全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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%
-
,.//0,#""")*"!$,!"#$,#!,!%&$
收稿日期$
!"#$)"+)!"
&修改稿收到日期$
!"#$)#")"1
基金项目$国家自然科学基金青年基金项目"
%#*""!#%
#&信阳师范学院青年科研基金项目"
!"#*)23)"$1
#&信阳师范学院青年骨干教师资
助计划项目"
!"#$
#&信阳师范学院南湖学者奖励计划(青年项目
作者简介$柯丹霞"
#1+%
#!女!博士!讲师!主要从事根瘤菌与豆科植物共生互作的分子机理研究)
4)56.7
$
89:
*
"!1
!
#&%,;<5
百脉根小
$
蛋白
1$"%
基因的克隆与功能分析
柯丹霞!李祥永!王静静!焦
!
珂
"信阳师范学院 生命科学学院!河南信阳
*&*"""
#
摘
!
要$小
=
蛋白
><
?
在植物细胞信号转导中发挥着重要的分子开关功能)该实验通过
>@)AB>
方法克隆了百
脉根的一个
><
?
编码基因
!
"
#$%#
!并对
!
"
#$%#
基因序列进行生物信息学分析!然后采用半定量
>@)AB>
检测
!
"
#$%#
基因在百脉根不同组织中的表达!用荧光实时定量
AB>
方法检测百脉根接种根瘤菌后
!
"
#$%#
基因在不
同阶段根系中的表达!构建过表达重组质粒!利用发根农杆菌介导的遗传转化法对
!
"
#$%#
基因功能进行分析)结
果表明$"
#
#序列分析显示!
C
-
>6;#
完整编码区的
;D3E
序列长度为
$1*F
?
!编码
#1(
个氨基酸!其编码蛋白具有典
型的
><
?
家族保守结构域&同源分析显示!百脉根
C
-
>6;#
与大豆
=5>6;#
+野大豆
=/>6;#
的一致性最高
"
1*,*!G
#)"
!
#
!
"
#$%#
基因在百脉根的根+茎+叶+根瘤和花中均有表达!且在根和根瘤中的表达水平较高&接种根
瘤菌
",$H
后!
"
#$%#
基因在根系中的表达量呈显著升高趋势)"
%
#过表达转基因植株中
!
"
#$%#5>3E
的表达
水平为对照植株的
#*,%
倍!且过表达植株的结瘤数目较对照明显增加)研究认为!
!
"
#$%#
基因是一个受根瘤菌
诱导增强表达的基因!过表达
!
"
#$%#
基因可以引起植株结瘤数目的增加!说明
!
"
#$%#
基因可能参与早期结瘤信
号转导途径!从而在根瘤的发育中发挥一定作用)
关键词$百脉根&小
=
蛋白&
!
"
#$%#
&过表达&共生结瘤
中图分类号$
2(+$
&
2(+&
文献标志码$
E
&()*#"(+",-./0$12/+34/)%#(5"!0/*#"(26")3++#(2"
5
$
6
&/-"34
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M
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&
!
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&
/
M
5F.!!
小
=
蛋白"
/567=@A6/Q/
#是一类单体鸟苷酸
结合蛋白!与异三聚体
=
蛋白"
HQVQT?
T#和几种特殊的
=@A
结合蛋白同属于
=
蛋
白家族!普遍存在于真核生物细胞中-#.)小
=
蛋白
家族包括
$
个亚家族$
>6/
+
>H<
+
>6F
+
S6T#
%
ETR
和
>60
-
!)*
.
)
><
?
"
>H<=@A6/Q?
760V
#为植物特有的
>H<=@A6/Q
!在植物细胞信号转导中发挥着重要的
分子开关功能)
><
?
蛋白通过与下游不同的靶蛋白
偶联调控多种生理过程)已有的研究结果表明!
><
?
参与调控花粉管的极性伸长+根毛的发育+细胞
骨架的重排+细胞发育与形态建成+细胞的内膜运输
等过程-$)1.)
><
?
还在植物抗病抗逆+活性氧的合
成+激素信号转导和泛素介导的蛋白水解途径中发
挥重要作用-#")#%.)
