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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-05-31
基金项目 : “973”计划项目（2009CB941600）
作者简介 : 李粉 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : miRNA 与骨骼肌 ; E-mail:lifen198499@163.com
通讯作者 : 陈华群 , 女 , 副教授 , E-mail:chenhuaqun@njnu.edu.cn
C2C12 成肌细胞诱导肌性分化过程中
miR-101a 的表达
李粉 王丽 郑艳艳 陈华群
（南京师范大学生命科学学院 江苏省分子医学生物技术重点实验室，南京 210046）
摘 要： 以 C2C12 成肌细胞为模型，在分化培养基中诱导 C2C12 建立体外肌性细胞分化模型。以 poly（A）3-端加尾和实
时定量 PCR 方法研究 miR-101a 在 C2C12 细胞分化过程中的表达情况。结果发现，在细胞转入分化培养基进行肌性分化的 1-5 d 中 ,
miR-101a 的表达量逐渐增加，提示 miR-101a 可能在肌肉发生中发挥调控作用。
关键词： C2C12C 成肌细胞 实时定量 PCR miR-101a 肌分化
The Expression of miR-101a in C2C12 Myoblast
During Myogenic Differentiation
Li Fen Wang Li Zheng Yanyan Chen Huaqun
（Jiangsu Key Laboratory for Molecular and Medical Biotechnodogy， College of Life Sciences, Nanjng Normal University, Nanjing 210046）
Abstract: In order to establish muscle differentiation model, the C2C12 myoblast cells were incubated in differentiation medium （DM）
and induced to myogenic differentiation. The expression of mature miR-101a was examined by poly（A） tail addition at 3-end and Real-time
PCR method. The results showed that the level of mature miR-101a was gradually increased during the induction time from 1 day to 5 days after
the cells changed to DM, suggesting that miR-101a may play regulatory roles in myogenesis.
Key words: C2C12 myoblast Real-time PCR miR-101a Myogenic differentiation
在个体发育中，肌肉组织的发育主要表现为肌
细胞数量的增加和肌细胞体积的膨胀两个方面，这
两方面的完成依赖于细胞的增殖和分化［1］。小鼠
C2C12 成肌细胞在体外可以模拟肌肉发生过程。在
营养因子丰富的培养基中，C2C12 保持增殖状态 ；
当培养基中营养因子缺乏时，则退出细胞周期、停
止增殖，分化为肌管细胞并融合为肌纤维［2］。
肌肉发育过程中许多调节因子包括转录因子、
细胞信号分子如生肌调节因子、锌指蛋白、Wnt 家
族成员等在肌细胞的增殖、分化中发挥重要作用［3］。
microRNA（miRNA）是一类大小为 22 nt 的小分子
非编码 RNA, 通过其 5 端种子序列（seed sequence）
与 靶 基 因 mRNA 3 端 非 翻 译 区（3-untranslated
region, 3UTR）的互补配对而抑制蛋白质的翻译或
促进 mRNA 的降解，在转录后水平调节蛋白质的表
达［4］。miRNAs 作为一种新的蛋白表达调节机制被
广泛报道。已有的研究发现，miRNAs 对于肌肉的发
育过程具有重要调节作用［5］；miRNAs 在一些肌肉
疾病的发生发展中也具有重要作用［6］。继续发现并
研究对于肌肉发育具有调节作用的 miRNAs 是目前
肌肉发育调节研究的热点之一。有研究利用 DNA 芯
