全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (12): 1368~13741368
收稿 2013-08-09　　修定 2013-10-21
资助 国家自然科学基金(31071457)、湖南省研究生科研创新项
目(11C0665)、湖南省科技计划项目(2012NK3062)和作物
种质创新与资源利用重点实验室培育基地科学基金开放
项目(12KFXM11)。
* 通讯作者(E-mail: xwzhang@hunau.edu.cn; Tel: 0731-
84673602)。
苎麻小分子G蛋白Rac1基因的克隆及表达分析
黄丽华1, 胡超1, 陈建荣2, 郭清泉2, 张学文1,*
1湖南农业大学生物科学技术学院, 长沙410128; 2长沙学院生物工程与环境工程系, 长沙410003
摘要: 植物Rac是植物中特有的小分子G蛋白, 我们从苎麻转录组中获得一个小分子G蛋白基因cDNA的部分序列, 设计引物
后采用RT-PCR结合RACE技术克隆了该基因的cDNA。序列分析表明, 所克隆的Rac1 cDNA全长为1 043 bp, 包括594 bp开
放阅读框、214 bp的3′端非编码区和235 bp的5′端非编码区, 能编码一个197氨基酸的推导蛋白。该蛋白包含G蛋白典型的
效应因子结合位点、GTP/GDP结合位点和碱性氨基酸区, C末端具有保守的异戊烯基化位点CSIL。采用半定量RT-PCR分
析了该基因在5个苎麻品种及不同组织器官中的表达情况, 结果表明Rac1基因在苎麻根、茎、叶中均有表达, 其中在叶中
的表达量最高。纤维木质素含量不同的品种中, Rac1基因的表达量存在明显差异。木质素含量高的品种具有较高的Rac1
基因表达, 表明该基因可能在苎麻木质素合成过程中发挥作用。
关键词: 苎麻; Rac1基因; 克隆; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of a Small G Protein Rac1 Gene cDNA from
Boehmeria nivea (Linn.) Gaudich
HUANG Li-Hua1, HU Chao1, CHEN Jian-Rong2, GUO Qing-Quan2, ZHANG Xue-Wen1,*
1College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2Department of
Bioengineering & Environmental Science, Changsha University, Changsha 410003, China
Abstract: Rac small G proteins of plants belong to a unique subfamily named ROP (Rho-related GTPase from
plants). Here, a Rac protein gene was isolated from Boehmeria nivea by RT-PCR and RACE based on the
sequence of Rac gene in B. nivea transcriptome. The cDNA was 1 043 bp, contained a 594 bp opening reading
frame, a 3-untranslated region of 214 bp, 5-untranslated region of 235 bp and encoded a putative protein of
197 amino acids with molecular weight 21.65 kDa and isoelectric point 9.30. BnRac1 contains four conserved
domains for guanine nucleotide binding and GTPase activities, an effector domain, a polybasic region and a
C-terminal motif for prenylation. Semi-quantitative RT-PCR analysis revealed that the transcript level of
BnRac1 was higher in leaves than those in other issues. Moreover, BnRac1 gene showed the high transcript
abundance in a variety with high lignin content in fiber. It turned out that BnRac1 gene was likely involved in
lignin biosynthesis in B. nivea.
