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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):199-204
收稿日期 ：2015-02-04
基金项目 ：国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2014AA021702），江苏省 2014 年度普通高校研究生科研创新计划项目（KYLX_1148），
中央高校基本科研基金［（JUSRP51402A），111 计划（111-2-06）］
作者简介 ：袁军，男，硕士，研究方向 ：轻工业技术与工程 ；E-mail ：wujiyuanjun@163.com
通讯作者 ：杨海麟，男，博士，研究方向 ：发酵工程 ；E-mail ：19891996@sina.com
常压室温等离子体（ARTP）诱变快速选育高产 DHA
的裂殖壶菌突变株
袁军  赵犇  孙梦玉  王武  杨海麟
（江南大学 教育部工业微生物技术重点实验室，无锡 214122）
摘 要 ： 旨在建立一种能够快速便捷的诱变选育高产 DHA 菌株的方法。出发菌株 Schizochytrium sp. ATCC 20888 悬浮液经过
常压室温等离子体（ARTP）处理后，涂布到 2，2’- 联吡啶平上板培养。将所得的突变菌株摇瓶发酵培养，通过磷酸香草醛油脂快
速检测法和气相色谱分析从突变菌株中筛选得到 DHA 高产菌株。结果表明，裂殖壶菌诱变选育条件为 ARTP 为处理时间 15 s，气
量 10 L/min，电功率 100 W ；2，2’- 联吡啶浓度为 100 μmol/L。通过该方法可以获得高产 DHA 的菌株。其中 D32 菌株 DHA 生产能
力提升显著，比初始菌株提升了29.8%，DHA产量达到7.31g/L。D32菌株与出发菌株相比，主要的饱和脂肪酸含量显著下降（P<0.005），
而不饱和脂肪酸含量显著增加（P<0.005）。经 5 次传代后性状稳定，本方法快捷高效，同时也为其他多不饱和脂肪的诱变选育方
法提供参考。
关键词 ： DHA ；裂殖壶菌 ；诱变育种 ；常压室温等离子体
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.030
Rapid Mutation Breeding Schizochytrium Strains Producing High-yield
Docosahexenoic Acid by Atmospheric and Room Temperature Plasmas
（ARTP）
Yuan Jun Zhao Ben Sun Mengyu Wang Wu Yang Hailin
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract:  This work aims to establish an expeditious method of mutation breeding strain producing high-yield docosahexaenoic acid
（DHA）. The original strain Schizochytrium sp. ATCC 20888 was treated by Atmospheric and Room Temperature Plasmas（ARTP）, and
screened with 100% lethal concentration of 2，2’-Dipyridyl. The mutants were cultured by rotation-flask fermentation, and the strains with high-
yield DHA from mutants were screened and selected by phosphoric acid-vanillin reaction and gas chromatography. The results showed that the
conditions of mutation breeding Schizochytrium were ARTP for 15 s at the gas flow rate of 10.0 L/min and radio-frequency output of 100 W,
and the concentration of 2，2’-Dipyridyl was 100 μmol/L, so the strain with high-yield was obtained. The DHA-yield of mutant D32 increased
significantly up to 7.31g/L, 29.8% higher than those by the original strain. Compared with the original strain, the main saturated fatty acid（C14∶
0 and C16∶0）by D32 decreased significantly（P < 0.005）, while the unsaturated fatty acid content increased significantly（P < 0.005）.
The results of subculture test showed that the mutant strain had stable hereditary character after 5 generations. Therefore, this method is not only
prompt and efficient, but also provides a reference for the mutation breeding strains of producing other polyunsaturated acids.
