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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):169-173
磷是植物生长发育的必需元素之一，但土壤中
95% 以上的磷与 Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+ 等金属离子
结合而丧失植物有效性，植物难以吸收利用。如何
提高土壤磷素利用率，分离筛选出高效且具有溶磷
作用的微生物菌株并制成土壤磷素活化剂，已成为
国内外研究热点。土壤中存在大量的微生物，能够
将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，
具有这种能力的微生物称为溶磷菌［1］，包括细菌、
真菌和放线菌，广泛分布在根际、土壤和作物种子
表面［2］。溶磷菌除了溶解土壤中难溶性或不溶性的
磷素外，还可以吸附根系周围锌、铜、钙等微量元素，
改善植物营养，同时分泌生长调节物质，促进根系
生长等作用。因此应用溶磷菌能够有效地提高农作
物产量，对实现农业生态系统的可持续发展具有重
要的理论和实践意义［3］。
油茶属山茶科常绿灌木或小乔木，是我国南方
收稿日期 ： 2014-09-04
基金项目 ：海南省自然科学基金项目（314147）
作者简介 ：刘小玉，女，研究实习员，硕士研究生，研究方向 ：土壤微生物与油茶丰产栽培技术 ；E-mail ：liuxiaoyu06120210@163.com
油茶根际溶磷菌的分离、鉴定及溶磷能力研究
刘小玉  付登强  陈良秋  杨伟波  李东霞  符海泉 
（中国热带农业科学院椰子研究所 油茶研究中心，文昌 571339）
摘 要 ： 采用传统的微生物分离培养法，对油茶根际溶磷细菌进行了分离，共筛选得到 17 株溶磷细菌。利用透明圈法对油
茶根际土壤中具有溶磷能力的细菌进行初筛；采用钼锑抗比色法测定发酵液的可溶性磷含量，对解磷菌株进行复筛，得出菌株 6-Y-09
溶磷活性最强。根据进行菌落形态特征、生理生化特征、16S rDNA 序列和系统发育分析等研究，初步鉴定菌株 6-Y-09 为洋葱伯克
霍尔德菌。该菌株在后续微生物菌肥研制中具有较大潜力，为通过生物途径改善油茶磷素供应，促进油茶生长提供了优良的菌株
资源。
关键词 ： 油茶根际 ；溶磷菌 ；分离和鉴定 ； 洋葱伯克霍尔德菌
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.025
Isolation，Identification and Phosphate-solubilizing Capacity of
Phosphate-solubilizing Bacteria from the Rhizosphere of Camellia
Liu Xiaoyu Fu Dengqiang Chen Liangqiu Yang Weibo Li Dongxia Fu Haiquan
（Coconut Research Institute，Oil Camellia Research Center，CATAS，Wenchang 571339）
Abstract: Phosphate-solubilizing bacteria were isolated from the rhizosphere of camellia, and 17 strains were screened using
traditional method of isolation and culture of microorganisms. By utilizing the method of transparent zone, phosphate-solubilizing bacteria were
preliminarily screened from the rhizosphere soil. Subsequently, the bacteria were re-screened by using method of molybdenum-antimony anti-
spectrophotometric to measure content of soluble phosphorus in fermentation liquor, and strain 6-Y-09 with the highest capacity of solubilizing
phosphate was gained. According to morphology of the colony, physiological and biochemical properties, 16S rDNA sequence and phylogenetic
analysis, strain 6-Y-09 was identified as Burkholderia capacia. The strain has great potential in further development of microbiological fertilizer
because of its stronger phosphate-solubilizing capability, which will provide an outstanding strain resource for improving phosphorus supply of
camellia and promoting its growth.
