破，需要开发一种快速、简易、准确、经济
的 SNP 检测方法以推进基因分型和检测向临床诊断
2013年第12期 63王清瑶等 ：等位基因特异性扩增法在 SNP 分型中的研究进展
的转变。
目前 SNP 分型的方法很多，理想的分型方法应
具备以下条件 ：（1）针对目标位点的检测快速简单 ；
（2）开发成本低，优化时间短 ；（3）反应体系稳定，
样品质量要求低 ；（4）数据分析简单准确 ；（5）高
通量，自动化。等位基因特异性扩增法（Allele-specific
polymerase chain reaction，AS-PCR） 自 提 出 以 来 一
直应用于 SNP 检测领域，正在快速发展为一种简单
快捷、准确和成本低廉的 SNP 检测平台。当前 AS-
PCR 已实现 SNP 单管多重检测，还实现了血样和组
织样本等样品不经过基因组提取直接检测 SNP。AS-
PCR 通过与 real-time PCR 等技术平台联合应用可实
现 SNP 的实时和高通量检测，为临床基因分型检测
提供了一种快捷、准确的方法，加速基因分型检测
向临床诊断的演变，以及为临床诊断和个体化用药
提供了依据。
1 三引物的 AS-PCR 提出
AS-PCR 是 由 Ugozzoli 和 Wallace［4］ 于 1991 年
创立的一种检测单碱基突变的方法，最初直接用于
镰状细胞性贫血的诊断。由于 Taq 酶无 3 → 5 外切
酶活性，当引物 3-末端与模板发生错配时，Taq 酶
以低于正常配对未端的速度延伸，当错配的碱基数
目达到一定程度或 PCR 条件达到一定的严谨程度时，
3-末端碱基错配的引物则不能延伸，PCR 反应终止。
因此设计对应 SNP 位点的 2 条特异性引物，在两管
中分别与通用引物发生反应，只有当 3-末端碱基与
等位基因互补时，延伸反应才能发生。
AS-PCR 的高灵敏性和高特异性后来也被用于
分析恶性淋巴瘤和骨髓瘤的基因序列［5］，区分瑟氏
泰勒虫等病原体的种属［6］，研究 CYP2C19 代谢酶等
基因多态性位点的基因型分布及频率［7］，以及研究
D816V 等耐药基因的突变对系统性肥大细胞增多症
的影响［8］等方面。
2 AS-PCR 单管 SNP 检测技术的实现
2.1 三引物AS-PCR的优化
实现 AS-PCR 对 SNP 的单管检测要以长度不同
的特异性产物作为基因型判断的依据，因此特异性
引物的设计成为关键。
Bassam 和 Amal［9］设计特异性的引物 P1、P2 时，
在 P2 5-末端多一条 15 bp 的 AT 尾巴，两条特异性
引物和通用引物在同一管中反应就可以得到不同长
度的特异性产物，从而达到基因分型的目的。因此，
Bassam 和 Amal 在 分 析 不 同 人 群 中 醌 氧 化 还 原 酶
Ⅰ SNP 位点 C609T 的基因频率时，采用单管反应得
到了与 C 等位基因配对的 75 bp 特异性扩增产物和
与 T 等位基因配对的的 90 bp 特异性扩增产物，实
现了 AS-PCR 对醌氧化还原酶Ⅰ SNP 位点基因型的
单管检测，分型结果与限制性内切酶片段长度多态
性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）
法一致，且对模板和酶切位点没有限制。
2.2 四引物AS-PCR
目前，国内外常用的单管 PCR 反应基因分型
方法是两对交叉引物 PCR（PCR with confronting two-
pair primers，PCR-CTPP）［10］，又称四引物扩增受阻
突 变 体 系 PCR（Tetra-primer amplification refractory
mutation system PCR，Tetra-primer ARMS PCR）［11］，
简称四引物扩增法。它是在 AS-PCR 的基础上针对
已知的 SNP 位点，在其两侧设计一对外引物（W1，
W2）和一对特异性内引物（N1，N2），其中 W1 与
N1 同向内，W2 与 N2 同向。内引物的 3-末端落在
突变位点上，外引物 W1W2 扩增出的产物作为 PCR
反应的阳性对照，而 W1N2、W2N1 扩增出的特异性
片段作为 SNP 分型的依据。
Stephan 等［12］在研究类风湿性关节炎的细胞因
子 LTA + 252 C>T 的多态性时，比较了 RFLP、四引
物 AS-PCR 和溶解曲线 3 种检测方法的实用性发现，
3 种检测方法与测序法的检测结果一致，但从成本、
时间和设备考虑，四引物 AS-PCR 更适合常规实验
室的检测。
2.3 五引物AS-PCR
