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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):165-170
植物内生菌是指那些在生活史的一定阶段或全
部阶段生活于植物组织内，不引起宿主植物明显感
染症状的微生物［1］。主要包括细菌、真菌和放线菌。
几乎所有植物中都存在内生菌，它们主要存活于植
物细胞内或细胞间隙的特殊环境中，种类丰富。由
于植物内生菌与植物之间长期的共生关系，使得这
类微生物的功能和活性有别于其他环境中的微生物。
除了具有对植物的促生长［2］和赋予植物抗逆性［3］
的作用之外，一些植物中的内生菌还可以产生同植
物宿主相同或者相似的活性物质，是潜在的微生物
药物开发资源。随着抗生素和防腐剂的大量使用，
耐药性菌株大量产生，开发新的抑菌活性物质迫在
收稿日期 ：2014-12-22
基金项目 ：重庆工贸职业技术学院院级项目（ZR201310）
作者简介 ：李玲玲，女，硕士，研究方向 ：微生物制药 ；E-mail ：729005755@qq.com
柴胡内生真菌鉴定与抑菌活性筛选
李玲玲  罗合春  张先淑
（重庆工贸职业技术学院生物化学工程系，重庆 408000）
摘 要 ： 从野生柴胡中分离内生真菌，旨在寻找具广谱抗菌活性的内生真菌。对采自四川省甘孜藏族自治州的一株健康野
生柴胡中的内生真菌进行分离，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠埃希菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus）为指示菌，对分离到的内生真菌分别利用琼脂块法和双层平板法法进行抑菌活性的初筛和复筛。从其根、茎、叶中共分离
出 27 株内生真菌，经分类鉴定，隶属于 9 个属，其中青霉属（Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）为优势属。26 株内生真菌对两
种或 3 种指示菌均具有一定的抑菌活性，占分离菌株总数的 96.30%，其中 5 株（CHG-01、CHG-04、GHJ-10、CHY-01 和 CHY-03）
对 3 种指示菌均有较强抑菌活性。柴胡内生真菌的次级代谢产物中存在着天然抑菌活性物质，可为寻找新型抗菌物质提供资源。
关键词 ： 内生真菌 ；抑菌活性 ；柴胡
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.026
Identification of Endophytic Fungi in Bupleurum and Screening of
Antimicrobial Activities
Li Lingling Luo Hechun Zhang Xianshu
（Biochemistry Engineering Department，Chongqing Industry & Trade Polytechnic，Chongqing 408000）
Abstract:  In order to determine the main distribution of endophytes and their broad-spectrum antimicrobial activity, 27 strains of
endophytic fungi were isolated from the stems, roots and leaves of wild bupleurum at the Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture of Sichuan
Province. Identification of these strains was determined by their morphological features. They were classified as 9 fungal genera in which
Aspergillus and Penicillium were the dominant. The antimicrobial activities from endophytic fungi were investigated by using the agar diffusion
method and the cylinder plate method, and Bacillus subtilis, Escherichia coli and Staphylococcus aureus as indicator microorganisms. The results
showed that 26 strains, accounting for 96.30% of all the isolates, had antimicrobial activities to 2 indicators or 3. Endophytic fungi of CHG-01,
CHG-04, CHJ-10, CHY-01, and CHY-03 had remarkable antimicrobial activities to 3 indicators respectively. There is natural antimicrobial
substance in the secondary metabolites of endophytic fungi from the wild bupleurum, which provides a new source for searching novel
antimicrobial products.
