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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
Rho GTP 酶家族包括一类分子量为 20-30 kD 的
GTP 结合蛋白，该家族成员众多，含有由 21 个基
因编码的至少 23 个蛋白质［1］。Rac1 属于 Rho GTP
酶家族成员之一，全名为 Ras 相关 C3 肉毒素底物 1
（ras-related C3 botulinum toxin substrate1），参与细胞
增殖、生长、细胞骨架重构、蛋白激酶激活等广泛
的细胞事件。Rac1 在体内多种细胞类型中广泛表达，
收稿日期 ：2012-12-17
基金项目 ：江苏省自然科学基金资助项目（BK2011094）
作者简介 ：段桂华，男，硕士研究生，研究方向 ：消化病学 ；E-mail ：dghfjn@163.com
通讯作者 ：诸葛宇征，男，硕士，教授，研究方向 ：消化病学 ；E-mail:yuzheng9111963@yahoo.com.cn
改良重叠区扩增法构建 Rac1 相关质粒
段桂华  沈姗姗  诸葛宇征
（南京大学医学院附属鼓楼医院消化科，南京 210008）
摘 要 ： 采用改良重叠区扩增法实现 Rac1 基因定点突变，构建人 Rac1 基因相关真核表达质粒，观察 EGFP-Rac1 融合蛋
白在人正常肝细胞 LO2 中的表达。利用 RT-PCR 的方法得到 Rac1 基因，使用改良重叠区扩增法实现 Rac1 基因的定点突变，获得
Rac1 突变基因。将 Rac1 基因及 Rac1 突变基因通过限制性酶切技术及 DNA 连接技术插入真核表达载体 pEGFP-C1 中，获得重组
质粒 pEGFP-C1-Rac1，pEGFP-C1-Rac1V12 和 pEGFP-C1-Rac1N17。将上述质粒瞬时转染入 LO2 细胞中，采用荧光技术及 Western
blotting 检测目的基因的表达。结果显示，限制性酶切及基因测序证实质粒构建正确，转染 LO2 细胞后，融合蛋白 EGFP-Rac1 在细
胞中高效表达。成功构建真核表达质粒，在 LO2 细胞中，该质粒能成功表达融合蛋白 EGFP-Rac1。
关键词 ： Rac1 重叠区扩增法 基因定点突变 融合蛋白
Construction of Rac1 Related Plasmids by
Improved Overlap Extension
Duan Guihua Shen Shanshan Zhuge Yuzheng
（Department of Gastroenterology Gulou Hospital Affiliated to Medical College of Nanjing University，Nanjing 210008）
Abstract:  Construct plasmids contains Rac1 and Rac1 mutant gene by improved Overlap extension and observe the expression of EGFP-
Rac1 in hepatocyte LO2. Rac1 gene was cloned by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, Rac1 mutant gene was generated by site-
directed mutagenesis which was carried out by improved overlap extension. Both Rac1 gene and Rac1 mutant gene were inserted into the pEGFP-
C1 vector, three recombinant plasmids ：pEGFP-C1-Rac1, pEGFP-C1-Rac1V12 and pEGFP-C1-Rac1N17（constitutively active mutation
Rac1V12 as Gly at codon 12 of Rac1 CDS is mutated into Val, and dominant negative mutation Rac1N17 as Thr at codon 17 is mutated into
Asn.）were constructed. All kinds of plasmids were transfected into LO2 cells, Expression of EGFP was examined by fluorescence microscope,
and exogenous EGFP-Rac1 fusion protein was determined by Western blotting. Three recombinant plasmids were verified by double digestion
and gene sequencing. Exogenous EGFP-Rac1 fusion protein was highly expressed in cells transfected by three recombinant plasmids. Three
recombinant plasmids which can express EGFP-Rac1 protein in LO2 cell were successfully constructed.