在理想状态下，所有外引物引导的延伸都会阻
碍同向内引物引导的延伸，导致内引物引导的扩增
指数增长期滞后（尤其对于离外引物近的内引物），
特异性产物产量相对较低［11，13］。
基于五引物的 AS-PCR 是在四引物扩增法的基
础上，对两条内引物 5-末端加一段与模板 DNA 不
匹配的“尾巴”作为锚定引物，同时引入与内引物
的 5-末端尾巴序列完全一致的第 5 条特异性扩增辅
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期64
助引物。在 PCR 反应的最初循环，该引物不起作用，
一旦内引物中的任一条或两条同时与模板结合并延
伸，与之相对应的外引物向其 5-端方向延伸，就形
成了一段可以与“尾巴”完全互补的序列，在以下
的循环延伸反应中，将以此片段为模板，在第 5 条
辅助引物和外引物的作用下进行 PCR，克服了三引
物 AS-PCR 和四引物 AS-PCR 因人工错配碱基的引
入而产生的特异性条带减弱的现象［14，15］。
在测定多态性位点 CYP2D6 ＊ 10 的基因类型时，
卜莹等［15］利用五引物 AS-PCR 实现了单管一次性
扩增对基因型的判断。在 47 份样品的检测中，随机
抽取 20 份样品与 RFLP 法进行比较，检测结果完全
一致。
3 AS-PCR 的 SNP 多重检测技术的建立
3.1 简单的三引物、四引物AS-PCR
通过优化体系，Hang 等［16］在痛风相关 SNP 位
点 rs2231142、rs165205 和 rs16890976 的研究中，建
立了三重 AS-PCR 检测，为痛风相关 SNP 筛查和早
期诊断建立了一种高效的方法。Piccioli 等［17］则建
立了两重的四引物 AS-PCR，分析了结肠癌相关 SNP
位点的基因型和基因分布。Rees 和 Lajin 等［18-20］进
一步用甜菜碱优化扩增体系，建立了三重的四引物
AS-PCR 检测。随后，刘颖等［21］在检测了卵巢癌相
关 SNP 位点 rs608995 和 rs749292 时，引入嵌合引物，
有效地降低了内外引物扩增效率不一致造成的扩增
偏向性［22］，进一步扩展了多重四引物扩增法的应用
范围。
3.2 基于适配器的AS-PCR
为了能更好地提高 AS-PCR 基因分型的通量，
孙晓如等［23］建立了基于适配器的 AS-PCR。首先是
通过 PCR 预扩增得一段含 n 个待测 SNP 位点的长片
段，然后用限制性内切酶将其消化成短片段，再在
连接酶的作用下与设计的 DNA 适配器相连，随后再
以连接产物为模板，在两管中分别用不同的 n 条等
位基因特异性引物和一条公用引物进行 n 重等位基
因特异性扩增，最后根据两管扩增产物的分子量判
断 SNP 的基因型。
基于适配器的 AS-PCR 有效地提高了检测通量，
因此可以作为一种准确可靠且费用低廉的 SNP 筛查
方法。Zhang 等［24］利用此方法筛选出了可以作为苯
毒易感的生物标记的 SNP 位点 ；Pollegioni 等［25］也
用此方法对病害有抗性的植株的 SNP 位点的 72 种
基因型进行测定，完成了同种不同属的植物因多个
SNP 而对病害的易感性不同的研究。
3.3 基于微阵列和毛细管检测的AS-PCR
AS-PCR 与微阵列芯片和毛细管电泳检测相结
合， 也 有 效 地 提 高 了 分 型 通 量。Choi 等［26，27］ 将
AS-PCR 与微阵列芯片和毛细管电泳检测相结合，分
别建立了 11 重和 12 重的 AS-PCR 检测平台，90 min
就完成了进口牛的种系鉴别。 Chen 等［28］选取有
家族遗传背景的人群为研究对象，用 AS-PCR 微阵
列芯片寻找氨基糖苷类抗生素引发的非综合性耳聋
的致病基因。CYP2D6 是人体中重要的药物代谢酶，
直接关系着药物在人体中的吸收效率和毒副作用。
Liao 等［29］在研究亚洲人群 CYP2D6 的药物代谢的
个体差异性时，运用 AS-PCR 毛细管电泳实现了 6
重检测，进一步推动了临床个体化用药及药物安全
体系的建立。
4 AS-PCR 对血样和组织样本的 SNP 分型
实验室通常面临检测样本收集困难、储藏不便
和交叉污染等方面的问题，因此检测模板普及到血
样和组织对 AS-PCR 的进一步发展有着至关重要的
意义。但研究表明血液中的血红蛋白和乳铁蛋白包
含的铁离子及其衍生物会严重干扰 DNA 的合成［30］；
亚 铁 红 素 会 直 接 作 用 于 DNA 聚 合 酶， 成 为 靶 向
DNA 模板的竞争性抑制剂［31］；抗凝剂肝素和 EDTA