前人已经从拟南芥+烟草+水稻+玉米+油菜+棉
花等多种植物中克隆了
><
?
基因并进行了相应的
功能研究)鉴于共生固氮在农业和生态方面的重要
意义!在豆科植物中克隆
><
?
基因!探索其在植物
)
微生物互作中的作用!目前已经受到众多研究学者
的关注)转录分析发现!在根瘤菌侵染紫花苜蓿
"
40:,%$
;
&)$,<$
#的根中-#*.存在
>H<
类的
=@)
A6/Q/
的表达!这是
><
?
基因在共生固氮中行使功
能的第 一 个 证 据)
C.W
等-#$.克 隆 了 蒺 藜 苜 蓿
"
40:,%$
;
&5(+%$(.$
#中的
(
个
><
?
基因!其中
4#&
*
%
+
4#&
*
$
和
4#$%#
基因受根瘤菌诱导!
接种根瘤菌后基因表达量明显升高!与标记基因
=>?
+
#,
*
#
和
@+&:##
的表达情况一致)最新的研
究发现!结瘤因子能够调控
[V><
?
#"
蛋白的定位及
其在根毛顶端的活性!而且
[V><
?
#"
蛋白和结瘤因
子受体之间的相互作用是根瘤菌感染过程中根毛变
形和连续卷曲所必须的-#&.)大豆"
-.
/
%,+01$2
#
#$8A!
在接种根瘤菌的根毛中特异表达!
#$8A!
的
>3E.
植株接种后不能诱导根毛变形和侵染线起
始!没有早期结瘤素基因 "
@=BC)
#如
@#=#
!
@=BC*"
和
D$
*
$
的表达!结瘤也被完全抑制-#(.)
百脉根"
!&()
"
$
*
&+,%()
#是一种重要的模式豆
科植物!对其
><
?
基因的研究将有利于揭示
><
?
在
豆科植物与根瘤菌共生互作过程中的重要功能)笔
者前期利用酵母双杂交文库筛选到一个百脉根
><
?
基因
!
"
#&
*
&
!并阐明
!
"
#&
*
&
是调控根瘤菌侵染豆
科植物和根瘤发育的一个新的调节子-#+.)百脉根
中另外
!
个
>6;
基因早在
#11(
年被发现-#1.!但目
前有关百脉根
>6;
基因功能的研究尚未见报道)
为此!本实验以百脉根为材料!根据
3B\J
网站公布
的序列!对
!
"
#$%#
基因的编码区进行了克隆!并对
该基因在百脉根不同组织及根瘤菌诱导早期根系中
的表达水平进行了检测&构建过表达载体!利用发根
农杆菌介导的百脉根毛根转化方法!对
!
"
#$%#
基
因在共生互作中的功能进行了研究!以期为阐明
><
?
在豆科植物和根瘤菌共生结瘤过程中的作用机
制提供理论依据)
#
!
材料和方法
%,%
!
材
!
料
百脉 根
[=)!"
种 子+百 脉 根 中 生 根 瘤 菌
[E]]%"%"11
+过表达载体
?
#%"!=
由华中农业大
学农业微生物国家重点实验室根瘤菌分子生物学实
验室提供)
%,<
!
方
!
法
%,<,%
!
植物材料处理
!
培养百脉根中生根瘤菌
43.&,[E]]%"%"11
于
^[E
培养基中!
^[E
培
养基组成为甘露醇
#","
L
%
C
!
Q^6/V4:VT6;V",*
L
%
C
!
I
!
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*
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L
%
C
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L
SP
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!
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%
C
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!
P",#
L
%
C
!
36B7",#
L
%
C
!
>H
微量元
素液
*5C
%
C
)
>H
微量元素液
U
%
\P
%
$,"
L
%
C
和
36
!
[*
$,"
L
%
C
)
当菌体
PD
&""
大于
#,"
时!
*"""T
%
5.0
离心
#"
5.0
!用
^[E
培养基重悬菌体用于接种)将百脉根
[=)!"
种子用磨砂纸轻轻打磨种皮!浸入液氮中冷
冻
#5.0
!用无水乙醇浸泡
$5.0
除去种子表面气
泡!用
+G 36B7P
溶液浸泡
#"
"
#$5.0
!种子表面
消毒完成后!置
!!_
黑暗培养
!
