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菌物学报
jwxt@im.ac.cn 15 July 2015, 34(4): 712‐716
Http://journals.im.ac.cn Mycosystema ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q © 2015 IMCAS, all rights reserved.
研究论文 Research paper DOI: 10.13346/j.mycosystema.150075
基金项目：国家重点基础研究发展计划（2014CB138301）
*Corresponding author. E‐mail: zhangxiaoyu@hust.edu.cn
收稿日期：2015‐03‐02，接受日期：2015‐05‐10
糙皮侧耳生长发育过程中漆酶基因家族的表达研究
卓睿 马富英 周帅 张晓昱*
华中科技大学生命科学与技术学院 湖北 武汉 430074
摘 要：漆酶参与木质素的降解和食用菌的生长发育。为了明晰漆酶基因在糙皮侧耳生长发育过程中的作用，本文采用
real‐time PCR 检测了 11 条漆酶基因及 Lacc2 的小亚基 sspoxa3 在糙皮侧耳生长发育不同阶段的表达。其中 lacc6 和 sspoxa3
在整个生长发育阶段表达量均较高；lacc12 随着原基的分化和子实体的形成大量表达，与成菇过程有关。lacc4，lacc7 和
lacc11 在原基分化期高表达，与原基的分化有关。lacc2，lacc3 和 lacc8 在成熟子实体阶段表达量显著上升，与子实体的分
化和成熟有关。
关键词：食用菌，漆酶，原基，子实体，实时定量 PCR
Expression of laccase gene family in different development stages of
Pleurotus ostreatus
ZHUO Rui MA Fu‐Ying ZHOU Shuai ZHANG Xiao‐Yu*
College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Hubei 430074, China
Abstract: Laccases are involved in lignin degradation and mushroom development. In order to further determine the role of
laccases in fruiting of Pleurotus ostreatus, expressions of 11 laccase genes and a small subunit of Lacc2 (sspoxa3) in different
stages of fungal development were analyzed by real‐time PCR. lacc6 and sspoxa3 are highly expressed throughout the growth
and development stage. lacc12 is highly expressed during primordium differentiation and fruiting body formation, suggesting
that lacc12 functions in fruiting. lacc4, lacc7 and lacc11 are highly expressed in primordium stage, indicating they are related
with primordium differentiation. lacc2, lacc3 and lacc8 are relevant to fruiting body differentiation and maturation, with high
expression during mature fruiting stage.
Key words: edible mushroom, laccase, primordium, fruiting body, real‐time PCR
食用菌的生长发育大体分为菌丝体营养生长、
原基分化和子实体发生发育 3 个阶段。根据子实体
发育程度的不同，又将其分为幼小子实体和成熟子
实体两个阶段。漆酶在食用菌生长发育过程中起重
要作用，除了参与培养料中木质素的降解，还调
控原基分化、子实体的形态建成和发育（Zhao &
Kwan 1999）。
通过酶活性检测发现，大多数食用菌在营养生
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长阶段，漆酶活性逐渐升高，进入生殖生长后，漆
酶活性下降（潘迎捷和陈明杰 1991；张晓昱
1995；倪新江等 2001）。
而对单一漆酶基因的表达研究结果则不尽如
此。Chen et al.（2004）采用 RT‐PCR 分析，发现草
菇漆酶基因 lac4 在子实体形成发育期高表达，并
在针头期达到高峰，而在营养期检测不到。吴光美
等（2014）通过实时定量 PCR 发现金针菇漆酶基
因 fv‐lac4 在菌丝阶段表达量很低，从原基形成开
始出现高表达，并且菌柄的表达量高于菌盖。说明
这些漆酶基因可能与子实体形成和发育有关。
前期我们已在 Pleurotus ostreatus BP2 中获得
11 条漆酶基因及 Lacc2 的小亚基 sspoxa3，为了考
察这些漆酶基因在糙皮侧耳生长发育过程中的作
用，本文通过实时定量 PCR 检测了这些漆酶基因
在糙皮侧耳生长发育不同阶段的表达情况。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株：糙皮侧耳 Pleurotus ostreatus
BP2，华中农业大学菌种实验中心王卓仁主任惠赠。
1.1.2 培养基：土豆蔗糖琼脂培养基（PSA），用于
菌种的培养。糙皮侧耳栽培培养基：78%木屑，10%
麸皮，10%玉米芯，1%硫酸钾，1%碳酸钙，加水
量 60%。每瓶湿重 50g，120℃灭菌 1h。
1.2 方法
1.2.1 糙皮侧耳不同生长发育阶段菌体的收集：从
PSA 平板上打孔，接入栽培培养基中，每瓶接种 4