Key words: Boehmeria nivea; Rac1 gene; cloning; expression analysis
植物Rac是存在于植物中的一类特殊的小分
子G蛋白(small GTPases)。在氨基酸序列上, 与果
蝇、哺乳动物中小G蛋白家族Rac的同源性高, 因
此植物Rac又被称为Rop (Rac of plants)蛋白(Zheng
和Yang 2000)。Rac参与了植物生长发育的许多过
程。研究表明, 一些Rac蛋白参与花粉管和根毛细
胞的极性生长(Lin和Yang 1997; Li等1999; Jones等
2002)。Rac通过调节活性氧的产生而控制植物的
抗病反应(Kawasaki等1999; Zhu等2011)。OsRac1
转基因水稻可产生大量活性氧, 对稻瘟病和枯萎
病的抗病性增强(Fujiwara等2006; Baxter-Burrell等
2002)。OsRacB基因过表达的水稻和烟草, 其抗盐
性都增强(Luo等2006)。棉花Rac13蛋白介导了
H2O2的产生, 参与了棉纤维次生壁的合成(Tamara
等1999)。Rac还作为信号分子参与了许多信号途
径。如Rac蛋白可以被生长素激活, 激活后的Rac
可以介导AUX/IAA蛋白与泛素类物质结合, 从而
使AUX/IAA蛋白泛素化降解, 生长素响应基因得
黄丽华等: 苎麻小分子G蛋白Rac1基因的克隆及表达分析 1369
以表达(Tao等2005)。生长素结合蛋白ABP1介导
的生长素信号能激活拟南芥AtRac3和AtRac4, 从
而影响细胞的内吞作用及细胞骨架的重排(Xu等
2010; Chen等2012)。另外Rac还可能影响生长素
的极性运输(Shingo等2012)。在ABA途径中, Rac
是负调控因子, 能降低ABA对拟南芥的的抑制作
用。拟南芥AtRac4的显性负突变体和组成型活性
突变体可加强或减弱由ABA诱导的种子萌发(Li等
2001)。组成型活性AtRac3的表达可抑制拟南芥植
株中由ABA诱导的气孔关闭(Lemichez等2001)。
其它的Rac还可以抑制由ABA引起的根的伸长、
保卫细胞肌动蛋白的重组以及基因的表达等
(Zheng等2002)。拟南芥AtRac4显性负突变体表现
出类似油菜素内酯缺乏或不敏感的表型, 其组成
型活性植株则具有类似于油菜素内酯或生长素过
量的表型(Li等2001)。另外, Rac还参与了光调控
和植物的育性发育(Byeong等2008)。
苎麻是我国特有的天然纤维植物。Rac作为
植物细胞信号传导的重要分子开关, 在苎麻生长
发育中的功能仍不清楚。本文研究从苎麻转录组
序列分析中, 发现1个苎麻Rac成员, 为了研究其表
达和功能, 以苎麻‘湘苎三号’为材料, 采用RT-PCR
及RACE技术克隆了Rac基因cDNA, 并对其编码的
氨基酸序列和表达特性进行了分析, 为认识Rac在
苎麻生长发育中的功能奠定基础。
材料与方法
1 实验材料
苎麻[Boehmeria nivea (Linn.) Gaudich] ‘湘苎
三号、‘湘苎一号’、‘嘉禾白脚麻’、‘城步青麻’和
‘竹子麻’由湖南农业大学苎麻研究所提供。克隆载
体pMD18-T、DNase I、Tag DNA聚合酶、DNA
Markers、PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA
Synthesis Kit、3′-Full RACE Core Set with
PrimeScriptTM RTase Kit、5′-Full RACE Kit with
TAP等购自Takara公司。RNA提取试剂盒购自长
沙安比奥生物技术有限公司。大肠杆菌DH5α为
本实验室保存。引物合成和测序委托北京六合华
大基因科技股份有限公司进行。
2 方法
2.1 苎麻总RNA提取及cDNA合成
按照RNA提取试剂盒说明提取苎麻根、茎、
叶的总RNA。DNase I去除RNA中残留的少量
DNA后, 进行cDNA第一链的合成, 具体操作步骤
按照cDNA合成说明书进行。
2.2 苎麻Rac基因的克隆与序列分析
根据苎麻转录组中Rac基因5′末端序列及已知
的植物Rac基因序列, 设计引物RacF (5′ ATGAG-
CGCGTCGAGGTTCATCAAGT 3′)和RacR (5′
TGGAGWACCACYTTGATGGCHGCGT 3′), 以‘湘
苎三号’茎cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应
程序为95 ℃预变性4 min; 94 ℃变性1 min, 66 ℃退
火1 min, 72 ℃延伸45 s, 循环35次; 72 ℃最后延伸
10 min。PCR产物回收后, 与pMD18-T载体连接。
重组载体转化大肠杆菌DH5α, 选择阳性克隆进行
测序。
根据已克隆的片段设计3′ RACE引物Rac3R
(5′ ACCCTGGATCAGTGCCCATTACT 3′)和5′
RACE引物Rac5R (5′ TGCCCCACGATAGCT-
CAAAGGTCTTA 3′)。具体操作按照Takara公司3′
RACE和5′ RACE说明书进行。3′ RACE反应程序