Key words:  Rac1 Overlap extension Site-directed mutagenesis Fusion protein
具有调节肌动蛋白细胞骨架重组，导致细胞板状伪
足形成和膜褶皱样运动，影响细胞形体极化，促进
细胞运动与迁移，抑制细胞凋亡等作用［2］。Ridely
等［3］发现了能分别上调和下调 Rac1 活性的突变体，
分别为持续激活型突变体 Rac1V12 和显性负调控型
突 变 体 Rac1N17。 与 Rac1V12 结 合 的 GTP 不 能 被
GTPase 活化蛋白（GAP）水解，因此可持续向效应
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期178
器发出信号，有持续激活的效果 ；Rac1N17 和鸟嘌
呤核苷酸交换因子（GEFs）结合后抑制其与下游效
应器的相互作用，发挥负调控的作用。本研究拟采
用改良重叠区扩增法实现基因定点突变得到人 Rac1
突变基因 Rac1V12 和 Rac1N17，将其插入真核表达
载体 pEGFP-C1 中，构建人 Rac1 相关质粒，并观察
其在肝细胞 LO2 中的表达，为进一步研究 Rac1 基
因在肝细胞中的功能奠定技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料
人正常肝细胞系 LO2、质粒 pEGFP-C1 由本实
验室保存。Trizol 总 RNA 纯化试剂盒购自 Invitrogen
公 司。 限 制 性 内 切 酶、 高 保 真 DNA 聚 合 酶、RT-
PCR 试 剂 盒 均 购 于 TaKaRa 公 司。 转 染 脂 质 体
Translipid 购于百斯凯公司。鼠抗人 Rac1 单克隆抗
体购于 Abcam 公司。辣根过氧化物酶（HRP）标记
的羊抗鼠 IgG-HRP 购于联科生物公司。PCR 引物合
成由上海生工公司完成，DNA 测序由上海华大基因
公司完成。
1.2 方法
1.2.1 Rac1 真核表达质粒的构建 收集对数生长
期 LO2 细 胞， 用 Trizol 裂 解 细 胞， 并 根 据 试 剂 盒
说 明 提 取 细 胞 总 RNA。 以 此 总 RNA 为 模 板， 按
TaKaRa 公司 RT-PCR Kit 试剂盒说明书将总 RNA 逆
转为 cDNA。以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，上游
引物为 R1，下游引物为 R2，PCR 产物经 EcoR Ⅰ
和 BamH Ⅰ两种限制性内切酶消化后，连接到经相
同限制性内切酶酶切的真核表达载体 pEGFP-C1 中，
并与载体上的绿色荧光蛋白（EGFP）编码序列重组，
所得质粒命名为 pEGFP-C1-Rac1，酶切鉴定后送上
海华大公司测序。
1.2.2 Rac1 突变体真核表达质粒的构建 由于 Rac1
的两个突变体分别是第 12 位密码子由 GGA 突变为
GTA，17 位的由 ACT 突变为 AAT，因此我们采用了
改良重叠区扩增法通过三步 PCR 实现基因定点突变
（图 1）。PCR-A ：以逆转录产物 cDNA 为模板，通过
P3+P5 引物（表 1）扩增出 Rac1V12 上游片段。PCR-B：
以逆转录产物 cDNA 为模板，通过 P2+P4 引物扩增
出 Rac1V12 下游片段。PCR-C ：由于上游片段的 3
末端和下游片段的 5 末端有 30 bp 左右互补配对序
列，切胶回收两个 PCR 产物，互为引物与模板进
行重叠延伸，并用引物 P1 和 P2 将其扩增。PCR 产
物经纯化后用限制性内切酶 EcoR I 和 BamH I 酶切，
然后连接到经相同酶切的载体 pEGFP-C1 中，所得
质粒命名为 pEGFP-C1-Rac1V12。酶切鉴定后送上海
华大公司测序。相同方法构建 pEGFP-C1-Rac1N17。
3˃ 5˃
5˃
5˃
5˃
5˃
5˃
5˃5˃
5˃
3˃
3˃ 3˃
3˃
3˃
3˃
3˃
3˃
P3
P5 P2
P4
cDNA
PCR-A
PCR-C
ᔦը

P1+P2ᢙ໎
B
A ǃBਈᙗ䘰⚛ਾ㔃ਸ
PCR-B P2+P4
P3+P5
A
图 1 改良重叠区扩增法示意图