"
*9
待萌发)
盆栽所用细砂和花盆均经高压灭菌处理!每个
花盆中种入等量且生长状态一致的幼苗&炼苗
!
"
%
&&%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
9后浇灌
]6HT6QW/
无氮营养液)无氮营养液组成
为
B6B7
!
/
!U
!
P",#"
L
%
C
!
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AP
*
",#"
L
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C
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L
SP
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!
36
!
UAP
*
/
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!
P",#$
L
%
C
!
=.F/<0
微量元素液
# 5C
%
C
!柠檬酸铁
$
5
L
%
C
)
=.F/<0
微量元素液为
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%
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%
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L
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C
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36
!
[*
/
!U
!
P",#%
L
%
C
!
BWSP
*
/
$U
!
P",
"+
L
%
C
)
待幼苗长出第一片真叶时!接种百脉根根瘤菌
43.&,[E]]%"%"11
)在同样条件下!种植不接种
根瘤菌的百脉根植株)分别收集接种根瘤菌
",$
+
#
+
$
+
#!
+
!*
+
*+
+
(!
和
1&H
后的植物根系!收集生长
状态一致的未接种植株根系作为对照!液氮速冻后!
置
("_
冰箱保存备用)采用同样的方法获得另
一批植株!待生长
%"9
后!分别收集植株的根+茎+
叶+花和根瘤!液氮速冻后!置
(" _
冰箱保存
备用)
%,<,<
!
引物设计及合成
!
根据
3B\J
网站公布的
!
"
#$%#
基因序列"
=Q0\608
登录号
(`%1&#,#
#!用
AT.5QTATQ5.QT$,"
软件设计半定量
AB>!
"
#$%#
基因上游引物"
$a)@==@@B@=E@E=E@B@B@)
=E@B@=)%a
#和下游引物 "
$a)=@BEB@EBB@B)
B@EE@E=@@@B@=E@@B)%a
#)实时荧光定 量
AB>!
"
#$%#
基因上游引物"
$a)BBBBBEB@E@@)
@E@=@=@B@=B@@E)%a
#和下游引物"
$a)BEE)
BEE=BE==@@@@=BBBEBE)%a
#)实时荧光定
量
AB>
内参基因
E8,
上游引物"
$a)@@BEBB@@)
=@=B@BB=@B@@B)%a
#和下游引物"
$a)EEBEE)
BE=BEBEBEBE=EBEE@B)%a
#)构 建
!
"
#$%#
过表达载体上游引物"
$a)==EE@@BE@=E=@)
=B@@BBE)%a
#和下游引物"
$a)EB=B=@B=EB@)
BEBEE@E@@=E=)%a
#!下划线分别为
@%&>
#
和
F$.
#
酶切位点)
%=<=>
!
植物组织总
457
提取及
)?57
第一链合成
!
参照
J0Z.VT<
L
Q0
公司
>3E
抽提试剂盒操作说明
书!提取百脉根不同组织的总
>3E
)使用紫外分光
光度计检测
>3E
样品浓度和纯度!记录数值)样
品置
("_
保存)
按照
@686T6
公司试剂盒操作说明进行!操作时
随时更换一次性手套!并佩戴口罩)得到的
;D3E
第一链!置
!"_
保存!备用)
%=<=@
!
半定量
41A2B4
!
AB>
反应体系为
!,$
$
C
#"bAB>\WRRQT
!
*
$
C!,$55<7
%
C93@A
!
#
$
C
上
游特异性引物"
#"
$
5<7
%
C
#!
#
$
C
下游特异性引物
"
#"
$
5<7
%
C
#!
",!$
$
CG$
H
D3E
聚合酶!
#
$
C;D)
3E
第一链模板!用
99U
!
P
补足体积到
!$
$
C
)
AB>
反应程序为
1$_
预变性
$5.0
&
1*_
变性
%"
/
!
$$_
退火
%"/
!
(!_
延伸
#5.0
!
1
个循环&
(!_
延伸
$5.0
)利用琼脂糖电泳分析基因时空表达
情况)
%=<=C
!