为95 ℃预变性4 min; 94 ℃变性1 min, 60 ℃退火1
min, 72 ℃延伸50 s, 循环35次; 72 ℃最后延伸10
min。5′ RACE反应程序为95 ℃预变性4 min; 98
℃变性1 min, 62 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 循
环35次; 72 ℃最后延伸10 min。扩增产物回收后
与pMD18-T载体连接, 挑取阳性克隆进行测序。
将已克隆的苎麻Rac基因序列进行拼接, 根据
拼接结果设计上游引物FRacF (5 ′ GTAATG-
AATCTTCTGAGAGCAGAGGC 3′)和下游引物
RRacR (5′ GGAATTCTAATCATCAGTTGCA-
ATTCAG 3′), PCR扩增Rac全长序列。PCR反应程
序为95 ℃预变性4 min; 94 ℃变性1 min, 60 ℃退火
1 min, 72 ℃延伸1 min 10 s, 循环35次; 72 ℃最后
延伸10 min。PCR产物回收后, 与pMD18-T载体连
接。重组载体转化大肠杆菌后, 选择阳性克隆进
行测序。
运用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
上的ORF f inde r查找序列开放阅读框。采用
ExPASy (http://web.expasy.org)网站上的Compute
pI/MW预测蛋白的分子量和等电点。通过BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比
对分析, 选择与苎麻Rac蛋白同源的其他植物Rac
氨基酸序列用Clustal X进行多序列比对。运用
植物生理学报1370
MEGA 5.1软件Neighbor joining (NJ)算法构建系统
进化树。蛋白质保守结构域的分析通过NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上的conserved
domain search进行。运用在线工具ProtScale
(http://web.expasy.org/protscale/)、Tmpred (http://
embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)、
SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/
SignalP/)、TargetP 1 (http://www.cbs.dtu.dk/
services/TargetP/)、Sopma (http://npsa-pbil.ibcp.fr/
cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和
Swiss-Model (http://beta.swissmodel.expasy.org)对
蛋白质的亲水性/疏水性、跨膜结构域、信号肽、
亚细胞定位、二级结构和三维结构进行分析。
2.3 苎麻Rac基因的表达分析
采用RNA提取试剂盒提取苎麻‘湘苎三号’
根、茎、叶的总RNA及‘湘苎一号’、‘城步青麻’、
‘嘉禾白脚麻’、‘竹子麻’茎的RNA, 再反转录成
c D N A。以苎麻A c t i n基因 ( G e n B a n k登录号
DQ665832)为内参, 分析Rac基因在不同组织及不
同品种中的表达水平。Act in基因扩增引物为
Actin1 (5′ GTTGAACCCTAAGGCTAACAGAG 3′)
和Actin2 (5′ TCAGCTCCGATTGTGATGAT 3′)。
BnRac1基因表达分析引物为Rac1 (5′ CTGATT-
G G A G C T C C C G C G TA C AT 3 ′ )和R a c 2 ( 5 ′
GGAATTCTAATCATCAGTTGCAATTCAG 3′)。
实验结果
1 BnRac1基因的克隆及序列分析
根据苎麻转录组中Rac基因的部分序列和已
知的植物Rac基因序列设计引物, PCR扩增苎麻
Rac基因, 获得大小约为500 bp的目的带(图1-A)。
测序后, 采用NCBI网站的BLAST程序进行同源搜
索, 结果显示该序列与拟南芥、烟草等Rac基因的
同源性在80%以上, 因此确定克隆的序列为苎麻
Rac基因片段。根据已克隆的片段设计3′ RACE引
物和5′ RACE引物, PCR扩增后分别获得了大小约
为450和500 bp的片段(图1-B和C)。将RT-PCR、5′
RACE和3′ RACE扩增片段拼接后, 设计引物扩增
Rac全长, 获得了大小约为1 000 bp的片段(图1-D)。
测序结果表明, 克隆序列全长为1 043 bp, 包括594 bp
开放阅读框、235 bp的5′端非编码区和214 bp的3′端
非编码区, 编码197个氨基酸。预测蛋白的等电点和
分子量分别为9.30和21.65 kDa (图2)。Blast结果表
明, 其与百脉根(GenBank登录号Z73961.1)小分子G
蛋白基因R a c 1序列的相似性为8 7 % , 与蓖麻