Key words:  endophytic fungi ；antimicrobial activity ；bupleurum
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10166
眉睫。
柴胡味苦、性微寒。归肝、胆经。有疏散退热，
舒肝，升阳之功能。用于感冒发热，寒热往来，疟疾，
胸胁胀痛，月经不调，子宫脱垂，脱肛等症。近代
研究多用于治疗流感病毒、结核杆菌、疟原虫所引
起的疾病。近年来，国内学者对柴胡种植、快繁、
保健作用及活性成分方面进行了广泛研究，如沈亮
亮等［4］在对柴胡抗菌成分进行研究时发现柴胡皂苷
Bp3 在体外具有广谱抗菌活性，刘泽坤等［5］发现烟
台柴胡地上部分提取出的挥发油具有广谱抗菌活性。
在柴胡内生菌研究方面，高宁等［6］进行了狭叶柴胡
内生真菌分布特征的研究，未对内生真菌进行抑菌
活性研究。孙月［7］也进行了柴胡内生真菌的分离，
分离到 3 株内生真菌，但未见有抑菌活性报道。
本研究以四川省甘孜藏族自治州的柴胡为材料，
从其各个部位大量分离内生真菌，并对其进行形态
方面的初步鉴定和抗菌活性筛选，旨在寻找具广谱
抗菌活性的内生真菌奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
药用植物标本 ：一株健康柴胡植株采自四川省
甘孜藏族自治州。采集的新鲜植物样品 4℃保存，
48 h 内处理。
供试指示菌 ：大肠埃希菌（Escherichia coli）购
自中国工业微生物菌种保藏管理中心，枯草芽孢杆
菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus）为重庆工贸职业技术学院微生物实验室保存。
培养基 ：PDA 培养基（马铃薯葡萄糖培养基）
配方 ：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 18 g，水
1 000 mL，马铃薯去皮，切成小块煮沸 30 min，用
纱布过滤得滤液，加入糖及琼脂，溶化后补足水至
1 000 mL，121℃灭菌 30 min。
1.2 方法
1.2.1 材料的表面消毒 分别将柴胡根、茎、叶流
水冲洗 5 h 后，晾干放入干净的烧杯里，用 75% 酒
精浸泡 2 min，无菌水冲洗 3 次，再用 5.4% NaClO
溶液浸泡一定时间（叶 5 min，根、茎浸泡 10 min）后，
无菌水冲洗 3 次，最后一次冲洗液留下备用。
1.2.2 内生真菌的分离和纯化 用无菌滤纸将各材
料水分吸干后，分别称取 2 g，加 10 mL 无菌水研磨
后，取上清液 0.1 mL 涂布在 PDA 平板上，倒放于
28℃培养 7 d。
待平板上菌落长出，根据菌落形态、颜色、边
缘状态、透明度、表面干湿状态等特征判断分离出
的菌落种类并计数，用平板划线及直接用接种针取
尖端菌丝等分离纯化方法，经过反复的分离、纯化，
直至得到纯化的典型菌落。
将已纯化的菌株分别转接到斜面培养基上培养，
待菌株生长旺盛时。取出置 4℃保藏。
1.2.3 消毒可靠性检验
1.2.3.1 漂洗液培养 把最后一次漂洗消毒材料的
漂洗液吸取 0.1 mL 涂布于 PDA 平板上进行培养，观
察培养结果。
1.2.3.2 组织印迹检查 用灭菌镊子夹住已消毒灭
菌过的供试植物组织小片，使其表面与相应固体培
养基接触几分钟后取出，置于相同条件下培养 1 周，
观察培养基上是否有菌落生长。良好的消毒灭菌效
果，培养基上应该均无任何微生物生长。
1.2.4 内生真菌的形态学鉴定
1.2.4.1 点植培养法（观察真菌菌落及常规镜检）
用接种针从斜面上蘸极少量孢子。点植于平板上适
当的位置，使成三角形的 3 点，倒放于 28℃恒温箱
中培养 10 d，观察菌落大小、颜色、表面纹饰、质地、
边缘形状等。
1.2.4.2 小室培养法 将菌种接种在小室边缘，28℃
恒温箱中培养，在光学显微镜下观察记录菌丝和孢
