全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-08-11
作者简介 : 吴鸣谦 , 女 , 博士研究生 , 研究方向 : 内生真菌的遗传多样性 ; E-mail: wumq28@yahoo.com.cn.
通讯作者 : 陈双林 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 菌物与微生物资源多样性 ; E-mail: chenshuanglin@njnu.edu.cn
拟茎点霉 ISSR-PCR反应体系的优化
吴鸣谦 闫淑珍 陈双林
（南京师范大学生命科学学院，南京 210046）
摘 要： 旨在探讨 Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、引物和模板 DNA等因素对 ISSR-PCR扩增的影响，采用单因子试验和正
交设计方法相结合建立并优化拟茎点霉反应体系。在此基础上进行引物筛选，同时通过梯度 PCR试验，确定引物的最佳退火温度。
通过对 19个拟茎点霉菌株的检验，结果表明已确立的体系稳定可靠，对不同模板均有较好的适用性和通用性，为利用 ISSR技术
对拟茎点霉进行遗传分析奠定基础。
关键词： 拟茎点霉 分子标记 正交设计 单因子试验
Optimization of Inter-simple Sequence Repeat PCR Reaction
System for Phomopsis
Wu Mingqian Yan Shuzhen Chen Shuanglin
（College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210046）
Abstract: The single-factor and orthogonal design were used to establish and optimize the ISSR-PCR reaction system for Phomopsis.
The effects of 5 factors including Taq DNA polymerase, dNTP, Mg2+, primers and the template DNA on the PCR reaction were analyzed. On this
basis, 10 primers were screened with stable amplification and rich polymorphism, the optimal annealing temperature for ISSR-PCR reaction was
proposed by gradient PCR. This optimized ISSR reaction system was proved stable and credible for the amplifications for 19 strains of Phomopsis,
which would provide the basis for the genetic analysis of Phomopsis.
Key words: Phomopsis Molecule marker Orthogonal design Single factor test
拟茎点霉属（Phomopsis（Sacc.）Bubak）是腔
孢纲真菌中的一个大属，作为重要的植物病源菌［1］
和常见的内生真菌［2］，在植物病害防控、物种多
样性、生态以及生物活性产物等领域有重要的研究
价值［3, 4］。
简单重复序列区间扩增（Inter-simple sequence
repeat，ISSR）是利用 SSR 的特点检测基因组中两个
SSR 之间的一段短的 DNA 序列上的多态性［5］。目前
该技术已在真菌的遗传多样性与遗传结构分析、种
属间遗传关系探讨、遗传图谱构建等诸多领域得到
了广泛应用［6, 7］，目前尚未见对拟茎点霉的 ISSR 研
究报道。本研究旨在进行拟茎点霉 ISSR-PCR 反应
体系的优化和引物筛选，为其在拟茎点霉遗传多样
性分析和指纹图谱鉴定等领域提供理论基础和科学
依据。
目前，有关 ISSR 反应体系优化的报道大多采用
单因素试验或正交试验两种方法［8, 9］。单因素试验
可以较系统和精细地研究各主要因子的影响，但费
时费力同时无法探讨各因素间的互作效应 ；正交设
计可以更有效地分析不同因素的相互作用，快速找
到最佳水平组合，克服盲目性，从而弥补单因素试
验的不足［10］。本试验首先采用单因子设计探讨 Taq
DNA 聚合酶、dNTP、Mg2+、引物和模板 DNA 等 5
个因素对扩增反应的影响，然后根据单因素试验的
结果进行正交设计筛选出适合拟茎点霉的 ISSR-PCR
反应体系。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期124
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 供试菌株由本研究室从新鲜的杜
仲叶片中分离获得。分类依据主要参照 Sutton［11］、
Uecker［12］、姜子德［13］、戚佩坤等［14］文献中描述的
方法。菌种均保存于南京师范大学微生物与生物技
术实验室。
1.1.2 试剂和仪器 dNTP、Taq DNA 聚合酶、DL2000