实时荧光定量
2B4
!
按照
@686T6
公司
AT.)
5QS;T.
?
V>@TQ6
L
Q0VI.V
操作说明进行)
AB>
反
应体系为
#!,$
$
CS^ \>?501,2@2G$
H
@[
%
!
#
$
C
AB>]!
#
$
CAB>>QZQT/QAT.5QT
!
$
C>@
反应液!加
99U
!
P
至
!$
$
C
)
AB>
反应程
序为$
1$_
预变性
%"/
&
1$_
变性
$/
!
&"_
退火
#$
/
!
(!_
延伸
#!/
!
%1
个循环)根据相对定量法"
!
BV
#公式计算结果)
%=<=D
!
2
5
1$"%
基因的克隆及过表达载体构建
!
D3E
限制性内切酶酶切+
AB>
或线性质粒片段回
收纯化+连接等操作按照酶或试剂盒供应商提供的
方法或产品说明进行)质粒
D3E
抽提!大肠杆菌+
农杆菌感受态细胞制备!转化等方法均按照0分子克
隆实验指南1所述方法进行-!".)
根据百脉根
!
"
#$%#
的序列信息!利用引入酶
切位点的引物进行
AB>
扩增!切胶回收
AB>
目的
片段!构建成
?
#%"!=)C
-
>6;#
过表达载体!并转化
到大肠杆菌
DU$
&
感受态细胞中!经酶切和测序验
证后!将构建好的表达载体质粒经冻融法转入发根
农杆菌菌株
C\E#%%*
中!用于百脉根的转化)
%,<,E
!
农杆菌介导的百脉根毛根转化
!
百脉根种
子表面消毒!
!_
暗培养
!
"
%9
)将萌发种子移入
[S
平板中!
!_
光培养
#&H
!暗培养
+H
)待幼苗
胚根长至约
#;5
长时!切去胚根!收集子叶部分获
得侵染所用百脉根外植体)将外植体下胚轴浸入携
带过表达载体的发根农杆菌菌悬液中!侵染
%"
5.0
)无菌滤纸吸干外植体表面残液!移入
[S
平
板上!暗培养
%
"
$9
!幼苗切口处可见大小不等的膨
大)此时将外植体转移至含
%""5
L
%
C
羧卞的
[S
培养基中!
!_
光培养
#&H
!暗培养
+H
)
!
周左右
用配置好的
=cS
染液鉴定转化的阳性毛根!将不
显蓝的阴性毛根切掉)
转基因植株移入经高压灭菌处理的沙盆中炼苗
!
"
%9
后接种百脉根根瘤菌
43.&,[E]]%"%"11
!
期间浇灌无菌
]6HT6QW/
无氮营养液)接种
*
周后!
收集沙盆中的植株!观察并统计转化根系的结瘤情
况)试验数据采用
4:;Q7!""(
和
SASS#%,"
软件
进行统计分析)
(&%!
#!
期
!!!!!!!!!!!!
柯丹霞!等$百脉根小
=
蛋白
#$%#
基因的克隆与功能分析
%,<,F
!
序列分析
!
利用
3B\J
网站的
\76/V
功能对
C
-
>6;#
蛋白的结构特征进行分析!用
D3E[E3
软
件进行序列同源性比对分析!利用
[4=E*,"
构建
系统进化树)
!
!
结果与分析
<=%
!
百脉根
2
5
1$"%
基因的
41A2B4
扩增
根据已知的百脉根
!
"
#$%#
基因序列设计引
物!利用
>@)AB>
得到一个长度为
$1*F
?
的扩增产
物!与预期结果一致"图
#
#)利用引入酶切位点
@%&>
#
和
F$.
#
的引物将
!
"
#$%#
连入
?
#%"!=
过
表达载体)重组质粒经
@%&>
#
和
F$.
#
酶切后获
得大小约
#!8F
的载体片段和
&""F
?
左右的插入
片段"图
!
#)对阳性克隆进行测序!测序结果表明!
获得克隆片段长度为
$1*F
?
!与
3B\J
数据库中公
布的
!
"
#$%#
基因序列完全一致)结果表明!已成
功克隆了
!
"
#$%#
基因并构建了过表达载体)
图
#
!