1.2.3 荧光显微镜观察 将对数生长期 LO2 细胞以
每孔 2×105 个细胞接种于 6 孔细胞培养板，37℃培
养过夜后，用脂质体转染法将重组质粒 pEGFP-C1-
Rac1、pEGFP-C1-Rac1V12、pEGFP-C1-Rac1N17 分别
转染入细胞内，转染 4-6 h 后，换正常培养基继续
培养 36-48 h，然后在倒置荧光显微镜下观察融合蛋
白 EGFP-Rac1 的表达。
1.2.4 Western blotting 检测 EGFP-Rac1 融合蛋白的
表达水平 用重组质粒转染 LO2 细胞 48 h 后，每孔（6
孔细胞培养板）加入 300 μL 细胞裂解液（20 mmol/L
Tris-HCl pH7.5，150 mmol/L NaCl，1% Triton X2100，
1% PIS），收集细胞冰上放置 30 min，4℃下 12 000
r/min 高速离心 5 min 后保留上清。上清蛋白经 10%
SDS-PAGE 垂直电泳分离后，电转移至 PVDF 膜。膜
经含 50 g/L 脱脂奶粉的 TBST（Tris-HCl 20 mmol/L，
2013年第6期 179段桂华等 ：改良重叠区扩增法构建 Rac1 相关质粒
NaCl 150 mmol/L，Tween-20 0.05%，pH7.4）封闭 1 h
后，分别与鼠抗 Rac1 抗体（1∶5 000 稀释）孵育过
夜，用 TBST 漂洗滤膜 5 次后加山羊抗鼠 IgG-HRP
（1∶5 000 稀释）反应 2 h，TBST 漂洗 5 次，ECL 显
色，X 光胶片显影。
2 结果
2.1 重组质粒构建
通过改良重叠区扩增法成功实现基因定点突
变（ 图 2）， 并 构 建 成 3 种 重 组 质 粒 pEGFP-C1-
Rac1、pEGFP-C1-Rac1V12、pEGFP-C1-Rac1N17。经
EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切显示插入片段与预期的一
致，约为 580 bp（图 3）。DNA 测序结果显示重组得
到 Rac1 基因与 GenBank 中已报道的人 RaclCDS 序
列完全一致，Rac1V12 的第 12 位密码子成功由 GGA
突变为 GTA，Rac1N17 的第 17 位密码子由 ACT 突
变为 AAT（图 4，图 5）。由图 4 可以看出 Rac1V12
的第 12 位密码子由 GGA 变为 GTA。由图 5 可以看
出 Rac1N17 的第 17 位密码子由 ACT 变为 AAT。
表 1 PCR 引物碱基序列
引物名称 引物序列（5-3）
P1（Rac1）
CGGAATTC GATGCAGGCCATCAAGTGT-
G（EcoR Ⅰ酶切位点）
P2（Rac1）
CGGGATCC TTACAACAGCAGGCATTTT-
C（BamH Ⅰ酶切位点）
P3（Rac1-796 bp）
CGGAATTC GCCATTTCCTGTTTCTCTGC-
A（EcoR Ⅰ酶切位点）
P4（G12V）
GTGGTGGGAGACGTAGCTGTAGGTAAAA-
C（G）
P5（G12V_antisense）
GTTTTACCTACAGCTACGTCTCCCACCA-
C（C）
P6（T17N）
GACGGAGCTGTAGGTAAAAATTGCCTAC-
TGATC（C）
P7（T17N_antisense）
GATCAGTAGGCAATTTTTACCTACAGCTC-
CGTC（G）
2 个突变位点分别为：12 位的 G ／甘氨酸（GGA）突变为 V ／缬氨酸（GTA），
17 位的 T/ 苏氨酸（ACT）突变为 N ／天冬酰胺（AAT）。P3 引物为针对点
突变设计，下划线为设计突变的碱基，括号内为原碱基
500
M 1 2
bp
200
300
750
M 1 2
bp
300
750
M
A B C
1 2
bp
500
M ：DNA Marker ；A ：PCR-A 所得含突变点 Rac1 上游片段，1 ：Rac1V12 上游片段，2 ：Rac1N17 上游片段 ；B ：PCR-B 所得含突变点 Rac1 下游片段，
1 ：Rac1V12 下游片段，2 ：Rac1N17 下游片段 ；C ：PCR-C 所得含突变点 Rac1 基因，1 ：Rac1V12 基因，2 ：Rac1N17 基因