片技术研究结果发现，在猪的骨骼肌中，miR-101a
有较高的表达水平［7］。miR-101a 是否具有调节骨骼
肌发育的作用，目前未见报道。本试验利用小鼠成
肌细胞系 C2C12 细胞建立肌分化模型，通过 poly（A）
3- 端加尾和实时定量 PCR 方法研究了 miR-101a 在
2012年第1期 117李粉等 ：C2C12 成肌细胞诱导肌性分化过程中 miR-101a 的表达
该过程中的表达变化。结果发现，随着肌细胞分化
的进行，其表达量逐渐增加，提示 miR-101a 可能在
肌发生中发挥调节作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 DMEM 培养基、胎牛血清、Trizol 均
为 Invitrogen 公司产品 ；马血清购自 HyClone 公司 ；
DEPC 为 TIANGEN 公 司 产 品 ；poly（A） 多 聚 酶 为
NEB 产 品 ；rATP 购 自 Promega 公 司 ；Taq 酶、 反
转 录 试 剂 盒 及 SYBR Premix Ex TaqTM 试 剂 盒 均 为
TaKaRa 公司产品 ；MHC 抗体（MF20）购自 DSHB。
1.1.2 引物 试验所中用引物均在上海生工合成，
序列如下：RT-引物：-5GCTGTCAACGATACGCTACG
TAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
C-3；通用引物用于各种 miRNA，序列为：5-GCTGTC
AACGATACGCTACGTAACG-3；miR-101a 引物：5-TA
CAGTACTGTGATAACTGAA-3；miR-133 引物为：5-T
TTGGTCCCCTTCAACCAGCTG-3 ；5sRNA 为内参照，
序列为 ：5-TCTACGGCCATACCACCCT-3。
1.2 方法
1.2.1 细 胞 培 养 C2C12 细 胞 用 增 殖 培 养 基 GM
（DMEM+10% FBS+1% 双 抗 ） 培 养， 培 养 条 件 为
37℃、5% CO2，到达传代密度时用 0.25% 胰酶消化
后将细胞分种到直径为 3.5 cm 的培养皿中。细胞数
量达到 75% － 80% 时转到不含胎牛血清、含有 2%
马血清（HS）的 DMEM 分化培养基中（DM）进行
肌分化的诱导，分别于 0、1、3 和 5 d 后收集细胞，
分别记为 D0、D1、D3 和 D5。
1.2.2 免疫荧光 细胞用 1×PBS 清洗 2 次，加入
1 mL 4% 多聚甲醛固定 30 min 后，以 1×PBS 清洗，
然后加入 0.5% Triton X-100 破膜，10 min 后 1×PBS
清洗 2 次，5% 羊血清室温封闭 1 h，MHC 抗体（1
50）4℃孵育过夜，PBST 清洗后，荧光二抗室温孵
育 1 h 后封片，拍照。
1.2.3 小 RNA 的提取及加 poly（A）加尾 Trizol 法
提取细胞总 RNA，以 1% 普通琼脂糖凝胶电泳鉴定
总 RNA 的质量并以 NanoDrop ND-1000 测定 RNA 浓
度及纯度。取总 RNA 2 μg，加 6 U poly（A）多聚酶
和 4 μL rATP，37℃反应 40 min。以酚 氯仿 异戊醇
（25 24 1）和醋酸（2 mol/L pH4.0）及异丙醇抽提、
沉淀小 RNA。
1.2.4 实时定量RT-PCR反应 以上述获得的小RNA
（500 ng）进行逆转录（reverse transcription, RT）及
实时定量 PCR 反应。反应体系中含 RT- 引物 0.5 μL，
5×PrimeScriptTM Buffer 2 μL，PrimeScriptTM RT Enzyme
Mix 0.5 μL，以无 RNase 的 H2O 补充至 10 μL。42℃、
15 min，85℃、5 s 逆转录为 cDNA。稀释 5 倍备用。以
cDNA 模板 2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM （2×）10 μL，
通用引物（10 μmol/L）0.4 μL，miR-101a 或 miR-133
引物（10 μmol/L）0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，在 Bio-Rad
qPCR 仪 上 进 行 实 时 定 量 PCR 扩 增， 扩 增 程 序 ：
95 ℃ 预 变 性 10 s，95 ℃ 变 性 5 s，60 ℃ 复 性 20 s，
72℃延伸 15 s （40 个循环），55℃ 熔解 10 s。