!
"
#$%#
目的片段的
AB>
扩增
[,#8FD3E7699QT
&
#,AB>
扩增产物
].
L
,#
!
AB>65
?
7.R.;6V.<0"
#$%#
L
Q0Q
[,#8FD3E7699QT
&
#,AT<9W;V65
?
7.R.;6V.<0
图
!
!
重组质粒
?
#%"!=)>6;#
酶切鉴定
[,#8FD3E7699QT
&
#,
重组质粒酶切产物
].
L
,!
!
J9Q0V.R.;6V.<0?
#%"!=)>6;#
?
76/5.99.
L
Q/VQ9X.VH@%&>
#
609F$.
#
[,#8FD3E7699QT
&
#,AT<9W;V?
76/5.99.
L
Q/VQ9X.VH@%&>
#
609F$.
#
<=<
!
百脉根
2
5
1$"%
基因编码的氨基酸序列
序列分析表明!全长的百脉根
!
"
#$%#
基因大
小为
$1*F
?
!由
#
个外显子组成!蛋白质由
#1(
个氨
基酸残基组成!分子量大小为
!$8D
)
!
"
#$%#
基因
编码的蛋白具有
><
?
家族典型的结构特征!包括
(
个功能结构域$
=@A6/Q
结构域"
#
和

#!效应子结
构域"
%
#和
=DA
%
=@A
结合结构域"
(
和
)
#为
$
个
保守的功能结构域)而插入区"
*
#和
B
端区"
+
或
者
Ud>
#这
!
个结构域是高度可变的)
C
-
>6;#
蛋
白含有这
(
个保守的功能结构域"图
%
#!说明
C
-
)
>6;#
是一个典型的
><
?
蛋白家族成员)此外!将
C
-
>6;#
第
#$
位的甘氨酸"
=
#突变为缬氨酸"
*
#!引
入
=#$d
点突变"图
%
"
所示#!把
C
-
>6;#=@A6/Q
锁定在持续活化状态!可以构建组成型活化突变体
"
BE
#&将第
#!#
位的天冬氨酸"
D
#突变为天冬酰胺
"
3
#!引入
D#!#3
点突变"图
%
#
所示#!把
C
-
>6;#
=@A6/Q
锁定在非活化状态!可以构建功能缺失突
变体"
D3
#!通过对
!
种突变体的研究!可以进一步
揭示
C
-
>6;#
的生物学功能)
<=>
!
2
5
1$"%
基因的系统进化及同源分析
对百脉根
!
"
#$%#
基因编码的氨基酸序列进行同
源比对!结果发现!
C
-
>6;#
与大豆
=5>6;#
"
KA
*
""%$*"++",#
#+野大豆
=/>6;#
"
IU3%1+(&,#
#+百脉根
C
-
>6;#
"
ED^ #&&&",#
#+鹰嘴豆
B6>6;#
"
3A
*
""#!&&""+,
#
#+水 稻
P/>6;$
"
2&4A%#,!
#+蒺 藜 苜 蓿
[V><
?
&
"
EE[#+#%*,#
#+百脉根
C
-
><
?
$
"
EUd+%&"%,#
#+紫花
图
%
!
百脉根
!
"
#$%#
基因编码氨基酸序列
"
标示组成型活化位点
=#$
!
#
标示功能失活位点
D#!#
)
方框标记的为
(
个保守结构域$
=@A6/Q
结构域"
#
和

#!
效应因子结构域"
%
#!
=DA
%
=@A
结合结构域"
(
和
)
#!
>UP
插入区"
*
#!膜定位结构域"
+
#或者高度可变区"
Ud>
#
].
L
,%
!
DQ9W;Q965.0<6;.9/Q
Y
WQ0;Q
"
#$%#RT<5!3
"
$
*
&+,%()
"
,>Q
?
TQ/Q0V/VHQ;<0/V.VWV.ZQ7
M
6;V.ZQ
?
<.0V=#$
&
#
,TQ
?
TQ/Q0V/VHQ
9<5.060V0Q
L
6V.ZQ
?
<.0VD#!#,\<:Q96TQ/QZQ0;<0/QTZQ99<56.0/
$
=@A6/Q9<56.0/
"
#
609

#!