子的形态特征，依据真菌的形态分类学方法，初步
确定分离菌株的种属地位。
1.2.4.3 分 离 频 率 种 属 确 定 后， 用 分 离 频 率
（Isolation frequency，IF）比较和判断优势菌群。分
离频率 ：分离到的某一指定类型内生真菌的菌株数
量占分离的内生真菌菌株数量的百分率。
1.2.5 抑菌实验
1.2.5.1 抗菌活性菌株的初筛 待检内生真菌培养 ：
挑取经活化的内生真菌菌丝或孢子点接至 PDA 固体
平板中央，28℃恒温培养 7 d，备用。
指示菌培养 ：将抑菌实验指示菌枯草芽孢杆菌、
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种于牛肉膏蛋白
胨斜面上，37℃培养 18 h，用无菌水分别制备成浓
2015,31(10) 167李玲玲等：柴胡内生真菌鉴定与抑菌活性筛选
度约为 105-106 CFU/mL 的菌悬液。
抑菌实验 ：采用琼脂块法［8］。取浓度为 105-106
CFU/mL 的 3 种指示菌菌悬液 0.1 mL，分别接种于牛
肉膏蛋白胨平板上，涂布均匀。用打孔器从 PDA 平
板上生长的待检内生真菌菌落上截取直径为 6.0 mm
的琼脂块，用无菌镊子将琼脂块菌面朝上直接放置
于含有不同指示菌的平板上，每株内生真菌作 3 个
重复，35℃培养 18 h，观察抑菌圈。
1.2.5.2 抗菌活性菌株的复筛 指示菌培养 ：将抑
菌实验指示菌枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡
萄球菌分别接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，37℃培养
18 h，4℃保存备用。
待检内生真菌液体培养及发酵液处理 ：液体培
养采用马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）。在 250 mL
三角瓶中装入 100 mL 培养基，灭菌冷却后，将初筛
抑菌效果较好的菌种接入三角瓶中，28℃，130 r/min，
培养 3 d。无菌条件下取发酵液 5 mL 于离心管中，
8 000 r/min 离心 5 min，收集上清作抑菌实验，不接
种的液体培养基作同样处理，作为阴性对照。
抑菌复筛 ：采用双层平板法［9］。倒底层培养基，
约 15 mL，待凝 ；制备菌层培养基 ：10 mL 无菌冷却
生理盐水加入 3 种指示菌斜面上，将菌苔洗下，打
散，制备成菌悬液，在经灭菌冷却至 60℃左右的牛
肉膏蛋白胨琼脂培养基中分别加入适量的 3 种指示
菌菌悬液，使其浓度约为 106 CFU/mL，倒平板。在
双层平板上放置牛津杯，使其自然下沉 10 min ；将
离心后的待检内生菌上清液加入牛津杯中，每只牛
津杯加入 100 μL，每种待检上清液 3 个重复。以阴
性发酵液作对照。放入 4℃冰箱预培养 7 h，后转入
30℃培养箱培养 16 h，观察并测量抑菌圈的直径。
2 结果
2.1 柴胡内生真菌的组成
从柴胡根、茎、叶中共分离到内生真菌 27 株，
其中 6 株来自于根部，18 株来自于茎，3 株来自于叶。
经菌落形态以及小室镜检，参照《真菌鉴定手册》，
经初步鉴定分别属于 9 个属，说明内生真菌在柴胡
中普遍存在（表 1 和图 1）。其中青霉属（Penicillium）
和曲霉属（Aspergillus）较普遍，分别占分离菌株
总数的 37.04% 和 22.22%，为优势种群 ；芽枝孢属
（Cladosporium）其次，所占比例为 11.11% ；枝顶孢
属（Acremonium）和地霉属（Geotrichum）所占比例
均为 7.41% ；其他属只有 1 株，为稀有属，见表 2。
表 1 柴胡内生真菌在根茎叶中的分布情况
器官 属 数目 合计 器官 属 数目 合计
根 青霉属（Penicillium） 2 6 茎 曲霉属（Aspergillus） 8 18
