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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内，
并与植物建立和谐联合关系的一类微生物，它们可
以通过生物防治、植物促生和内生固氮等作用直接
或者间接影响植物的生长发育，是植物维持自身健
康生长与适应环境的重要因素之一［1］。目前认为，
植物内生细菌与植物生长发育、抗病害能力、功效
性成分产生以及生境生态平衡稳定都具有重要作用，
成为当前微生物生态学研究的一个热点领域［1］。
黄栌是优良的秋季红叶树种，也是我国长江
流域、华北、华中地区常见的荒山绿化树种，具有
生长强健及耐贫瘠等特性。黄栌（Cotinus coggygria
var. cinerea）是构成香山红叶景观的主体树种，香山
收稿日期 ：2013-09-04
基金项目 ：北京市青少年科学探索专项资金项目，中国食品发酵工业研究院科技发展基金（博士基金）项目（2012KJFZ-BS-01）
作者简介 ： 左山，女，硕士，研究方向 ：植物微生物生态学，E-mail ：zuoshanwork@163.com ；刘洋同为本文第一作者
通讯作者 ：程池，男，教授级高工，博士生导师，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：cheng100027@163.com
香山黄栌叶片内生细菌的分离与鉴定
左山1  刘洋2  周肖红3  沈悦1  李哲1  彭程1  陈亮3  程池2
（1. 北京市广渠门中学，北京 100062 ；2. 中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100027 ；
3. 北京市香山公园管理处，北京 100093）
摘 要 ： 通过微生物培养方法对北京香山黄栌叶片内生细菌进行分离及筛选，共得到 81 株内生细菌，经形态学观察、16S
rDNA 扩增及系统发育分析，将其归为变形菌门（Proteobacteria）中的欧文氏菌属（Erwinia）和志贺氏菌属（Shigella）；厚壁菌门
（Firmicutes）中的芽孢杆菌属（Bacillus）、柯恩氏菌属（Cohnella）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）；
放线菌门（Actinobacteria）中的短小杆菌属（Curtobacterium）。这是国内外首次利用培养方法针对黄栌叶片内生细菌进行研究的报道。
关键词 ： 黄栌 叶 内生细菌 培养方法
Isolation and Identification of Endophytic Bacteria in Leaf from
Xiangshan Smoke Tree（Cotinus coggygria var. cinerea）
Zuo Shan1 Liu Yang2 Zhou Xiaohong3 Shen Yue1 Li Zhe1 Peng Cheng1 Chen Liang3 Cheng Chi2
（1. Beijing Guang Qumen Middle School，Beijing 100062 ；2. China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute
of Food and Fermentation Industries，Beijing 100027 ；3. Beijing Xiangshan Park Management Office，Beijing 100093）
Abstract:  The endophytic bacteria in leaf of Xiangshan smoke tree were isolated, screened and identified by the microbial culture-
dependent method combing with morphological observation, 16S rDNA amplification and phylogenetic analysis, indicated that the total 81 strains
from the leaves were clustered into 7 genus ：Erwinia and Shigella, Bacillus, Cohnella, Paenibacillus and Staphylococcus, and Curtobacterium
belonging to Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria, respectively. This is the first report about investigation on the endophytic bacteria in
leaf of Xiangshan smoke tree using culture-dependent method.