Key words:  DHA ；Schizochytrium ；mutation breeding ；atmospheric and room temperature plasmas
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10200
二十二碳六烯酸（DHA，C22∶6）是一种 n-3
多不饱和脂肪酸。不仅对视力和神经的发育具有促
进作用，而且在降低心血管疾病、高血压、关节炎
和动脉硬化的发生等方面具有重要作用［1-4］。我国
卫生部于 2010 年 3 月批准 ARA-SCO 和 DHA-SCO
为新资源食品，并允许其在符合相关要求的条件下
添加到婴幼儿配方食品中［5］。由此可见，DHA 供应
蕴藏着巨大的商机。裂殖壶菌 Schizochytrium 是一类
低等的海洋真菌，具有培养简单、生长速度快，脂
肪酸组成简单易纯化等特点，是发酵生产 DHA 的理
想菌种［6］。
在生产过程中，只有 DHA 含量和菌体浓度都
高时，才能得到较高的 DHA 生产效率。然而，在
同一环境中高菌体浓度与高 DHA 含量不能同时实
现［7］。因此，筛选一株在在同一环境中高菌体浓
度与高 DHA 含量能够同时满足的菌株，可以提高
DHA 生产效率的同时又可以简化生产工艺。目前，
紫外诱变方法仍然是菌体诱变的主要处理方式，然
而 ARTP 等高新诱变技术凭借简单易用、安全高效
的优点得到了广泛应用［8］。对于 DHA 等多不饱和
脂肪酸高产菌株诱变筛选，研究主要集中在促进油
脂代谢前提物质（乙酰 -CoA 和 NADPH）的合成和
抑制油脂的竞争性途径［9］。而在裂殖壶菌中，DHA
与 DPA 的合成途径并不一致［10］，这导致筛选得到
的突变株油脂含量得到增加，而 DHA 在油脂中的含
量提高并不理想。本研究采用 ARTP 技术对裂殖壶
菌诱变处理，使筛选得到的菌株在菌体与油脂保持
高产同时 DHA 在油脂中的含量也得到提高，从而得
到性能优异的 DHA 高产菌株。
不 饱 和 脂 肪 酸 在 逆 境 胁 迫 中 具 有 重 要 作
用。Watanabe 等［11］ 通 过 将 热 带 橡 胶 树（Hevea
brasiliensis）的 Δ12 脱饱和酶基因在 Saccharomyces
cerevisiae 菌株中表达时发现这些多不饱和脂肪酸能
够增加转基因菌株对氧化胁迫的抗性。Allakhvediev
等［12］ 将 Synechocystis 的 Δ12 脱 饱 和 酶 基 因
desA 转 入 只 能 合 成 单 不 饱 和 脂 肪 酸 的 野 生 菌 株
Synechococcus sp. PCC7942，转化菌株将总脂肪酸的
一半转化成为双不饱和脂肪酸，这种转化能提高氧
参与的装置对盐胁迫的抗性。Hidetosh 等［13］研究认
为 DHA 和 EPA 作为一种生物机体内抗氧化剂，能
够避免 ROS 引起的过氧化作用。因此通过诱变筛
选出抗 ROS 较强的菌株可能具有较高的 DHA 生产
能力。
有鉴于此，本研究通过含有 100% 致死率浓度
的 ROS 诱导剂 2，2’- 联吡啶的平板培养 ARTP 处理
的菌体，旨在通过外加氧化胁迫淘汰抗氧化能力较
低的菌株以期筛选得到抗氧化性较高的菌株，并利
用磷酸香草醛油脂检测方法和气相色谱分析，以期
得到高 DHA 生产能力的菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 本 实 验 采 用 裂 殖 壶 菌 菌 株
Schizochytrium sp.ATCC 20888。
1.1.2 培养基 发酵培养基 ：葡萄糖 120 g/L，胰蛋
白胨 6 g/L，谷氨酸钠 15 g/L，海水晶 17.5 g/L，硫酸
镁 7.5 g/L，硫酸钠 12.8 g/L，磷酸二氢钾 2.5 g/L，氯
化钾 2.6 g/L，氯化钙 0.4 g/L。
ATCC By+790 固体培养基 ：葡萄糖 5 g/L，酵母
膏 1 g/L，胰蛋白胨 1 g/L，海水晶 17.5 g/L，琼脂 20 g/L，
pH 7.0。
1.2 方法
1.2.1 裂殖壶菌高产 DHA 突变菌株的制备
1.2.1.1 制备菌悬液 将裂殖壶菌接种于装有 50 mL
基本培养基的三角瓶中中，28℃，200 r/min 条件下
培养 2 d。取 1 mL 培养液离心，用生理盐水将菌体