枝顶孢属（Acremonium 1 青霉属（Penicillium） 4
镰刀菌属（Fusariun） 1 地霉属（Geotrichum） 2
芽枝孢属（Cladosporium） 1 枝顶孢属（Acremonium） 1
丝核菌属（Rhizoctonia） 1 头孢霉属（Cephalosporium） 1
叶 曲霉属（Aspergillus） 2 3 芽枝孢属（Cladosporium） 1
芽枝孢属（Cladosporium） 1 交链孢属（Alternaria） 1
表 2 27 株内生真菌类群表
属 菌株数量 分离频率 /% 属 菌株数量 分离频率 /%
曲霉属（Aspergillus） 10 37.04 镰刀菌属（Fusariun） 1 3.70
青霉属（Penicillium） 6 22.22 丝核菌属（Rhizoctonia） 1 3.70
芽枝孢属（Cladosporium） 3 11.11 头孢霉属（Cephalosporium） 1 3.70
枝顶孢属（Acremonium） 2 7.41 交链孢属（Alternaria） 1 3.70
地霉属（Geotrichum） 2 7.41
2.2 抗菌活性内生真菌筛选
2.2.1 抗菌活性内生真菌初筛 用琼脂块法对分离
到的 27 株内生真菌进行抗菌活性初选，结果（表 3）
表明，26 株内生真菌对两种或 3 种指示菌均具有抑
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10168
菌活性，占分离菌株总数的 96.30%，说明柴胡内生
真菌中存在着天然抑菌资源。
2.2.2 抗菌活性内生真菌复筛 选择初筛时对 3 种
指示菌抑菌效果均较好的 5 株内生真菌 ：CHG-01、
CHG-04、CHJ-10、CHY-01 和 CHY-03，采用管碟法
对其进行复筛，结果（表 4）显示，5 种内生真菌发
酵上清液对 3 种指示菌均有一定的抑菌活性，其中
对 3 种指示菌抑菌效果都最好的为 CHY-01（图 2），
其次为 CHG-01。
表 4 内生真菌发酵上清液的抑菌活性（抑菌圈直径 /cm）
内生真菌
指示菌
大肠杆菌
（Escherichia coli）
金黄色葡萄球菌
（Staphylococcus aureus）
枯草芽孢杆菌
（Bacillus subtilis）
CHG-01 1.2 1.1 1.2
CHG-04 0.8 1.0 1.1
CHJ-10 1.0 1.1 0.8
CHY-01 1.4 1.4 1.4
CHY-03 0.8 1.0 0.8
3 讨论
目前测定内生菌抑菌活性时采用的方法有琼
A1 A2 A3
B1 B2 B3
C1 C2 C3
D1 D2 D3
E1 E2 E3
F1 F2 F3
A-F ：曲 霉 属、 青 霉 属、 地 霉 属、 镰 刀 菌 属、 丝 核 菌 属、 头 孢 霉 属 ；
1-3 ：每属真菌的菌落背面形态、正面形态和孢子或分生孢子头形态
图 1 部分内生真菌菌落及孢子或孢子头形态
表 3 柴胡内生真菌初筛结果
内生真菌
指示菌
大肠杆菌
（Escherichia coli）
金黄色葡萄球菌
（Staphylococcus aureus）
枯草芽孢杆菌
（Bacillus subtilis）
CHG-01 ++ ++ ++
CHG-02 ++ ++ +
CHG-03 + ++ -
CHG-04 ++ ++ ++
CHG-05 ++ - +
CHG-06 + ++ -
CHJ-01 + + +
CHJ-02 ++ - +
CHJ-03 ++ ++ +
CHJ-04 +++ + +
CHJ-05 - ++ ++
CHJ-06 + ++ +
CHJ-07 + + -
CHJ-08 + + +
CHJ-09 + + +
CHJ-10 +++ +++ ++
CHJ-11 ++ + +
CHJ-12 + + ++
CHJ-13 ++ ++ ++
CHJ-14 ++ ++ +