Key words:  Smoke tree Leaf Endophytic bacteria Culture-dependent method
公园面积约 160 hm2，黄栌数量约 10 万余株，主要
分布于香山马蹄形山坳的西南部［2］。近年来，香山
红叶的培育和病害防治引起广泛关注。本项目首次
以香山黄栌叶片为研究对象，采用微生物培养方法
和分子生物学技术对其内生细菌群落结构多样性进
行分析，为进一步研究这些内生细菌菌种的生物学
功能，以及香山红叶植物的生长健康与病害防治奠
定微生物资源基础。
1 材料与方法
1.1 材料
黄栌叶片于 2013 年 7 月采集自北京市香山公园，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期152
2000
bp M
1000
M ：D2000 marker
图 2 部分黄栌内生细菌的 16S rDNA 片段扩增结果
具体位置为东经 116.19°，北纬 39.99°，海拔 181 m。
采集所得样品于 4℃保存。
1.2 方法
1.2.1 培养基及试剂 LB 及 R2A 成品培养基，购自
北京陆桥公司 ；细菌基因组 DNA 提取试剂盒及 PCR
相关试剂购自 TIANGEN 公司 ；PCR 引物由北京诺
赛生物公司合成。
1.2.2 样品表面灭菌 称取 1 g 叶片样品，并用无
菌水冲洗，之后依次用 70% 乙醇，次氯酸钠溶液
（2.5% 有效 Cl-），70% 乙醇浸泡 3 min，5 min，30 s，
再用无菌水淋洗 6 次，并于无菌条件下晾干 ；同时
取最后一次淋洗水 120 μL 涂于 LB 固体培养基平板
上，28℃培养 72 h，以检测表面灭菌效果［3］。
1.2.3 内生细菌的分离与纯化 采用刘琳等［4］方法
进行。将表面灭菌处理的黄栌叶片置于无菌研钵中
研磨成粉末，然后依次用无菌水稀释成浓度为 10-1、
10-2 和 10-3 悬液。分别取 200 μL 涂布于 R2A 和 LB
平板上，每个处理 3 个平行。28℃培养 2-3 d。根据
菌落形态（大小、形状、颜色、表面光泽度、边缘
整齐度、透明度等），随机挑取平板上具有差异的代
表性菌落，纯化后将其接种于斜面培养基，并 4℃
保存备用。
1.2.4 内生细菌的 16S rDNA 序列分析 采用细菌基
因组 DNA 提取试剂盒（TIANGEN）提取菌株基因
组 DNA 作为 PCR 反应的模板。采用细菌通用引物
27F（5-AGAGTTTCATCTGGCTCAG-3） 和 1 492R
（5-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3）［5］ 对 菌 株 16S
rDNA 片段进行 PCR 扩增。PCR 反应体系（50 μL）：
10×buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4 μL、引物 27F
（10 mmol/L）1 μL、引物 1 492R（10 mmol/L）1 μL、
Taq 酶（5 U/L）0.25 μL、DNA 模板 3 μL、ddH2O 补
足至 50 μL。PCR 反应程序 ：94℃ 5 min ；94℃ 1 min，
55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 个 循 环 ；72 ℃ 10min。
1% 琼脂糖检测凝胶电泳检测 PCR 扩增产物。
1.2.5 核 糖 体 DNA 扩 增 片 段 限 制 性 内 切 酶 分 型
（Amplifed ribosomal DNA restriction analysis，ARD-
RA） 用 Hae III（TaKaRa）和 Hin 6I（TaKaRa）两
种内切酶对 PCR 产物进行酶切分型，两种酶带型完
全一致则认为是同一种或同一类型的细菌［4］。酶切
反应体系为 0.4 μL 内切酶 Hae III（或 Hin 6I），1.5
μL 酶切缓冲液，400 ng PCR 产物，最后加灭菌水至
15 μL。37℃ 酶切 4 h，1.0% 的琼脂糖凝胶电泳分离
酶切片段，100 V 电泳 60 min。比较各菌株的酶切图
谱并归类。
1.2.6 细菌 16S rDNA 序列测定与同源性比对 经
ARDRA 初步分型，选取代表菌株进行 16S rDNA 全
长片段进行扩增（引物及方法同上）。PCR 扩增产
物 约 1.5 kb， 采 用 ABI 3730 型 DNA 测 序 仪 测 序，
将序列信息提交至 NCBI，并将测序得到的结果在
EzTaxon server 2.1 进行比对［6］，确定与已知序列的
同源关系。
2 结果
2.1 黄栌叶片内生细菌分离及基因组DNA提取
通过传统微生物分离培养，共获得黄栌叶片内
生细菌 81 株。利用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提