Key words: camellia rhizosphere ；phosphate-solubilizing bacteria ；isolation and identification ；Burkholderia capacia
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7170
特有的木本油料作物。在耕地资源有限的情况下，
努力发展油茶产业对提升我国食用油自给率，保障
国家食用油安全和提高山区农民收入具有重要意义。
海南油茶林土壤全磷含量范围为 100-120 mg/Kg，油
茶在此范围内均可正常生长［4，5］，低磷条件下未表
现出明显的缺磷症状，近年来的研究结果表明油茶
根际土壤中存在溶磷菌［6，7］，油茶根际溶磷菌的高
效溶磷作用可能是油茶适应低磷胁迫的重要机理之
一。本实验通过对油茶根际溶磷菌的溶磷能力进行
研究，以期筛选出优良溶磷菌株，为油茶产量的提
高和微生物肥料研制提供理论依据，也为解决热带
缺磷问题提供一条绿色途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集 供试土壤采自五指山市油茶林地，
采集健康的油茶植株根际土壤，将各样品做好标记，
带回实验室置于 4℃的冰箱内保存备有。
1.1.2 培 养 基 有 机 磷 培 养 基 ：葡 萄 糖 10 g，
（NH4）2SO4 0.5 g，MgS04·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，
KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，
卵磷脂 0.2 g，CaCO3 5.0 g，酵母膏 0.4 g，琼脂 20g，
蒸馏水 1000 mL，pH7.0-7.5。
LB 培养基 ：蛋白胨 10 g，酵母膏 5 g，NaCl 10
g，琼脂 18 g，蒸馏水 1 000 mL，pH7.0。牛肉膏蛋
白胨液体培养基 ：牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 5.0 g，氯化
钠 10.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH7.2-7.4。
1.2 方法
1.2.1 溶磷细菌的分离纯化 称取 10 g 根际土壤置
于盛有 90 ml 无菌水的三角瓶中，振荡 30 min（160
r/min），制成悬浮液。取其上清液用无菌水 10 倍逐
级稀释，依次稀释成 10-2、10-3、10-4 浓度，各吸取
0.1 mL 涂布于有机磷培养基平板，于 28℃恒温培养
箱中倒置培养。待菌落长出后，挑取具有溶磷菌特
征的单菌落划线纯化，并将纯化的菌株接种到斜面
LB 培养基上，置于 4℃的冰箱中保存待用。
1.2.2 溶磷细菌的溶磷能力
1.2.2.1 定性测定 采用溶磷圈法［8］，将培养基制
成平板、分区，每区点植 1 个菌株，28℃培养 7 d，
观察有无溶磷圈生成，测定溶磷圈直径（D），菌落
直径（d）。根据能否产生溶磷圈判断菌株有无溶磷
能力 ；根据 D/d 值大小初步确定菌株的溶磷能力，
同时观察并记录菌落的性状、大小、边缘结构、高度、
透明度、颜色、生长状况等。
1.2.2.2 定量测定 采用钼锑抗比色法，于 150 mL
三角瓶中盛入有机磷液体培养基 50 mL 高压灭菌 20
min（121℃、101 kPa）备有。挑选各初筛菌株，接
种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中 30℃振荡培养至发
酵液变浑浊后离心，用无菌水重悬，即制备成菌悬液。
分别将 1 mL 菌悬浮液接种于有机磷液体培养基中，
以不接菌为对照，每个处理 3 次重复，30℃震荡培
养 7 d（160 r/min）；培养完毕，发酵液于 4℃条件下
12 000 r/min 离心 15 min，取上清液 1 mL，采用钼
锑抗比色法测定有效磷增量（mg/L）［9］，计算公式
如下 ：
P=K×V/V1
其中 ：P 为有效磷增量 ；K 为从标准曲线查得
显色液的磷含量（mg/L）；V 为显色时溶液定容的体
积（mL）；V1 为显色时吸取上清液的体积（mL）
［10］。
1.2.3 溶磷菌株培养液 pH 值变化测定 用酸度计
测定培养 7 d 后的各菌株培养液 pH 变化情况。
1.2.4 溶磷菌株 6-Y-09 的鉴定
1.2.4.1 菌株 6-Y-09 形态特征和主要生理生化特
征 参照《常见细菌系统鉴定手册》［11］对菌株 6-Y-
09 的菌落形态特征及主要生理生化特征进行试验和
观察记录。
1.2.4.2 菌株 6-Y-09 的 16S rDNA 序列分析 采用细
菌基因组 DNA 提取试剂盒提取溶磷菌的 DNA。PCR
扩增选用通用引物 27 F 5-AGAGTTTGATCCTGGCT-
CAG-3，1492 R 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。反