Marker 等均购自上海生工，ISSR 引物是根据哥伦
比亚大学（UBC ）公布的通用引物，由上海生工
合成，其它生化试剂均为国产分析纯。扩增反应在
PTC-100 扩增仪上进行。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 提取 保存的菌种活化后接种到
马铃薯葡萄糖液体培养基中，25℃、100 r/min 培养
3 d 后收集菌丝体。冷冻干燥后取 0.1 g 菌丝体石英
砂研磨后采用 CTAB 法提取菌体基因组 DNA。
1.2.2 单因素试验 对 Taq DNA 聚合酶、dNTP、
Mg2+、引物和模板分别设计 6 个浓度梯度进行试验，
Taq DNA 聚合酶用量：0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5 U；
dNTPs 浓度：0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3 mmol/L；
Mg2+ 浓度：1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mmol/L；引
物浓度 ：0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 μmol/L，模板
浓度 ：0.25，0.5，0.75，1，2，3 ng/μL。
原初 ISSR 扩增反应体系为 20 μL，含 1.0 U Taq
DNA 聚合酶，2 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTPs，
0.4 μmol/L 引物，1 ng/μL 模板 DNA。PCR 扩增反应
程序 ：94℃预变性 5 min，94℃变性 50 s，50℃退火
1 min，72℃延伸 1.5 min，共 36 个循环 ；72℃最后
延伸 5 min，4℃保存。扩增产物以 DL2000 作为标
准分子量对照，在含 EB 的 1.5% 的琼脂糖凝胶中电
泳，紫外凝胶成像系统（Gel Doc-It Imaging System）
观察拍照。
1.2.3 正交设计 参考单因素试验的结果，针对
Taq酶、dNTP、Mg2+ 和引物 4 种因素，选用 L9（34）
正交表，设计的各反应成分的因素水平及处理组
合如表 1 所示。除表中变化因素外，每管中还含有
1×PCR buffer 和 20 ng 模板 DNA。
表 1 正交试验设计表 L9（34）
处理组合
因素
Taq酶用量（U） dNTPs 浓度（mmol/L） Mg2+ 浓度（mmol/L） 引物浓度（μmol/L）
1 0.4 0.1 1.2 0.1
2 0.6 0.1 1.6 0.2
3 0.8 0.1 2.0 0.3
4 0.4 0.2 2.0 0.2
5 0.6 0.2 1.2 0.3
6 0.8 0.2 1.6 0.1
7 0.4 0.3 1.6 0.3
8 0.6 0.3 2.0 0.1
9 0.8 0.3 1.2 0.2
1.2.4 引物筛选及优化体系的应用 采用 50℃的
退火温度对 80 条 ISSR 引物进行初步筛选。筛选
到的引物在 PCR 仪的温度梯度模式进行扩增，在
42.5-61.6℃之间设定 10 个梯度，最终根据扩增
效果确定最佳退火温度。为检验扩增反应的稳定
性及对不同模板的通用性，随机选取筛选的 826
号引物对 19 个拟茎点霉菌株的基因组 DNA 进行
PCR 扩增。
2 结果
2.1 DNA质量检测结果
高质量的模板 DNA 是进行 ISSR-PCR 扩增的基
础。由图 1 可以看出提取的 DNA 质量和纯度都比较
高，可用于后续 ISSR-PCR 反应。将样品浓度稀释至
20 ng/μL，置 -20℃冰箱保存备用。
2012年第3期 125吴鸣谦等 ：拟茎点霉 ISSR-PCR 反应体系的优化
2.2 单因子试验分析
由图 2 可以看出，PCR 反应体系中 5 个因素的
浓度变化对扩增效果的影响存在差异。其中 DNA 浓
度的变化对扩增效果没有显著的影响，因此在后续
正交设计时没有考虑该因素。
Mg2+ 浓度和引物浓度的变化对扩增效果影响最
为显著。当 Mg2+ 浓度为 1.0 mmol/L 时，扩增条带较
弱、部分条带缺失，浓度增加至 1.5 mmol/L 时，扩
增条带数量最多，背景也最清晰，随浓度增加条带
数目减少，背景模糊。当引物浓度为 0.1 mmol/L 时，
从清晰度、亮度和条带数量等方面衡量均为最佳扩
增效果，浓度增加至 0.2 mmol/L 后扩增条带减少，
背景变差，但随浓度的持续增加扩增效果稳定。Taq
DNA 聚合酶的用量对扩增效果影响相对较小，使用
量为 0.25 U 时，条带数目相对较少。当使用量增加
至 0.5 U 以上后扩增效果较稳定。随着 dNTP 浓度的
增加，谱带数目增多且逐渐变得更加清晰，随着浓
度的持续上升，谱带清晰度有所下降。
2.3 正交试验的直观分析
由图 3 可以看到，第 6 泳道的 PCR 扩增图谱条
带最多，且背景干净、条带清晰、扩增效果最好。
据此确定最终的反应程序为 20 μL 的反应混合液中
包括 1×PCR buffer，1 ng/μL 模板 DNA，0.1 μmol/L
引物，0.2 mmol/L dNTP 混合物，0.8 U Taq DNA 聚合
酶，1.6 mmol/L MgCl2。
2.4 引物筛选和优化反应体系应用
图 4 为引物 6 的梯度退火 PCR 电泳图，可以看