(GenBank登录号XM_002510519.1) Rac基因和棉花
(GenBank登录号AF165925.2) Rac1序列的相似性
分别为86%和84%。推导的氨基酸序列与蓖麻
(GenBank登录号XP_002530817.1) Rac蛋白氨基酸
序列的相似性为97%, 与棉花(GenBank登录号
AAD47828.2)和烟草(GenBank登录号AAK31299.1)
Rac1蛋白氨基酸序列的相似性分别为96%和95%
(图3), 因此, 确定克隆的序列为苎麻Rac基因, 鉴于
其是苎麻中首次克隆的Rac以及其与上述植物中
分子的同源性, 命名为BnRac1。
2 BnRac1蛋白的结构及分子进化分析
采用NCBI网站上的Conservered domain search
程序预测BnRac1蛋白保守区, 结果表明, 该蛋白具
图1 BnRac1基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of BnRac1 PCR products
A: BnRac1基因中间核心片段的扩增产物; B: BnRac1基因3 RACE产物; C: BnRac1基因5 RACE产物; D: BnRac1基因cDNA全长扩增
产物。M: DNA分子量标准。
黄丽华等: 苎麻小分子G蛋白Rac1基因的克隆及表达分析 1371
有植物Rac蛋白保守的GTP结合和激活区域、效应
因子结合区和碱性氨基酸区, C末端还具有保守的
异戊烯基化位点CSIL (图3)。
ProtScale等预测结果表明, BnRac1蛋白为亲
水性蛋白, 不含信号肽, 无跨膜区域, 且定位于叶
绿体、线粒体或者分泌到胞外的可能性均比较
小。BnRac1的二级结构包含了37.56%的α螺旋、
5.58%的β折叠、20.81%的延伸链及36.04%的无规
则卷曲。其三级结构与拟南芥AtRac5蛋白具有很
高的的相似度(图4)。
为进一步了解BnRac1与其他植物Rac之间的
进化关系, 从GenBank中选取部分植物Rac蛋白和
人类、果蝇的Rac蛋白, 采用MEGA 5.1软件构建系
统发育树, 结果表明, 植物Rac蛋白与动物Rac蛋白
处于不同的分支, 植物Rac蛋白可以分成RacI和
RacII两个组。苎麻BnRac1属于RacI组, 并且与葡
萄VvRac和棉花GhRac1亲缘关系较近(图5)。
3 苎麻BnRac1基因的表达分析
采用半定量RT-PCR方法分析了BnRac1基因
在苎麻‘湘苎三号’根、茎、叶中的表达水平, 结果
表明, BnRac1 在苎麻根、茎、叶中均有表达, 其中
在叶中的表达量最高(图6)。为了分析BnRac1基因
图2 BnRac1基因cDNA序列及推导的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of BnRac1
起始密码子TAG和终止密码子TGA加粗显示。
植物生理学报1372
在苎麻纤维发育中的作用, 以纤维中木质素含量
不同的品种为材料, 分析Rac1基因的表达水平。
结果显示, 木质素含量不同的品种间, Rac1基因的
表达水平有明显差异(图7和表1)。5个供试品种中,
‘竹子麻’的木质素含量最高, 其茎中Rac1基因的表
达量最高; ‘湘苎一号’的木质素含量最低, 其茎中
Rac1基因的表达量最低(图7)。结果表明, Rac1基
因的表达水平与供试品种的木质素含量存在一定
的相关性。供试品种木质素含量高, Rac1基因的
表达水平就高; 供试品种木质素含量低, Rac1基因
的表达水平就低。
讨　　论
Rac蛋白是细胞内一类重要的信号分子, 参与
了植物细胞许多信号传导过程, 对植物的生长发
育有着重要的影响。研究者已从拟南芥、水稻和
棉花中分离了许多Rac基因(Winge等2000; Zhu等
2011; 李先碧等2005)。结果表明, 植物Rac氨基酸
序列都包含了GTP结合位点、效应因子结合点和
一个变化多样的C末端结构(Yang 2002)。有的Rac
蛋白C末端具有CAAL或CAAX结构(C代表半胱氨
酸, A代表脂肪族氨基酸, L代表亮氨酸, X代表除亮
氨酸以外的任意一种氨基酸)。有的C末端具有
AACG结构(A代表脂肪族氨基酸)。C末端的结构
决定着Rac在细胞内的定位(Yang 2002)。以拟南
芥为材料的研究发现, Rac蛋白C末端上游还具有
一多聚碱性氨基酸区(Winge等2000)。本研究以苎
麻‘湘苎三号’为材料, 采用RT-PCR和RACE技术克
隆了苎麻Rac1基因, 其推导的氨基酸序列具有植
物Rac蛋白保守的GTP结合位点和效应因子结合位
点。C末端包含CSIL结构。BnRac1蛋白不含信号
肽, 无典型的跨膜区域, 而且定位于叶绿体、线粒
体或者分泌到胞外的可能性均比较小, 因此它可
能游离在细胞质中。研究表明, 大多数小分子G蛋
图3 BnRac1氨基酸序列与几种植物Rac的多序列比对
Fig.3 Multiple alignment of deduced amino acid sequence of BnRac1 with other Racs
RcRac: 蓖麻(Ricinus communis) XM_002510519.1; GhRac1: 棉花(Gossypium hirsutum) AAD47828.2; AtRac1: 拟南芥(Arabidopsis