取黄栌叶片内生细菌基因组 DNA，1% 凝胶电泳结
果（图 1）显示总 DNA 大小约为 23 kb。
23.1 kb
M
M ：λDNA/Hind III marker
图 1 部分黄栌叶片内生细菌的基因组 DNA
2.2 黄栌叶片内生细菌16S rDNA PCR扩增及ARD-
RA 分型
采用细菌通用引物 27F 和 1492R 对黄栌叶片内
生细菌 16S rDNA 进行 PCR 扩增，得到长度约 1 500
bp 的扩增片段，图 2 为部分细菌的 16S rDNA PCR 产
物电泳图谱。将扩增的 PCR 产物用 Hae III 和 Hin 6I
两种内切酶进行酶切分型（ARDRA 分型），将两个
酶切图谱类型完全相同的细菌划分为一个操作分类
2014年第1期 153左山等 ：香山黄栌叶片内生细菌的分离与鉴定
单 元（Operational taxonomy unit，OTU）（ 图 3）。 每
种 OTU 选定 1-2 个代表菌株再次进行 16S rDNA PCR
扩增以备用测序。
M
M ：D2000 marker
图 3 部分黄栌内生细菌的 ARDRA 酶切分型结果
表 1 黄栌叶片内生细菌多样性统计
类群 代表菌株 菌株数 最近缘菌种（登录号） 序列相似性（%） GenBank 登录号
Proteobacteria R-57 1 Erwinia persicina ATCC 35998T（U80205） 98.20 KF475713
L-13 2 Shigella flexneri ATCC 29903T（X96963） 99.64 KF475703
R-3 1 Bacillus altitudinis 41KF2bT（AJ831842） 99.78 KF475706
R-54 40 Bacillus anthracis ATCC 14578T（AB190217） 99.85 KF475711
L-21 1 Bacillus aryabhattai B8W22T（EF114313） 97.13 KF475705
R-15 1 Bacillus thuringiensis ATCC 10792T（ACNF01000156） 99.79 KF475707
Firmicutes R-61 4 Cohnella ginsengisoli GR21-5T（EF368010） 98.80 KF475712
R-22 3 Paenibacillus xylanilyticus XIL14T（AY427832） 99.10 KF475708
L-20 21 Staphylococcus epidermidis ATCC 14990T（L37605） 100 KF475704
R-36 4 Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus GTC 1228T（AB233326） 99.86 KF475710
Actinobacteria R-30 3 Curtobacterium flaccumfaciens LMG 3645T（AJ312209） 99.21 KF475709
片内生细菌群落中的第一优势种群 ；L-20 所代表的
OTU 为该黄栌叶片内生细菌群落中的第二优势种群
（表 1）。
3 讨论
植物内生细菌［7-11］存在于植物的根、茎、叶、
花果实及种子中［12，13］，其中不乏一些能够对植物
生长和健康起到直接或者间接促进作用的细菌种
类，已有很多关于这些有益内生细菌生态功能的报
道，其中对植物的直接促生作用主要包括生物固
氮［14， 15］、分泌和诱导产生植物生长调节物质［16， 17］、
改善植物对矿物质的利用率［18］及改变宿主植物对
霜冻等有害环境条件的敏感性等［19，20］。对植物具
有间接促生作用有益内生细菌的生态功能主要是植
物内生细菌的生防作用，到目前为止已从众多植物
体中分离得到了具有良好抑制效果的植物内生细
菌［12，15，21，22］。
本研究自北京香山红叶景观的主体树种—黄栌
叶片中分离培养得到 7 个内生细菌菌属，其中以芽
孢杆菌属（Bacillus）最为优势，该属中许多细菌种
类是常见的植物促生细菌［23］。本研究分离得到的菌
株 L-21 所对应的最近缘菌种 Bacillus aryabhattai 是拮
抗烟草黑胫病（Phytophthora parasitica var. nicotianae）
的生防菌［24］；R-15 所对应的最近缘菌种苏云金芽
孢杆菌（Bacillus thuringiensis）是目前世界上产量
最大、使用最广的生物杀虫剂，对鳞翅目、鞘翅
2.3 黄栌叶片内生细菌多样性及系统发育分析
黄栌叶片内生细菌的 16S rDNA 序列比对及其群
落多样性分析结果如表 1 所示。经 16S rDNA 序列比
对及其系统发育分析（图 4），内生细菌群落共包含