QRRQ;V"
%
#!
=DA
%
=@A)
F.09.0
L
9<56.0/
"
(
609
)
#!
>UP.0/QTVTQ
L
.<0
"
*
#!
609
5Q5FT60Q7<;67.e6V.<09<56.0
"
+
#
M?
QTZ6T.6F7QTQ
L
.<0
"
Ud>
#
+&%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
苜蓿
[/>6;*
"
BE=%""&(,#
#+烟草
3V>H<#
"
KA
*
""1&#!(!&,#
#和拟南芥
EV>6;%
"
3A
*
#1$!!+,#
#等
植株的相似性分别为
1*,*!G
+
1*,*!G
+
1%,1#G
+
1%,*"G
+
1!,+1G
+
1!,+1G
+
1#,++G
+
1#,++G
+
1#,%(G
和
1",*"G
)
C
-
>6;#
与其它几种植株
><
?
蛋白相比!氨基酸序列差异最大的区域是
B
端"
+
或者
Ud>
#的膜定位信号结构域!其它的几个功能
结构域高度保守"图
*
#)
经过
\76/V
以及
D3E[E3
软件分析!将百脉
根
!
"
#$%#
编码蛋白与上述不同植株的
><
?
蛋白进
行进化树分析)结果"图
$
#表明!百脉根
C
-
>6;#
与
大豆
=5>6;#
+野大豆
=/>6;#
+百脉根
C
-
><
?
$
+鹰
嘴豆
B6>6;#
以及紫花苜蓿
[/>6;*
处在同一进化
分支上!亲缘关系较近)
<=@
!
2
5
1$"%
基因的组织表达分析
为了进一步阐明
#$%#
基因的功能!本研究利
用半定量
AB>
检测
#$%#
基因在百脉根的根+茎+
叶+根瘤和花中的表达情况)检测结果"图
&
#显示!
#$%#
基因在根+茎+叶+根瘤和花中均有表达)
#$%#
基因在根和根瘤中的表达量较高!其次是叶!茎和花
图
*
!
百脉根
C
-
>6;#
与其他植物
><
?
蛋白的多序列比对
黑线标示的为
B
端膜定位结构域
].
L
,*
!
E7.
L
05Q0V6067
M
/./Y
WQ0;Q-
>6;#X.VH?
760V><
?
/
B)Q095Q5FT60Q7<;67.e6V.<09<56.0X6/56T8Q9F
M
F76;87.0Q
1&%!
#!
期
!!!!!!!!!!!!
柯丹霞!等$百脉根小
=
蛋白
#$%#
基因的克隆与功能分析
中表达量较低)根和根瘤是豆科植物与根瘤菌共生
互作的关键部位!由此推测
#$%#
基因可能在百脉
根结瘤过程中行使一定的功能)
<=C
!
根瘤菌对
2
5
1$"%
基因表达水平的影响
为了检测
!
"
#$%#
基因的表达是否依赖于根瘤
菌的侵染!采用荧光定量
AB>
方法检测了接种和未
接种根瘤菌
1&H
内
!
"
#$%#
基因在百脉根根系中的
表达情况)结果"图
(
#表明!在未接种根瘤菌的根
系中
!
"
#$%#
维持在相对稳定且较低的表达水平&
而在接种根瘤菌的根系中!选取的
+
个时间点
!
"
9
#$%#
的表达量均有所增加)在百脉根与根瘤菌共
生互作的早期阶段!
"
#$%#
基因的表达依赖于根瘤
菌的侵染!受到根瘤菌的诱导表达增强!尤其是在接
种根瘤菌
$
+
#!
和
!*H
后!
"
#$%#
基因表达水平比
未接种处理显著增加
#*&G
+
#""G
和
1"G
)由此推
测
!
"
#$%#
基因可能受根瘤菌诱导!参与共生信号
转导途径)
<=D
!
G
H
4/)%
的过表达影响结瘤数目
为检测
!
"
#$%#
基因的生物学功能!利用农杆
图
$
!
百脉根
C
-
>6;#
与同系物的系统进化分析
标尺代表遗传距离!表明不同物种间
><
?