2 结果
2.1 C2C12分化模型的建立
C2C12 细胞分种到直径 3.5 cm 培养皿中，数量
达到 75%-80% 时，以 DM 培养基更换原来的 GM 培
养基诱导细胞向成肌方向分化，分别诱导 0、1、3
和 5 d，免疫荧光检测各诱导组肌肉蛋白重链（MHC）
的表达变化（图 1）。可以看到，在诱导第 0 天没有
MHC 的表达，诱导 1 天后，MHC 开始表达，随着
诱导时间的延长，MHC 的表达逐渐增多，并且细胞
开始融合，到第 5 天时，出现长的肌管。以上试验
结果表明，C2C12 细胞在 DM 中肌性分化的诱导成
图 1 C2C12 分化过程中免疫荧光显示 MHC 的表达变化（倒置显微镜 100×）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期118
功建立，可用于以下研究。
2.2 C2C12肌分化过程中miR-101a的表达
提取的总 RNA 有明显的 3 条带（图 2），表明
成功提取总 RNA。总 RNA 经加尾、酚 / 氯仿 / 异
戊醇抽提、异丙醇沉淀及逆转录后实时定量 PCR
测定 miR-101a 的表达。结果（图 3-A）发现，在
C2C12 成肌细胞分化过程中，miR-101a 的表达逐
渐显著上调。
3 讨论
了解 miRNA 在基因调控中扮演的角色，很重
要的一个方法就是迅速、 准确地定量检测 miRNA 的
表达，因此找到合适的检测方法成为本试验的关键。
检测 miRNA 的方法主要有以下几种 ： （1）Northern
blotting 是现在检测 miRNA 表达最主要的手段。这
种方法的优点在于灵敏度高且可以排除其他小分
子 RNA 的污染，但是对样品的需求量较高［8］。（2）
RT-PCR 也被用来检测 miRNA 前体的表达水平，但
miRNA 前体需经过加工成为成熟的 miRNA, 其表达
水平并不一定和成熟 miRNA 的表达水平一致。实
时荧光定量 PCR（Real-time PCR）被用于定量分析
miRNA 的表达。因为 microRNA 本身序列短的特点，
设法延长其序列是目前应用最普遍的方法，本试验
中用到的方法是在参考前人［9］方法的基础上做了适
当改进，首先在 RNA 的 3 末端加 poly（A）尾，再
用 5 端带有 40 nt 延伸序列的 Olig-dT 引物进行反转
图 2 C2C12 细胞肌性分化不同时间提取的总
RNA 及其质量鉴定
A. C2C12 分化过程中 miR-101a 的表达 ; B. miR-133 作为试验对照 ；* 代表与 D0 相比 P<0.05，
** 代表与 D0 相比 P<0.01，*** 代表与 D0 相比 P<0.001
图 3 C2C12 分化过程中 miR-101a 的表达
录，得到 80 bp 左右的 cDNA，然后用特异引物进行
实时定量 PCR 扩增。本研究用该方法检测了 C2C12
分化中 miR-133 的表达，miR-133 为肌肉特异性表
达的一种 microRNA，无论在骨骼肌发育还是在骨骼
肌相关疾病中都发挥重要调控作用。有研究报道，
C2C12 成肌细胞融合为多核肌管的过程中，miR-133
的表达明显增加［10］，本试验中用实时定量 PCR 扩
增得出同样的结论，说明本试验使用的测定 miRNA
表达的方法是可信的。
关于肌肉发育中相关 microRNA 的研究，主要
是通过高通量的基因芯片检测 C2C12 分化过程中或
肌肉发生过程中 microRNA 的表达变化实现的初步
筛选［11］，推测表达变化显著的 microRNA 可能在肌
肉发生过程中发挥作用，然后继续进行功能研究。
肌肉特异性表达的 microRNA，如 miR-1、miR-133、
miR-206 在肌肉中的作用就是通过这种方法确立
的［10］。鉴于基因芯片费用较高，本试验中用加尾
RT-PCR 方法检测了 miR-101a 在 C2C12 成肌细胞分
2012年第1期 119李粉等 ：C2C12 成肌细胞诱导肌性分化过程中 miR-101a 的表达
化过程的表达情况。
4 结论
本研究发现在分化过程中 miR-101a 表达量明显
高于增殖期，且随着分化的进行其表达量越来越多，
很多在肌发生中起重要调控作用的 microRNA 都呈
现 这 种 表 达 模 式， 如 miR-24［12］，miR-26a［13］ 等。
miR-101a 的这种表达模式，提示其可能在肌肉发育
中发挥重要作用，对于其具体作用，将进行后续研究。
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（责任编辑 马鑫）