应体系 50 μL（1 μL 模板、1 μL 1492 R、1 μL 27 F、
25 μL PCR mastermix、22 μL ddH2O）。PCR 扩增（94℃
预变性 5 min，94℃ 变性 1 min，55℃ 退火 1 min，
72℃ 延伸 1.5 min，进行 35 个循环，72℃ 终延伸 10
min，4℃保存），取 50 μL PCR 产物用 1％的琼脂糖
凝胶进行电泳检测，在紫外灯下观察、并拍照保存。
将 PCR 产物送至北京六合华大基因科技股份有限公
司进行测序。
经测序获得溶磷菌株 6-Y-09 的 16S rDNA 序列，
将该序列通过 Blast 程序与 GenBank 中核酸数据进
2015,31(7) 171刘小玉等 ：油茶根际溶磷菌的分离、鉴定及溶磷能力研究
行比对分析（http ：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），
采用 BioEdit、Mega5.0 等软件对菌株进行系统发育
分析，采用邻接法（Neighbour-joining，NJ 法）构建
系统发育树。
1.2.5 数据处理 数据采用 Excel 和 SAS 软件进行
方差分析。
2 结果
2.1 溶磷细菌的分离纯化
从油茶根际土壤样品中共分离筛选获得 17 株能
产生明显溶磷圈的细菌，对所分离纯化得到的 17 株
细菌的形态进行观察，并用溶磷圈法对各菌株的 D/d
值进行测定，结果如表 1 所示。其中菌株 6-Y-09 在
表 1 溶磷菌培养 7 d 的菌落特征
菌株 形状 表面 高度 透明度 颜色 边缘 生长快慢 生长状况 D/d
5-Y-01 圆 光滑黏 扁平 不透明 乳白 整齐 快 +++ 2.14efg
5-Y-02 圆 光滑黏 扁平 不透明 黄 整齐 快 +++ 1.62fgh
5-Y-03 圆 光滑黏 扁平 不透明 黄 整齐 中等 ++ 1.41gh
5-Y-04 圆 光滑黏 扁平 不透明 黄 整齐 快 +++ 3.06cd
5-Y-05 圆 光滑黏 扁平 不透明 乳白 整齐 快 +++ 0.85h
5-Y-06 圆 光滑黏 扁平 透明 乳白 不规则 快 +++ 2.48de
5-Y-07 圆 光滑黏 扁平 不透明 淡黄 整齐 快 +++ 2.07efg
6-Y-01 圆 光滑黏 扁平 不透明 淡黄 整齐 快 +++ 4.82a
6-Y-02 不规则 较干黏 扁平 不透明 淡黄 不规则 慢 + 3.09cd
6-Y-03 不规则 较干黏 扁平 不透明 淡黄 不规则 快 +++ 2.41def
6-Y-04 圆 光滑黏 扁平 不透明 淡黄 整齐 快 +++ 4.82a
6-Y-05 圆 光滑黏 扁平 不透明 淡黄 整齐 快 +++ 4.28ab
6-Y-06 圆 光滑黏 扁平 不透明 淡黄 整齐 中等 ++ 4.81a
6-Y-07 圆 光滑黏 扁平 不透明 淡黄 整齐 快 +++ 2.57de
6-Y-08 圆 光滑黏 扁平 不透明 淡黄 整齐 快 +++ 2.98cd
6-Y-09 圆 光滑黏 扁平 不透明 淡黄 整齐 快 +++ 3.62bc
6-Y-10 圆 光滑黏 扁平 不透明 淡黄 整齐 中等 ++ 3.13cd
注 ：1）快 ：12 h 后可观察到生长，中等 ：24 h 可观察到生长，慢 ：48 h 后可观察到生长 ；2）+ ：生长较差，++ ：生长一般，+++ ：生长良好 ；同列数据后
不同小写字母表示 0.05 水平上差异显著
以卵磷脂为磷源的培养基上出现了明显且较大的透
明圈（图 1）。
图 1 菌株 6-Y-09 在有机磷培养基上的溶磷圈
2.2 溶磷细菌的溶磷能力
各菌株在有机磷液体培养基中培养 7 d 后，测
定 其 pH 和 有 效 磷 含 量， 结 果（ 表 2） 发 现，17
株溶磷菌溶解有机磷能力差异显著，有效磷含量
在 34.76-201.38 mg/L 之 间， 与 不 接 菌 对 照（23.99
mg/L）相比，有效磷增量在 10.77-177.39 mg/L 之间，
增幅在 44.8%-739.4% 之间。其中，菌株 6-Y-09 的
溶磷量为 201.38 mg/L，比 CK 增加了 8.39 倍，溶磷
效果显著高于其他菌株。
有机磷细菌液体培养基的溶磷量与 pH 之间没
有显著的相关性，主要原因是有机磷细菌主要是通
过分泌胞外植酸酶、核酸酶和磷酸酶等非有机酸类
物质将有机酸分解［12］，而这些物质对培养液的 pH
改变不大。
2.3 菌株鉴定
2.3.1 菌株 6-Y-09 的形态特征 菌株 6-Y-09 在 LB
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7172
培养基上生长较好，速度快，培养 48 h 后 . 菌落为
圆形，直径 5 mm，淡黄色，不透明，湿润，扁平，
无色素产生。
2.3.2 菌株 6-Y-09 的生理生化特征 菌株淀粉水解
试验、吲哚试验、V-P 试验、甲基红试验、H2S 试验
呈阴性 ；明胶液化试验、过氧化氯酶试验、硝酸盐
还原试验、氧化酶试验呈阳性 ；能利用葡萄糖。
2.3.3 16S rDNA 序列测定及其系统发育分析 将