同系物进化关系的远近
].
L
,$
!
AH
M
7<
L
Q0QV.;VTQQ-
>6;#609.V/H<5<7<
L
/
@HQ/;67QTQ
?
TQ/Q0V/
L
Q0QV.;9./V60;Q
!
.09.;6V.0
L
VHQQZ<7WV.<06T
M
TQ76V.<0/H.
?
FQVXQQ0><
?
H<5<7<
L
/65<0
L
9.RRQTQ0V/
?
Q;.Q/
图
&
!
!
"
#$%#
基因在百脉根不同组织中的
5>3E
表达水平
#
"
$
分别是百脉根的根+茎+叶+根瘤和花
].
L
,&
!
@HQVT60/;T.
?
V7QZQ7"
#$%#
L
Q0Q
.09.RRQTQ0VV.//WQ/"
$
*
&+,%()
#$,><!
/VQ5
!
7Q6R
!
0<9W7Q609R7!
TQ/
?
Q;V.ZQ7
M
菌介导的毛根转化技术!将构建的过表达载体
>6;#)
?
#%"!=
"
>6;#)PK
#和空载体
?
#%"!=
"
BV
#分别
导入百脉根毛根中!接种
43.&,[E]]%"%"11
根
瘤菌
%
周后统计结瘤数目并收集样品!实时荧光定
量
AB>
检测不同转基因根系
!
"
#$%#
的转录水平)
结果"图
+
!
E
&表
#
#显示!
>6;#)PK
植株的结瘤数目
与对照相比明显增加!对照组平均每棵植株结瘤数
图
(
!
根瘤菌对
!
"
#$%#
转录水平的影响
].
L
,(
!
4RRQ;VVT60/;T.
?
V.<07QZQ7"
#$%#
图
+
!
过表达
!
"
#$%#
对百脉根结瘤的影响
E,
转基因毛根结瘤&
BV,
?
#%"!=
"对照#&
>6;#)PK,>6;#)
?
#%"!=
&
\,
转基因毛根的结瘤数目&
B,
转基因毛根中
>6;#
转录水平)
"
和
""
分别表示对照与过表达株系间
在
","$
与
","#
水平存在显著性差异&下同
].
L
,+
!
4RRQ;V/?
TQ//.<0
<00<9W76V.<0.0!3
"
$
*
&+,%()
E,3<9W76V.<0L
Q0.;H6.T
M
T<&
BV,
?
#%"!=
"
;<0VT<7
#&
>6;#)PK,>6;#)
?
#%"!=
&
\,3<9W7Q0W5FQT/L
Q0.;
H6.T
M
T<&
B,>6;#VT60/;T.
?
V/.0VHQVT60/
L
Q0.;H6.T
M
T<"
609
""
.09.;6VQ/.
L
0.R.;60V9.RRQTQ0;QFQVXQQ0;<0VT<7609
?
TQ//.<07.0Q/6V","$609","#7QZQ7
!
TQ/
?
Q;V.ZQ7
M
&
@HQ/65Q6/FQ7"(%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
%
!
转基因毛根结瘤数目统计
@6F7Q#
!
SV6V./V.;676067
M
/./L
Q0.;H6.T
M
T<重复实验
4:
?
QT.5Q0V
对照株系
B<0VT<7
过表达株系
>6;#)PK
# (,$!f!,$(
"
0g!"
#
#!,&#f!,*1
"
0g!$
#
"
! +,"#f%,"!
"
0g!*
#
#%,%%f!,(+
"
0g!$
#
"
!!
注$
"
表示对照与过表达株系间在
","$
水平存在显著性差异)
3$
"
.09.;6VQ9/.
L
0.R.;60V9.RRQTQ0;QFQVXQQ0;<0VT<7609?
TQ/)
/.<07.0Q/6V","$7QZQ7,
目为
(,+
!
>6;#)PK
为
#!,1
"图
+
!
#)实时荧光定
量
AB>
检测结果"图
+
!
B
#显示!在过表达植株
>6;#)PK
中
#$%#5>3E
的表达水平为对照的
#*,%
倍!表明过表达载体的构建有效)因此!
!
"
#$%#
基
因过表达可以引起植株结瘤数目的增加)
%
!