11 个 OTU，分属变形菌门（Proteobacteria）中的欧
文氏菌属（Erwinia）和志贺氏菌属（Shigella）；厚
壁菌门（Firmicutes）中的芽孢杆菌属（Bacillus）、柯
恩氏菌属（Cohnella）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）
和葡萄球菌属（Staphylococcus）；放线菌门（Actino-
bacteria）中的短小杆菌属（Curtobacterium）。在所分
离的得到的 81 株内生细菌中，厚壁菌门（Firmicutes）
为优势菌门 ；芽孢杆菌属（Bacillus）及葡萄球菌属
（Staphylococcus）为优势菌属，丰度分别为 53.09%
和 30.86%。其中，R-54 所代表的 OTU 为该黄栌叶
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期154
目、双翅目、膜翅目和同翅目等昆虫，以及动植物
线虫、蜱螨等节肢动物都有特异性的毒杀活性，而
对非目标生物具有较高的安全性，因此在国内外植
物保护相关领域的科研与实践中备受人们关注［25］。
此外，菌株 R-22 所对应的最近缘菌种解木聚糖类
芽 孢 杆 菌（Paenibacillus xylanilyticus） 对 由 大 丽 轮
枝菌（Verticillium dahliae）所引起的棉花黄萎病具
有明显的拮抗作用，可用于棉花黄萎病的生物防
治［26］。类芽孢杆菌属中不乏具有生防促生作用的细
菌种类，宋未等（2007）自水稻根际分离得到多黏
类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）WY110，该菌
对水稻的三种主要病原菌——稻瘟病、水稻纹枯病
及水稻白叶枯病均具有很高的体外特异性拮抗活性，
且拮抗谱较宽，并兼具固氮活性及生产生长素作用，
在温室实验中表现较好的植株防病效果，普遍达到
50% 以上，具有良好的研究与应用价值［27］。宋顺
华等［28］经研究发现多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus
polymyxa）WY110 对西瓜枯萎病亦有良好的防治作
用。本课题组新近自诺尼（Morinda citrifolia L.）植
物中分离获得类芽孢杆菌 CICC 10580，其对小麦根
腐病、稻瘟病菌及棉花黄萎病等多种病原真菌具有
明显的拮抗作用（数据尚未发表）。
由此可见，香山黄栌叶片内生细菌群落中存在
有益细菌资源。因此，利用多种培养条件进一步分
离筛选其内生细菌，以获得种类更为丰富的内生菌
资源，为进一步研究其中的有益功能菌种与黄栌植
物的生长健康及其景观效果之间的相关性奠定了微
生物资源基础。
4 结论
国内外首次利用微生物培养方法分离筛选黄栌
叶片的内生细菌，分属变形菌门中的欧文氏菌属和
志贺氏菌属，厚壁菌门中的芽孢杆菌属、柯恩氏菌属、
类芽孢杆菌属和葡萄球菌属，放线菌门中的短小杆
菌属，其中包含植物生防促生细菌种类。
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100
100
100
100
100
100
100
100
100
100100
100
100
100
73
100
72
83
0.02
Bacillus thuringiensis ATCC 10792T (ACNF01000156)
R-54
R-15
Bacillus anthracis ATCC 14578T (AB190217)
L-21
Bacillus aryabhattai B8W22T (EF114313)
R-3
Bacillus altitudinis 41KF2bT (AJ831842)
L-20
Staphylococcus epidermidis ATCC 14990T (L37605)
R-36
Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus GTC 1228T (AB233326)
R-22
Paenibacillus xylanilyticus XIL14T (AY427832)
R-61
Cohnella ginsengisoli GR21-5T (EF368010)
R-30
Curtobacterium flaccumfaciens LMG 3645T (AJ312209)
L-13
Shigella flexneri ATCC 29903T (X96963)
R-57
Erwinia persicina ATCC 35998T (U80205)
图 4 邻接法（N-J）构建黄栌叶片内生细菌 16S rDNA 序列系统发育树
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（责任编辑 狄艳红）