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期126
出，退火温度过低时扩增图谱模糊，退火温度达到
并超过 56.6℃后扩增效果和质量显著提高，背景清
晰，扩增条带数多。因此将该引物的适宜退火温度
确定为 56℃。采用同样的方法得到其余引物的最适
退火温度。
通过筛选最终得到 10 条 ISSR 引物，其扩增产
物条带清晰、多态性强、重复性好。表 2 为最终筛
选到的 10 条 ISSR 引物的序列及最适退火温度。引
物 826 对 19 个拟茎点霉基因组 DNA 模板的扩增结
果，见图 5，其谱带清晰、重复性好、多态性高，
表明该 ISSR-PCR 反应体系稳定可靠，对不同模板
均有较好的适用性和通用性。
度是对扩增效果影响最为显著的因素，而 DNA 浓度
的变化对扩增效果没有显著的影响，很多研究都得
出了类似的结论［15, 16］。扩增体系对引物浓度的要求
较为严格，同时 Taq DNA 聚合酶和 dNTP 的浓度对
扩增反应也存在一定的影响。
PCR 扩增中 Mg2+ 浓度不仅影响 Taq酶的活性，
还能与反应液中的 dNTPs、模板及引物结合，影
响扩增的效果。本研究中随 Mg2+ 浓度的增加，扩
增条带数量逐渐增加，背景也变清晰，浓度增加
至 1.5 mmol/L 时达到最佳扩增效果。浓度的持续增
加导致条带数目减少，背景变差。引物作为扩增体
系中的重要组成成分，它的不足会降低其与模板接
触的机会，影响有效扩增而导致扩增产物偏少，而
过多的引物可能会引发碱基错配，还会导致引物二
聚体的形成，并与靶序列竞争聚合酶和底物，从而
使扩增量降低。本试验中当引物浓度为最低设定值
0.1 μmol/L 时，扩增效果最好，条带数量较多，清
晰度良好，浓度增加后扩增条带部分缺失，背景变
模糊，但是带型和背景没有随着引物浓度的持续增
高而发生变化，稳定性较好。PCR 扩增中 Taq酶浓
度过低会使新链合成效率下降，导致扩增产物的减
少，高浓度的 Taq酶容易产生非特异性扩增产物。
Taq DNA 聚合酶使用量增加至 0.5 U 时达到最佳效
果，并随着使用量的继续增加效果保持稳定。为保
证试验结果的可靠性同时节省试验成本，正交设计
减少了 Taq DNA 聚合酶的用量范围。dNTP 浓度过
高，会导致聚合酶错误掺入，过低又会影响合成效
率，甚至会因 dNTP 过早消耗而使产物单链化，影
响扩增效率。试验结果表明，随着 dNTP 浓度的上升，
谱带数目增多且逐渐变得更加清晰，当浓度为 0.15
mol/L 时谱带最清晰，随着浓度的持续上升，背景清
晰度略有下降。
研究中各因素对 PCR 反应的影响从大到小依次
为 Mg2+、引物、dNTP、Taq酶和模板 DNA。但 PCR
扩增反应是在一个独立的体系内完成的，无论哪种
因素是主要因素，反应体系中的各因素间都会发生
相互作用，体系中任一因素的变化都可能影响扩增
结果。各个因素的最适浓度集合在一起未必是一个
最佳的反应体系。因此，本研究通过前期的单因子
试验确定对反应中较敏感的因素，并适当缩小浓度
表 2 ISSR引物和最适退火温度
引物 序列（5-3） 退火温度（℃）
2 GTCGTCGTCGTCGTCGTC 60
4 CACGAGAGAGAGAGAGA 52
6 GTGCGTGCGTGCGTGC 56
12 AGAGAGAGAGAGAGAGGG 56
13 GACAGACAGACAGACA 48
16 AAGAAGAAGAAGAAGAAG 48
808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 52
826 ACACACACACACACACC 52
827 ACACACACACACACACG 52
881 GGGTGGGGTGGGGTG 54
1-19. 19 个拟茎点霉菌株 ；M. Marker
图 5 引物 826对拟茎点霉 19个菌株的 ISSR-PCR
扩增结果
3 讨论
ISSR 技术是基于 PCR 的分子标记技术，为实现
ISSR 分析结果的可靠性和可重复性，必须根据具体
环境，对反应体系进行优化。本研究显示，Mg2+ 浓
2012年第3期 127吴鸣谦等 ：拟茎点霉 ISSR-PCR 反应体系的优化
范围进行进一步的正交设计，建立了重复性好、稳
定性高的拟茎点霉 ISSR-PCR 反应体系。
在 ISSR-PCR 反应程序中，不同引物的退火温
度是影响扩增反应效果和稳定性的重要因素之一，
温度过低将导致一定程度的错配，降低扩增反应的
严谨性 ；而温度过高虽可以提高引物与模板结合的
专一性，却会降低引物与模板的结合程度。引物序
列和物种的不同都会对退火温度产生影响［17］，因
此每一个引物的最佳退火温度都需要通过试验确立
而不能仅靠理论推算。优化后建立的反应体系虽然
具有较好的稳定性，操作中仍然应该对反应条件进
行精确控制，确保使用同一公司同一批次的试剂，
如有可能同一个引物对所有个体的扩增应在同一台
PCR 仪的一个批次内完成。每个扩增反应都应该重
复操作两次，只有重复性较好的条带才可以被记录
并进行分析，以最大限度的保障扩增的严谨性和可
重复性。
4 结论
本研究在对拟茎点霉 ISSR-PCR 反应体系的优
化中得出，Mg2+ 和引物浓度的变化对扩增结果影响
最为显著，Taq DNA 聚合酶和 dNTP 的用量对扩增
效果影响相对较小。通过优化后的反应体系对 19 个
拟茎点霉菌株的基因组 DNA 进行 PCR 扩增，结果