讨
!
论
近年来!越来越多的证据表明
><
?
基因可能参
与了豆科植物与根瘤菌之间的信号传递过程!但其
具体的调控机制还有待明确!还有很多问题有待解
决)在模式豆科植物百脉根中!除了笔者前期已经
成功分离了
#
个
><
?
基因
!
"
#&
*
&
外!目前关于百
脉根中其它
><
?
的功能研究!国内外尚未见相关报
道)本研究克隆了百脉根中的另一个
><
?
基因
!
"
9
#$%#
!其编码的氨基酸序列具有
><
?
=@A6/Q
的典
型特征)
为了解
!
"
#$%#
在百脉根中的表达模式!本研
究首先通过半定量
>@)AB>
检测
!
"
#$%#
在百脉根
不同组织中的表达情况)结果显示!
"
#$%#
在检测
的各个植物组织中都有不同程度的表达丰度!在茎+
叶+花中表达水平较低!在根和瘤中表达水平较高)
值得强调的是!根瘤是豆科植物与根瘤菌通过信号
分子的相互识别相互作用形成的一种特殊的器官)
通常情况下!在特定组织中表达的基因很可能在该
组织内发挥特殊的作用)
!
"
#$%#
在根和瘤中表达
水平较高暗示
!
"
#$%#
在根瘤形成过程中可能行使
一定的功能)
在豆科植物与根瘤菌建立共生关系的早期阶
段!根瘤菌产生的结瘤因子信号能够诱导宿主植物
体内一系列的早期结瘤反应-!#)!!.)
!
"
#$%#
基因在
接种根瘤菌
",$H
后表达水平明显增加!在随后的
#
"
$H
!表达量持续升高)在这个阶段!宿主植物的
根毛首先感知结瘤因子信号!出现钙离子振荡现象!
根毛顶端形成牧羊拐(结构包裹根瘤菌!根毛内中
空的管道
)
侵染线随之形成!同时根系的皮层细胞开
始分化)
!
"
#$%#
基因在接种根瘤菌的早期阶段表
达量显著上升!笔者推测它的表达受根瘤菌诱导!并
且可能参与调控豆科植物早期信号转导途径!可能
在侵染线形成和皮层细胞分化过程中发挥作用)
目前!发根农杆菌介导的毛根转化方法已经成
为实验室植物根系生物学研究的一种高效便捷的方
法)本研究构建了
!
"
#$%#
的过表达载体!利用发
根农杆菌
C\E#%%*
菌株介导的遗传转化方法获得
过表达阳性毛根!在
&
"
+
周的时间完成转基因植株
结瘤表型的观察及结瘤数目的统计工作!该方法能
够满足对
!
"
#$%#
在共生结瘤过程中功能研究的需
要)笔者首次通过该实验证实过表达
!
"
#$%#
能够
显著增加百脉根的结瘤数目!由此推测
!
"
#$%#
可
能在共生互作的早期阶段发挥作用从而调控结瘤过
程)笔者前期的研究表明!百脉根
!
"
#&
*
&
在表皮
发生形态学变化导致根瘤菌侵染的过程中发挥重要
作用)而
!
"
#$%#
是否也通过类似的调控机制调节
细胞骨架重组以及
B6
!h信号调控途径影响植株结
瘤!后期还需要大量的实验数据来揭示
!
"
#$%#
在
结瘤早期的具体调控机制)
综上所述!本研究通过
>@)AB>
方法克隆到百
脉根中的一个小
=
蛋白
C
-
>6;#
!该蛋白具有典型的
><
?
蛋白特征结构域!并与其它植物中的
><
?
具有
高度的相似性)
!
"
#$%#
基因具有一定的时空表达
特性!在百脉根根系和根瘤中表达水平较高)在百
脉根与根瘤菌共生互作的早期!
"
#$%#
受根瘤菌诱
导表达!其过表达转基因植株结瘤数目显著增加)
推测
!
"
#$%#
可能在共生互作的早期阶段发挥作用
从而参与调控结瘤)本研究将为进一步研究
><
?
在豆科植物与根瘤菌共生结瘤信号途径中的功能奠
定基础)
参考文献!
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