菌 株 6-Y-09 的 16S rDNA 进 行 PCR 扩 增 得 到 一 条
1 500 bp 左右的条带，经序列测定，其大小为 1 333
bp。将其 DNA 序列与 NCBI 数据库中相应的 DNA
序列进行 BLAST 相似性分析，发现菌株 6-Y-09 与
Burkholderia cepacia strain GJ8 同源性最高，相似性
达 100％。根据序列同源性从高到低的原则，挑取 9
株菌株的 16S rDNA 序列，运用 BioEdit、Mega5.0 软
件构建系统发育树（图 2）。
3 讨论
本研究采用蒙金娜有机磷培养基，对五指山南
定和水满等地区油茶林地的根际土壤中溶磷菌进行
分离筛选，利用溶磷圈法，选出溶磷能力较强的菌
株 17 株，菌株溶解有机磷 D/d 值在 0.85-4.82 之间。
进一步摇瓶培养对 17 株菌进行复筛，有效溶磷量在
34.76-201.38 mg/L 之间。无论是在固体培养条件下
的 D/d 值还是在液体培养条件下的有效溶磷量，菌
株 6-Y-09 均表现出较强的溶磷能力，因此将其选择
作为进一步鉴定的菌株。结合菌株 6-Y-09 的菌落形
态特征、生理生化试验，16S rDNA 序列和系统发育
分析等研究，初步鉴定菌株 6-Y-09 为洋葱伯克霍尔
德菌（Burkholderia capacia）。洋葱伯克霍尔德菌是
1950 年 Burkholder 从腐烂洋葱表皮中分离到的一株
植物病原菌［13］，对人本身来说是一种致病性较严重
的致病菌，但是在自然界中又是一种重要的生防、
环保菌，减少了对环境的危害，相关研究结果表明
洋葱伯克霍尔德菌能够产生多种次级代谢产物，包
括硝吡咯菌素、吩嗪，Cepabactin，Cepaciamide A 等
以及其他未被鉴定的物质，并具有防治植物病害和
促进植物生长的双重功效［14-16］。另外，国外已有利
用其开发出生物农药用于防治小麦纹枯病、小麦全
蚀病、番茄南方根结线虫病［17，18］、桃褐腐病［19］等，
也有其防止植物病害作用机理的研究报道［20，21］，洋
葱伯克霍尔德菌在农业生产和环境保护中表现出广
泛的应用前景。
油茶是我国重要的木本油料作物，由于其生长
周期长，必须维持土壤肥力才能达到持续高产的目
的。微生物肥料可以改良土壤理化性质，调节植物
生长，增加作物产量，且对生态环境友好，因此推
广和应用微生物肥料是推动我国油茶产业化发展的
重要措施。菌株 6-Y-09 有望成为溶磷菌剂及复合菌
剂研制的优良菌株，本研究为该菌株今后的应用、
微生物肥料的开发奠定了基础。此外，菌株 6-Y-09
表 2 有机磷液体培养基中接种 7 d 后的溶磷情况
菌株 pH 溶磷量 /（mg·L-1） 磷增量 /（mg·L-1）
5-Y-01 7.27cd 119.91d 95.92d
5-Y-02 7.04k 34.76 l 10.77 l
5-Y-03 7.10j 118.73d 94.74d
5-Y-04 7.33ab 65.95i 41.96i
5-Y-05 7.17gh 161.06b 137.07b
5-Y-06 6.04l 51.98j 27.99j
5-Y-07 7.36a 50.49j 26.5j
6-Y-01 7.20fg 43.40k 19.41k
6-Y-02 7.03k 83.01g 59.02g
6-Y-03 7.23ef 97.04e 73.05e
6-Y-04 7.250de 121.91d 97.92d
6-Y-05 7.33ab 74.49h 50.5h
6-Y-06 7.14hi 153.68c 129.69c
6-Y-07 7.04k 89.83f 65.84f
6-Y-08 7.12ij 118.40d 94.41d
6-Y-09 7.26cde 201.38a 177.39a
6-Y-10 7.29bc 66.58i 42.59i
ck 7.02k 23.99m 0
注 ：同列数据后不同小写字母表示 0.05 水平上的差异显著性
6-Y-09
Burkholderia cepacia strain GJ8
Burkholderia sp. B48
Burkholderia sp. YXA1-6
Burkholderia sp. B32
87
55
Burkholderia sp. A34
Burkholderia sp. E56
Burkholderia sp. E23
Burkholderia sp. E55 95
84
13
54 Bacterium ST2
0.002
100
图 2 菌株 6-Y-09 的同源性分析
2015,31(7) 173刘小玉等 ：油茶根际溶磷菌的分离、鉴定及溶磷能力研究
的扩繁技术体系以及该菌株对油茶的长期接种效应
及其促生机制还有待进一步研究。
4 结论
通过分离和筛选获得 17 株有溶磷效果的菌
株，且菌株 6-Y-09 表现出较强的溶磷能力。通过
菌落形态特征、生理生化实验及系统发育分析等
研究，初步鉴定菌株 6-Y-09 为洋葱伯克霍尔德菌
（Burkholderia capacia）。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）