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KEDanxia,ZHANGWei,LIXiangyong,YANGMingying,YUXiaorui,
ZHUHanxue,WANGXiaofei
(ColegeofLifeSciences&InstituteforConservationandUtilizationofAgrobioresourcesinDabieMountains,XinyangNormal
University,Xinyang,Henan464000,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:犚狅狆geneplaysanimportantroleintheprocessofsymbioticinteractionbetweenlegumeandrhi
zobium.A犚狅狆gene犚犪犮1wasamplifiedfromtherootcDNAofmodellegume犔狅狋狌狊犼犪狆狅狀犻犮狌狊andligated
totheprokaryoticexpressionvectorpET28a.Theengineeringbacteriumcarrying犚犪犮1genein犈.犮狅犾犻
BL21(DE3)wasobtained.TheexpressionconditionsofRac1proteinwasoptimized,andtheproteinwas
purifiedbyaffinitychromatography.Rac1proteinexpressionlevelsofoverexpressionplantweredetected
byusingthepreparedantiRac1polyclonalantibody.Theresultsshowed:(1)theprokaryoticexpression
vectorofpET28aRac1wasconstructedsuccessfulybydoubleenzymedigestionandDNAsequencing.(2)
Theoptimalexpressionconditionwasinductiontemperatureat20℃,timeat6h,andIPTGconcentration
at0.1mmol/L.Therecombinantproteinwashighefficiencyexpressedintheformofsolubleprotein.The
purifiedRac1proteinwasobtainedbyaffinitychromatographyanddetectedbySDSPAGE.Thebandsize
wasabout25kD,andthebandswereclearandsingle.(3)Westernblottinganalysisshowedthatthepoly
clonalantibodycouldspecificalyreactwiththecorrespondingantigen,andthetiterwashigh.(4)
Agrobacteriummediatedtransformationofhairyrootsmethodwasusedtoobtainthepositivehairyroots
ofRac1overexpressionplant.ThetotalproteinofpositivehairyrootswasextractedanddetectedbyWest
ernblotting.TheresultsshowedthattheexpressionofRac1proteinintheRac1overexpressionplantwas
significantlyhigherthanthatintheemptyvectorcontrol,whichprovedtheconstructionofoverexpression
vectorwaseffectivefromtranslationlevel.TheresultsshowedthatthepreparationofRac1polyclonalan
tibodycouldspecificitydetectthenativeRac1proteinin犔狅狋狌狊犼犪狆狅狀犻犮狌狊,whichwilprovideapowerful
toolforthefurtherstudyofthebiologicalfunctionofRac1inthesymbiosissignaltransductionpathway.
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Fig.2 IdentificationoftherecombinantpET28aRac1
plasmiddigestedwith犛犪犾1犪狀犱犈犮狅犚1
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inducedcelscontainingpET28aRac1;8.Insolubleprotein
frominducedcelscontainingpET28aRac1
Fig.3 SDSPAGEanalysisoftheexpressionof
Rac1recombinantprotein
1~3.~C~pÀ;M.marker;
4.,ß»:R~C~
4 Rac1~SDSPAGEXß
13.PurifiedRac1protein;M.Proteinmarker;
4.Targetproteinafterdialyzedandconcentrated
Fig.4 SDSPAGEanalysisofpurifiedRac1
recombinantprotein
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Fig.5 WesternblottinganalysisofRac1
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3~8.k#§1ÛÚQm~Rac1
6 ,g1ÛÚQRac1~
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1.InducedcelscontainingpET28a;2.Rac1protein
intransgenicpositivehairyrootofcontrolplant;
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ofoverexpressionplant
Fig.6 WesternblottinganalysisofRac1protein
intransgenicpositivehairyroot
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