thaliana) NP_179371.1; NtRac1: 烟草(Nicotiana tabacum) AAK31299.1。
图4 苎麻BnRac1三级结构模型
Fig.4 Tertiary structure model of BnRac1
黄丽华等: 苎麻小分子G蛋白Rac1基因的克隆及表达分析 1373
表1 供试品种及其纤维的木质素含量
Table 1 Tested varieties and their lignin contents in fibers
品种 纤维木质素含量/%
‘湘苎一号’ 　　　0.84
‘湘苎三号’ 　　　1.19
‘嘉禾白脚麻’ 　　　1.63
‘城步青麻’ 　　　2.03
‘竹子麻’ 　　　2.31
是在胞质中游离。但只有和质膜偶联的小分子G
蛋白才能被鸟核苷酸转换因子(GEF)激活进行信
号传导。许多小分子G蛋白与膜的结合是通过转
录后的修饰来介导的。如通过C末端半胱氨酸的
异戊二烯化 , 使小分子G蛋白定位于质膜(Yang
2002)。BnRac1蛋白C末端包含CSIL结构。该序列
能被异戊二烯基转移酶酯化修饰(Yang 2002)。这
种修饰可促使BnRac1蛋白与膜结合, 并且与下游
因子相互作用而传递信号。
植物中Rac基因家族有多个成员, 如拟南芥中
图6 BnRac1基因在不同组织中的表达分析
Fig.6 The semi-quantity of BnRac1 in different issues
图7 BnRac1基因在5个木质素含量不同的
苎麻品种中的表达分析
Fig.7 The semi-quantity of BnRac1 in five varieties
of B. nivca with different lignin contents
1: ‘湘苎一号’; 2: ‘湘苎三号’; 3: ‘嘉禾白脚麻’; 4: ‘城步青麻’;
5: ‘竹子麻’。
图5 苎麻BnRac1与其他物种Rac蛋白的系统进化树分析
Fig.5 Phylogenetic tree analysis of the BnRac1 and Rac proteins from other species
AtRac6: 拟南芥NP_195320.1; AtRac11: 拟南芥NP_190698.1; TcRac1: 可可(Theobroma cacao) EOX90795.1; NtRac1: 烟草AAK31299.1;
SdRac: 野甘草(Scoparia dulcis) ACM07419.1; VvRac1: 葡萄(Vitis vinifera) XP_002272532.1; GhRac1: 棉花AAD47828.2; AtRac2: 拟南芥
NP_199409.1; GhRac9: 棉花Q41254.1; GhRac13: 棉花Q41253.1; AtRac7: 拟南芥NP_194624.1; OsRac1: 水稻(Oryza sativa) BAA84492.1;
OsRac3: 水稻NP_001048088.1; AtRac10: 拟南芥NP_201093.1; AtRac8: 拟南芥NP_566897.1; AtRac9: 拟南芥NP_566024.1; HsRac1: 人(Homo
sapiens) NP_008839.2; DmRac2: 果蝇(Drosophila melanogaster) NP_001261517.1。
白都有两种存在方式: 一种是与质膜偶联, 另一种
植物生理学报1374
揭示了11个Rac基因(Winge等2000)。研究发现, 拟
南芥中这些Rac基因的表达具有组织特异性。
AtRac1、AtRac3、AtRac4、AtRac5和AtRac6在
根、茎、叶及花序中都有表达, AtRac1和AtRac3在
种子中也有表达。AtRac2只在根和茎中表达, 在
叶、角果、花序及种子中不表达(Winge等1997)。
AtRac11在花粉管和花药中特异性表达, 在成熟花
粉中AtRac11的表达量高于AtRac1和AtRac6的表达
量(Li等1998)。Rac基因种类的多样性及其表达的
特异性说明它们具有复杂的功能。本研究发现,
BnRac1基因在苎麻根、茎、叶中都表达, 但在叶
中的表达量最高。纤维木质素含量不同的品种间,
Rac1基因在茎中的表达量存在明显差异。木质素
含量高的品种, 其茎内Rac1基因的表达水平高; 木
质素含量低的品种, 茎内Rac1基因的表达量低。
表明BnRac1基因表达与苎麻茎秆木质素含量成相
关性。Kawasaki在研究水稻OsRac1的功能时发现,
表达组成型活性OsRac1的转基因水稻细胞中木质
素的含量提高。研究证实, 水稻木质素合成的关
键酶肉桂酰辅酶A还原酶OsCCRI (cinnamoyl-CoA
reductase I)是OsRac1的效应因子(Kawasaki等2006)。
BnRac1基因也有可能通过这一途径影响木质素的
合成, 但具体的分子机制尚需进一步探讨。
参考文献
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