图 2 点突变三步 PCR 图
M 1 2 3
䞦࠷䍘㋂
ⴞⲴ⡷⇥
ৼ䞦࠷傼䇱
M：2 kb DNA Ladder Marker；1：pEGFP-C1-Rac1挑取阳性克隆的双酶切结果；2：
pEGFP-C1-Rac1V12 挑取阳性克隆的双酶切结果 ；3 ：pEGFP-C1-Rac1N17 挑
取阳性克隆的双酶切结果
图 3 双酶切验证结果
G GT G G T G G G A G A C G G A G C T G T A G G T A A A A
G G T G G T G G G A G A C G T A G C T G T A G G T A A A A
ㅜ12սᇶ⸱ᆀ⭡GGAਈѪGTA
A
B
A ：Rac1 的碱基序列 ；B ：Rac1V12 的碱基序列
图 4 pEGFP-C1-Rac1V12 点突变测序结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期180
2.2 荧光显微镜观察转染质粒后LO2细胞中荧光
蛋白的表达
使用阳离子脂质体法转染空载体 pEGFP-C1、
pEGFP-C1-Rac1、pEGFP-C1-Rac1V12 及 pEGFP-C1-
Rac1N17 至 LO2 细胞后均有不同程度荧光蛋白表达
（图 6）。
2.3 质粒转染后内源性及EGFP-Rac1蛋白表达
3 种重组质粒转染 LO2 细胞后均有 EGFP-Rac1
蛋白表达（图 7）。
2.4 传统的重叠区扩增法改良结果
本试验中我们还对传统的重叠区扩增法进行了
改良，将突变使用模板由双链 DNA 改为 cDNA，模
板由双链变为单链后就能减少非突变基因产生的概
率，从而提高突变成功率，但该方法限于突变点靠
近 cDNA 的 3 端时（图 8），当突变点靠近 cDNA 的 5
端时则无此优势。
突变成功率指 DNA 双链均发生突变的概率，
A G C T G T A G G T A A A A C T T G C C T A C T G A T C A G
ㅜ17սᇶ⸱ᆀ⭡ACTਈѪAAT
A G C T G T A G G T A A A A A T T G C C T A C T G A T C A G
A
B
A ：Rac1 的碱基序列 ；B ：Rac1N17 的碱基序列
图 5 pEGFP-C1-Rac1N17 点突变测序结果
pEGFP-C1
Bright
50 μm 50 μm
50 μm 50 μm
50 μm 50 μm
50 μm 50 μm
Flourescence
pEGFP-C1
-Rac1
pEGFP-C1
-Rac1V12
pEGFP-C1
-Rac1N17
pEGFP-C1
Bright
50 μm 50 μm
50 μm 50 μm
50 μm 50 μm
50 μm 50 μm
Flourescence
pEGFP-C1
-Rac1
pEGFP-C1
-Rac1V12
pEGFP-C1
-Rac1N17
图 6 质粒转染 LO2 细胞后，荧光蛋白 EGFP 在细胞内表达情况
1 ：转染空载体 pEGFP-C1 ；2 ：转染 pEGFP-C1-Rac1 ；3 ：转染 pEGFP-C1-Rac1V12 ；4 ：转染 pEGFP-C1-Rac1N17
图 7 内源性及外源性 Rac1 表达图
EGFP-Rac1
1 2 3 4
Rac1
48
kD
21
2013年第6期 181段桂华等 ：改良重叠区扩增法构建 Rac1 相关质粒
cDNA 在 n+1 次循环后突变成功率为（2n-1）/2n，双
链 DNA 在 n 次循环后突变成功率为（2n-n-1）/2n，
由于 cDNA 在一次循环后变为双链，故 cDNA n+1
次循环所扩增出 DNA 的量等同于双链 DNA 在 n 次
5˃ 5˃3˃ 3˃5˃ 5˃3˃ 3˃5˃
5˃
3˃ 3˃5˃
5˃
3˃ 3˃5˃
5˃
3˃ 3˃5˃
5˃
3˃ 3˃5˃
n+1⅑ᗚ⧟
2n1/2nĂĂ
5˃
3˃ 3˃5˃
5˃
3˃ 3˃5˃
5˃
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3˃ 3˃5˃
5˃
3˃ 3˃5˃
5˃
3˃ 3˃5˃
5˃