CHJ-15 + - -
CHJ-16 ++ ++ -
CHJ-17 + + ++
CHJ-18 - + +
CHY-01 +++ +++ +++
CHY-02 ++ ++ ++
CHY-03 +++ +++ ++
注 ：+ ：抑菌圈直径 d ≤ 1 cm ；++ ：1 cm < d < 1.5 cm ；+++ ：d ＞ 1.5 cm ；
- ：无抑菌性
2015,31(10) 169李玲玲等：柴胡内生真菌鉴定与抑菌活性筛选
脂块法、滤纸片法［10］、平板孔阱扩散法［11］、双层
平板法等，研究过程中复筛采用了双层平板法，该
方法影响因素较多，实验结果重现性较差，在实验
过程中，为了使复筛能够出现清晰的抑菌圈，对影
响柴胡内生真菌抑菌活性物质效价测定的主要因素
（加液量、琼脂浓度和培养方式）进行了分析。关于
加液量的多少，在研究过程中发现，若将牛津杯加
满，18 h 后杯内有近一半的残留溶液，因此在实验
过程中，将牛津杯加液量调整为 100 μL 保证能够渗
透完全。琼脂浓度也会影响抑菌活性物质的扩散，
Sebt［12］在模拟 nisin 于琼脂糖凝胶中扩散时发现，
琼脂糖浓度增加可使凝胶孔径狭小致密，影响 nisin
在琼脂糖中的扩散 ；而琼脂糖浓度过低时，培养基
不易凝固，且牛津杯易陷于培养基内，增加 nisin 扩
散的困难［13］。因此在实验的过程中，将培养基中添
加不同琼脂浓度 1.1%、1.3%、1.5% 和 1.8%，考察
抑菌活性物质的渗透情况，结果发现 ：琼脂浓度越
小，渗透量越多，越易出现清晰地抑菌圈，因此在
管碟法复筛时采用了 1.1% 琼脂浓度。张国只等［14］
发现低温预培养非常有利于提高琼脂扩散法的测定
效果。在本研究中，4℃预培养 8 h 后再进行培养比
直接进行培养更能增加抑菌圈的清晰度。
药用植物内生菌的分布既受寄主植物影响，又
受环境影响。同一种植物在不同的地理区域具有不
同的内生菌类群分布，同一种植物在同一地区的内
生菌类群基本相似，但是不同年龄植株和组织上的
内生菌丰度和分布明显不同。从环境角度（海拔、
土壤、温度、湿度、pH 等）来讲，内生真菌类群
的分布也受宿丰植物树冠的高度和郁闭度影响［15］。
与高宁等［6］的狭叶柴胡内生真菌分离结果（13 株，
无优势属，根茎叶无相同属的内生真菌）不同，本
研究分离到的内生真菌中，有优势属（青霉属和曲
霉属），并且叶和根、叶和茎中均分离到了一株相同
形态的真菌。
影响内生真菌分离结果的因素比较多。首先在
体外培养内生菌的过程中，很难将药用植物体内的
微生物全部分离出来。这主要是因为就目前的技术
而言，人工培养环境不可能完全模拟植物体内环境。
例如，内生真菌在体外大多数采用 PDA 培养基进行
分离，这与植物体内复杂的环境完全不同，而且不
同的植物体内环境也不同。事实上，同样的植物样
品在不同的培养基能分离得到的微生物种类和数量
差别较大［16］。即使用不同的培养基来分离植物组织
的内生菌，也不能保证所有生活在植物体内的内生
菌全部被分离出来，因为有的内生菌不能在人工培
养基上培养［17］。另外，研究方法对内生真菌多样性
结果也有一定的影响，刘淮等［18］考察了不同研究
方法对真菌多样性结果的影响，认为在内生真菌研
究中，采用单一的研究方法可能会导致植物组织内
生真菌多样性被低估，将组织块分离培养方法和分
子生物学方法结合起来将会更全面地反映植物内生
真菌的多样性。
4 结论
从柴胡植株体内分离到了 27 株内生真菌，青
霉属和曲霉属是优势种群。26 株内生真菌对两种
或 3 种指示菌均具有抑菌活性，占分离菌株总数的
96.30%，其中两株抑菌效果良好，具有潜在的开发
价值。
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图 2 CHY-01 对 3 种指示菌的抑菌效果
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（责任编辑 马鑫）