块。于 28℃黑暗培养 30d，当固体培养基完全被
菌丝覆盖时收集菌丝体；然后刮去表面菌丝促进出
菇，并置于 15℃、散射光照、相对湿度 90%的培
养室内，约 15d 后出现原基，原基出现后幼小子
实体、成熟子实体大概分别于 7d、15d 后形成。
分别收集原基、幼小子实体和成熟子实体时期的菌
丝体，无菌水洗去残留培养基后液氮迅速冷冻置于
‐80℃冰箱，以备后续的 RNA 提取及实时定量 PCR
分析。
1.2.2 实时定量 PCR检测糙皮侧耳漆酶基因的转
录：用 TRIzol RNA 提取试剂盒提取不同生长发育时
期样品的总 RNA，作为反转录的模板，使用
PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser
（TaKaRa）对总 RNA 进行反转录合成 cDNA，使用
表 1 中相应的实时定量 PCR 引物，以 cDNA 为模板
进行实时定量 PCR 检测。
表 1 实时定量 PCR 所用引物及其序列
Table 1 Primer sequences used for real‐time PCR
基因
Gene
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence (5’‐3’)
lacc1 lacc1 RT‐Fw ACGAGTTACCACCAAACAAAGTCA
lacc1 RT‐Rv CATCTGTGCTGACACCAGTATTGA
lacc2 lacc2 RT‐Fw TTCGTATCTCTCTCCTTCGGTTC
lacc2 RT‐Rv CTATTCGAAGTGCGAACAATGTC
lacc3 lacc3 RT‐Fw GTAAGAAGTGCAGGAAGCTCAACA
lacc3 RT‐Rv CCCGTTCCGGTGGAAAC
lacc4 lacc4 RT‐Fw AACGCTACTCCTTTGTTCTCCAC
lacc4 RT‐Rv GATCGACTTCTCGCATAGGATTC
lacc6 lacc6 RT‐Fw AACGTCACCATCCGATTTGTAG
lacc6 RT‐Rv TATTGGGCAAAGATTGTTCCAG
lacc7 lacc7 RT‐Fw CGGCAACTCCACATACAACTTC
lacc7 RT‐Rv TGCAACGCCATTGGAGACT
lacc8 lacc8 RT‐Fw AACACTACGAAACCGCTCATTGAA
lacc8 RT‐Rv TTGGTTGTTCGTGGTGAAAAGAGT
lacc9 lacc9 RT‐Fw CCTGTCCTTCTTCAAATTCTCTCA
lacc9 RT‐Rv TCCTAATAACGTCGAAGGTGTGAC
lacc10 lacc10 RT‐Fw CAAATTCTTTCAGGAGCGTCAAC
lacc10 RT‐Rv GGCACTCCTGATAACATCGAAAG
lacc11 lacc11 RT‐Fw CCTGAATGGTCTGATCTCTGC
lacc11 RT‐Rv CCTATGACTTGGGCTCTTCG
lacc12 lacc12 RT‐Fw AGTTCGACATACAACTTCGCTAACC
lacc12 RT‐Rv CGCCTGTGACACCGGTAGAT
sspoxa3 sspoxa3 RT‐Fw TTAGAAACGAACTCAATGAACTCACCG
sspoxa3 RT‐Rv CGAGCATCATTACACGGACGAG
tubulin tubulin RT‐Fw AGGCTCTCTACGACATTTGCTTC
tubulin RT‐Rv GAAAGGAACCATGTTAACGGCTA
ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q Mycosystema July 15, 2015 Vol. 34 No. 4
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实时定量 PCR 检测使用 iCycler iQ5 real‐time
PCR（Bio‐Rad）检测仪，反应体系为：1µL cDNA
作为模板，2µL 定量正向引物（2µmol/L），2µL 定
量反向引物（2µmol/L），5µL ddH2O，10µL 1*SYBR
Premix Ex Taq II（TaKaRa），总体积 20µL。反应条件：
95℃ 10min 循环 1 次；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃
30s，30 个循环；最后温度由 55℃渐升至 95℃测
定溶解曲线，确定产物特异性。
1.2.3 实时定量 PCR 检测结果的计算：本文所测引
物效率接近 100%，使用 Livak（2‐△△CT）法（Bio‐Rad
荧光定量应用指南）计算不同生长发育阶段糙皮侧
耳漆酶基因转录的相对倍数。
以微管蛋白基因（tubulin）为内参基因，进行
实时荧光定量 PCR 检测漆酶基因转录量的变化。
对所有测试样本和对照样本，均采用内参基因
（tubulin）的 CT值归一目标基因（laccase）的 CT值。
对于某一特定发育阶段漆酶基因表达量的计
算如下：
△CT(stageA)=CT(laccase, stageA)‐CT(tubulin, stageA)
其相对内参基因归一化的表达量=2‐△CT
同样的，另一发育阶段漆酶基因表达量的计算
如下：
△CT(stageB)=CT(laccase, stageB)‐CT(tubulin, stageB)
其相对内参基因归一化的表达量=2‐△CT
而两个发育阶段漆酶基因表达量的比率计算
如下：
△△CT=△CT(stageA)‐△CT(stageB)
表达量的比值=2‐△△CT。
2 结果与分析
用于实时定量 PCR 检测糙皮侧耳不同生长发
育阶段漆酶基因表达的 4 个时期分别为：菌丝体
时期、原基分化期、幼小子实体期和成熟子实体
期（图 1）。
在 4 个不同生长发育阶段糙皮侧耳基因家族
的 11 条漆酶基因的转录水平见图 2。所有的相对
表达量均以内参基因 tubulin 为基础计算而得。在
糙皮侧耳的 4 个生长发育时期，lacc 6 表达量均最
图 1 糙皮侧耳的不同生长发育阶段 M：菌丝体时期；P：原基时期；YF：幼小子实体时期；MF：成熟子实体时期.