3˃ 3˃5˃5˃3˃ 3˃5˃
ৼ䬮DNA
cDNA
3˃
n⅑ᗚ⧟
ケਈᡀ࣏⦷
2nn+12nĂĂ
图 8 突变成功率示意图
循环后扩增的量，而（2n-1）/2n>（2n-n-1）/2n。
3 讨论
多篇报道显示 Rac1 能促进肝星状细胞的激活、
增殖，加速肝纤维化的进展［4，5］，晚近一系列研
究证实 Rac1 可通过不同机制参与多种上皮细胞的
EMT 过程［6，7］，Zeisberg 等［8］发现肝上皮细胞能通
过 EMT 转化为成纤维母细胞，加重肝纤维化的程度。
但 2010 年 Taura 等［9］发表于 Hepatology 杂志的一项
研究发现，在四氯化碳诱导肝纤维化肝脏中产胶原
细胞并非起源于肝上皮细胞，质疑了肝纤维化中肝
上皮细胞经 EMT 转化为成纤维母细胞的观点，因此
Rac1 在肝纤维化中的角色还有待进一步探索。
本研究中我们使用 RT-PCR 的方法成功从人肝
细胞系 LO2 总 RNA 中克隆出人 Racl cDNA。然后以
其为模板，成功构建含人正常 Rac1 基因的质粒，并
利用基因定点突变的方法分别获得人 Rac1 持续激
活型突变体 RaclV12 和显性负调控突变体 RaclN17。
本实验室保存质粒 pEGFP-C1 含 有 绿 色 荧 光 蛋 白
EGFP，该蛋白在荧光显微镜下可发出绿色荧光，故
构建成功质粒转染入细胞后便可在荧光显微镜下直
接观察质粒转染效率，与传统的通过测量蛋白表达
量来观察质粒转染效率相比，更为直观、准确及高效，
便于及时调整试验方案。但是该方法亦有一定缺点，
荧光蛋白必须要在荧光显微镜下才能发光，且有荧
光蛋白表达并不代表连到质粒的目的基因有表达，
因为目的基因是否转录翻译还取决于目的基因读码
框是否发生改变，目的基因在经过引物扩增、酶切、
连接等步骤后有可能发生碱基的增多、缺失等导致
目的基因开放读码框架（open reading frame，ORF）
发生改变而不能启动翻译过程。
本试验利用重叠区扩增法实现了基因定点突变
（Site-directed mutagenesis）［10］，其原理是向 PCR 产
物中掺入一段新的、在原模板内不存在的序列，所
需引物只需能与其模板有效结合而不必完全匹配，
任何与原模板不匹配的碱基都将掺入到 PCR 产物中。
与目前常用的点突变试剂盒相比，该方法优点在于
不用预先构建含该目标基因的质粒，而点突变试剂
盒要先构建含目标基因的质粒后才能行点突变，并
且重叠区扩增法既可进行基因定点突变，亦可实现
基因缺失、增加及合并两条编码不同蛋白的基因，
其最后一个功能可实现一种质粒表达两种或以上不
同的蛋白。重叠区扩增法在进行定点突变时至少需
要 4 种引物和 3 次 PCR 实现，首先需将目标基因以
突变点为中心，分别经 PCR 扩增出目标基因起点至
突变点、突变点至目标基因终点的上、下游基因片
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期182
段（两基因片段在突变点处有一定数量的互补碱基），
然后将上、下游片段混合，由于两突变引物有重叠
区，经变性、退火使上游片段单链和下游片段单链
在重叠区结合，再延伸得到含突变点的异源双链基
因，目标基因上下游外侧引物便可将其扩增。本试
验中由于突变点距离目标基因启动密码子的距离不
到 100 bp，该片段扩增后很难与引物二聚体分离，
故针对这个问题单独设计了一条上游引物，该引物
起点到突变点约 250 bp 左右，扩增后易于分离。此
外由于突变点离起始密码子约 36 bp，故也可以将此
突变点直接设计到上游引物进行普通 PCR 扩增，但
该引物将大于 36 bp，因为在进行基因定点突变时
在突变点两端都需要有足够的碱基数才能保证突变
引物和模板有效结合。而考虑到引物过长可能会对
PCR 的忠实性及扩增效率产生影响，以及重叠区扩
增法的上述优点，我们选择了重叠区扩增法进行基
因定点突变。
4 结论
构建了 Racl、持续激活型突变体 RaclV12 和显
性负调控突变体 RaclN17 三种真核表达载体，成功
转染入肝细胞，并通过免疫印迹证实转染质粒的肝
细胞内有外源性 Rac1 融合蛋白表达。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）