显示，扩增产物背景清晰，条带丰富、多态性强、
重复性好，对不同模板均有较好的适用性和通用性，
为拟茎点霉的分类和遗传多样性等研究提供有效的
分子依据，也对其他真菌的分子研究提供参考和
借鉴。
参 考 文 献
［1］ Masahiro S, Nanako Y, Toshiyuki UTS, et al. Black root rot of cucur-
bits caused by Phomopsis sclerotioides in Japan and phylogenetic
grouping of the pathogen. Journal of General Plant Pathology, 2006,
72: 220-227.
［2］ Wang B, Priest MJ, Davidson A, et al. Fungal endophytes of native
Gossypium species in Australia. Mycological Research, 2007, 111
（3）: 347-354.
［3］ Djaouida R, Giovanni DS, Carmen R, et al. Polymorphisms in
nuclear rDNA and mtDNA reveal the polyphyletic nature of isolates
of Phomopsis pathogenic to sunflower and a tight monophyletic clade
of defined geographic origin. Mycological Research, 2004, 108（4）:
393-402.
［4］ Huang ZJ, Cai XL, Shao CL, et al. Chemistry and weak antimicrobial
activities of phomopsins produced by mangrove endophytic fungus
Phomopsis sp. ZSU-H76. Phytochemistry, 2008, 69: 1604-1608.
［5］ Zietkiewicz E, Rafalske A, Labuda D. Genome fingerprinting by
simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reac-
tion amplification. Genome, 1994, 20: 178-183.
［6］ Nghia NA, Kadir J, Sunderasan E, et al. Morphological and inter
simple sequence repeat（ISSR）markers analyses of Corynespora
cassiicola isolates from rubber plantations in Malaysia. Mycopa-
thologia, 2008, 166: 189-201.
［7］ Stenglein SA, Balatti PA. Genetic diversity of Phaeoisariopsis griseo-
la in Argentina as revealed by pathogenic and molecular markers. Ph-
ysiological and Molecular Plant Pathology, 2006, 68（4-6）: 158-
167.
［8］ 李蕊倩 , 何瑞 , 张跃兵 , 等 . 镰刀菌 ISSR 标记体系的建立及遗
传多样性分析 . 中国农业科学 , 2009, 42（9）: 3139-3146.
［9］ 孙立夫 , 张艳华 , 裴克全 , 等 . 法国蜜环菌 ISSR-PCR 反应体系
的优化 . 菌物系统 , 2009, 28（2）: 261-267.
［10］ 盖钧镒 . 试验统计方法［M］. 北京 : 中国农业出版社 , 2000,
286-287.
［11］ Sutton BC. The coelomycetes. Kew: CMI, 1980 ：569-573.
［12］ Uecker FA. A World List of Phomopsis Names with notes on
nomenclature, morphology and biology. Mycologia memoir, 1988,
13: 1-231.
［13］ 姜子德 . 广东拟茎点霉属形态学分类及RAPD分析 ［D］. 广州：
华南农业大学 , 1999: 1-119.
［14］ 戚佩坤 , 姜子德 , 向梅梅 . 中国真菌志（第 34 卷）（拟茎点霉
分册）［M］. 北京 : 科学出版社 , 2007: 1-185.
［15］ 雷雪峰 , 易津 , 侯丽丽 . 利用正交设计建立与优化北美驼绒藜
ISSR-PCR 反应体系 . 植物研究 , 2008, 28（6）: 693-697.
［16］ 冯富娟 , 王凤友 , 刘彤 . 红松 ISSRPCR 实验系统影响因素 . 植
物学通报 , 2004, 21（3）: 326-331.
［17］ 李开拓, 赵依杰, 钟凤林, 等 . 黄皮ISSR-PCR反应体系的优化.
中国农学通报 , 2009, 25（19）: 37-41.
（责任编辑 李楠）