也对扩增产生抑制作用［30，32］。
然而目前，人们利用缓冲液 PCR Master Mix［33］
和 Cocktail PCR Buffer 已成功以血样和组织为模板
进行了扩增［34］；Tth polymerase 等突变的 Taq DNA
聚合酶也可以在含有高达 30%（V/V）血样的反应
体系中实现扩增［34，35］；增强剂牛血清蛋白（BSA）
可减少 PCR 反应系统中内源抑制物的干扰［36］；海
藻糖可以在高温及干燥失水的环境下在细胞表面形
成独特的保护膜，在高温下有效地保护酶的正常活
性［37］；海藻糖与 1，2-丙二醇联合应用甚至还可以对
高 GC 含量血样和组织模板进行扩增［38］。
现在国内外已经实现了以外周静脉血或滤纸
2013年第12期 65王清瑶等 ：等位基因特异性扩增法在 SNP 分型中的研究进展
干血为检测模板的 AS-PCR［39］。游玉权和杨会勇
等［40，41］以外周静脉血为检测模板，寻找闽南地区
可作为痛风独立遗传标记的 SNPs。Zhu 等［42］在研
究胃肠道肿瘤相关的 SNPs 时，分别实现了对血样的
三重、五重和八重检测，若与 96 或 384 孔板检测平
台或微阵列技术结合可进一步增加 AS-PCR 检测的
通量。
技术的不断突破使 AS-PCR 向临床应用更近了
一步。像 HIV、HCV 等传染性疾病样本，滤纸干血
就可以实现样本的零冷冻运输，还可以防止样本间
的交叉污染［43，44］。因此，在环太平洋岛屿暴发登革
热疫情时，滤纸干血就对样本采集和检测提供了很
大便利［45］。即使长时间放置的干血试纸仍可以用于
疾病的诊断和基因型的检测，而且保持着很高的特
异性和灵敏性［46］。
5 AS-PCR 与 Real-time PCR 的联用
新出现的根据扩增产物的 Tm 值进行基因分
型的高分辨熔解曲线法给 AS-PCR 提供了一个发展
思路。精心设计引物可以使特异性产物的 Tm 值不
同，实现 AS-PCR 与 Real-time PCR 的相结合。引入
Touchdown 热循环可进一步提高扩增特异性，放大
特异性引物之间的扩增效率的差异，而这种差异可
被 Real-time PCR 直观的呈现在 ΔCt 值上。
Casado-Díaz 等［47］在 225 个绝经妇女骨质疏松
症的研究中，将 AS-PCR 的一条特异性引物 5-末端
连接一段 GC 尾巴以扩大特异性产物间的溶解温度的
差异，便于在 Real-time PCR 扩增后快速、直观的对
3 个 SNP 进行基因分型。Takagi 等［48］将 touchdo-wn
热循环运用到 allele-specific real-time PCR 中，根据
ΔCt 值具体区分 SLC22A12 基因中 W258X 和 R90H
SNP 位点的基因分布，对 W258X 和 R90H 基因的起
源作出推断。AS-PCR 与 real-time PCR 相结合不仅
实现了对 SNP 的实时检测，相对于 Taqman 探针还
减少了试验成本，适合于中小型通量的基因筛查。
6 展望
目前大部分 SNP 分型检测有两个趋势 ：一是适
用于大型实验室的高通量 SNP 检测与分析 ；一是适
用于众多中小型实验室和临床机构的低成本、简单
简便的方法。无论何种方法，一个 SNP 检测平台的
研究与建立都要与测序或 RFLP 等现存的较为成熟
的方法比较其可行性、适用性、灵敏性和准确性。
随着当前科研和临床的需要，以及各种分型方法的
不断发展和完善，AS-PCR 方法与其他 SNP 检测方
法之间的联合应用已成为一种趋势，今后各分型方
法也将各取所长更好地满足各类实验室的需求。
AS-PCR 方法的发展和完善可以促进 SNPs 检测
从实验室走向临床应用，也将推动疾病相关 SNPs 的
筛选和易感性研究，进而揭示疾病的发病机制和发
展历程，为疑难病症特别是家族遗传性疾病的早期
诊断和筛查提供参考。
将与疾病明确关联的 SNPs 的基因检测与基因
诊断体系接轨，可使临床医学从表型诊断向基因型
诊断过渡。进而结合有关生化代谢过程的研究，可
进一步探讨 SNPs 及其表型与药物治疗的疗效、预后
和不良反应的关系，进而根据个体的遗传背景来优
化药物治疗方案，指导个体化用药，达到最佳的治
疗目的。由于基因多态性有区域分布性，因此可以
充分利用现代网络系统建立 SNPs 基因型与相关疾病
关联的数据库系统，促进疾病早期诊断和用药安全
体系的建设。
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（责任编辑 狄艳红）