Fig. 1 Different development stages of Pleurotus ostreatus. M: Mycelium; P: Primordium; YF: Young fruiting body, MF: Mature
fruiting body.
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图 2 糙皮侧耳不同生长发育阶段漆酶基因家族表达模式
Fig. 2 Expression patterns of laccase genes in different
developmental stages of Pleurotus ostreatus.
高，其转录水平明显高于漆酶基因家族中的其他基
因，其次为 sspoxa3，说明这两个基因在糙皮侧耳
生长发育的不同阶段均起作用；lacc9 在 4 个时期
均只有微量的表达，可能在糙皮侧耳的生长发育过
程中不起作用。lacc1 和 lacc4 的表达有相似的规
律：随着菌丝体的生长和原基的分化，其表达量逐
渐升高，而随着子实体的形成其表达量下降，随后
又稍有上升，因此原基分化期表达量相对较高，幼
小子实体期最低。lacc4 在前两个时期表达量高于
lacc4，后两个时期二者都很低。lacc2 和 lacc8 有着
相似的规律，幼小子实体期表达量最低，成熟子实
体期表达量最高，随着菌丝体的生长和子实体的形
成，lacc2 和 lacc8 的表达量逐渐降低，而随着子实
体的进一步发育，其表达量又显著升高。lacc3 在
子实体成熟前表达量很低，而成熟子实体期表达量
显著升高。lacc7 在原基分化期最高，其他 3 个时
期都很低，而 lacc8 刚好相反，在原基分化期最低，
其他 3 个时期都较高，子实体成熟期最高。lacc10
在 4 个时期都很低，且随着生长发育逐渐升高。
lacc11 在营养期表达量很低，随着原基的分化和子
实体的形成，表达量迅速上升，幼小子实体期达到
最高，随着子实体的成熟而迅速下降。lacc12 在营
养期表达量很低，随着原基的分化和子实体的形
成，表达量迅速上升，幼小子实体期达到最高，随
着子实体的成熟稍有下降。
3 讨论
糙皮侧耳是一种常见的白腐食用菌，其产量在
我国食用菌产业中位居第一位。糙皮侧耳产量的形
成与其对基质中木质纤维素的降解利用和子实体
的形成发育密切相关。漆酶不仅参与木质素的降
解，还调控子实体的形成和发育（Harkin et al.
1974；Leatham & Stahmann 1981；Wood 1985；Zhao
& Kwan 1999；Chen et al. 2004；Wang et al. 2015）。
糙皮侧耳中漆酶基因较多，它们的表达受营
养、培养条件、诱导物和生长发育阶段影响。本
文采用 RT‐qPCR 分析了糙皮侧耳生长发育的 4 个
重要阶段：菌丝体期、原基分化期、幼小子实体
期和成熟子实体期 11 条漆酶基因的表达。有的在
整个生长发育过程中均表达，有的仅在某一阶段
或某几个阶段表达，这是由其编码的蛋白质在糙
皮侧耳生长发育过程中发挥的生理学功能不同而
引起的不同时间的表达。如 lacc6 和 sspoxa3 在 4
个阶段表达量均较高，说明它们在糙皮侧耳的整
个生长发育过程中均发挥了重要作用。lacc12 随
着原基的分化和子实体的形成大量表达，证实了
他人报道的 lacc12 与糙皮侧耳的成菇过程相关
（Palmieri et al. 2000；Lettera et al. 2010）。lacc4，
lacc7 和 lacc11 在原基分化期高表达，说明它们可
能与原基的形成过程有关，参与原基形成过程中
细胞内的多种生物过程。lacc2，lacc3 和 lacc8 在
成熟子实体阶段表达量显著提升，可能与糙皮侧
耳子实体各部位的分化和成熟有关。Pezzella et al.
（2013）观察到 lacc 10 在子实体阶段出现下降，
而我们的结果显示其稍有提升，但整体水平较低，
可能与菌株或培养基成分有关。
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