悬浮 OD540 值为 0.6-0.7。
1.2.1.2 ARTP 处理预实验 取 10 μL 的单细胞菌悬
液，均匀涂布在金属载片的上表面，干燥后用镊子
将菌物载片转移至载物台。采用高纯氦气作为等离
子体的工作气体，设置电源功率 80 W，照射距离 2
mm，等离子体的温度 <35℃，气流量 10 L/min，处
理菌物载片，照射时间为 0（对照）、5、10、15、
20、25、30、35 s。处理后将载片转移到 EP 管中，
震荡洗脱形成新的菌悬液，涂布平板后置于 30℃培
养箱内培养。培养 3 d 后对平板菌落进行计数，计
算致死率 ：
致死率 % ＝（未经诱变处理菌落数 - 经诱变处
理菌落数）/ 未经诱变菌落数 ×100%，每个处理组
3 个平行样。
2015,31(10) 201袁军等：常压室温等离子体（ARTP）诱变快速选育高产 DHA的裂殖壶菌突变株
1.2.1.3 2，2’- 联吡啶平板筛选预实验 将 100 μL 菌
悬液涂布在含有 2，2’- 联吡啶的固体培养基平皿上，
固体培养基中 2，2’- 联吡啶浓度分别为 0（对照）、
10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 和 110
μmol/L，于 30℃条件下培养 4 d，统计菌落数，并计
算致死率 ：
致死率 % ＝（无联吡啶平板上的菌落数 - 添加
联吡啶平板上的菌落数）/ 无联吡啶平板上的菌落
数 ×100%，每个处理组 3 个平行样。
1.2.1.4 ARTP 诱变及突变菌株的筛选 筛选分离采
用致死率在 80% 的照射时间和 100% 2，2’- 联吡啶
致死浓度，进行诱变处理和筛选。具体处理方式为：
将 10 μL 菌悬液涂布在金属载体上，置于 ARTP 诱
变系统托盘上，电源功率 100 W，气流量 10 L/min，
处理时间 15 s。样品处理完毕后，用无菌镊子将载
片放至装有 1 mL 生理盐水的 EP 管中。在振荡器上
震荡 1 min，把附着在菌物载片上的微生物洗脱到液
体中，形成新的菌悬液。对新的菌悬液进行适当稀释，
取 100 μL 稀释液涂布到含有 100 μmol/L 2，2’- 联吡
啶浓度的平板培养，取样过程中请注意震荡菌液以
保持均匀。将在平板上生长快速的突变菌株划到到
斜面上保存。
将上述诱变所得突变菌株接种到装有 100 mL 培
养基的摇瓶中培养。培养条件 28℃，200 r/min，培
养 5 d。检测其生物量、油脂和 DHA 产量。
1.2.1.5 突变菌株的遗传稳定性 突变菌株的遗传
稳定性通过连续 5 次斜面传代和三角烧瓶培养来评
价。将突变菌株接种到含有 ATCC 790 By+ 培养基的
斜面上，每 4 d 传代一次。与此同时，将菌株接种
到装有发酵培养基的三角摇瓶中，28℃，200 r/min
培养 5 d。检测每一传代培养的 DHA 生产能力。
1.2.2 分析方法
1.2.2.1 生物量的测定 将培养 5 d 的 50 mL 培养物
8 000 r/min 离心 15 min，用双蒸馏水冲洗后再次离心，
冷冻干燥后称其干重。生物量＝干重（g）/ 0.05（L）。
1.2.2.2 油脂的测定 油脂的检测采用磷酸香草醛
快速检测油脂的方法［14］。
1.2.2.3 脂肪酸甲酯的气相色谱分析 总脂的提取
采用正己烷方法［15］，将总脂转移到玻璃瓶中，加入
0.5 mol/L 的 NaOH 甲醇溶液 2 mL，充 N2 后密封于
65℃ 反应 1 h。冷却后加入 25% 三氟化硼甲醇溶液
2 mL，65℃酯化 20 min，脂肪酸甲酯用正己烷抽提
后用气相色谱仪（岛津 Shimadzu 2010）进行气相色
谱分析。氮气为载气，起始柱温为 130℃，2 min 后
以 10℃/min 的速度升至 180℃，以 4℃/min 的速度
升至 240℃保持 10 min。进样口温度为 250℃，检测
器温度为 250℃。采用不分流进样，进样量为 1 μL。
通过与标准品的保留时间对照，对各脂肪酸定性 ；
用 C19∶0 作内标，通过比对出峰面积对各脂肪酸进
行定量。脂肪酸标准品购自 Sigma 公司。
2 结果
2.1 ARTP处理时间的确定
ARTP 照射时间不同，菌体的突变率也不同。
采用不同的 ARTP 照射时间，并对菌体致死率进行
分析。结果见图 1。当 ARTP 照射时间与致死率之
间存在明显的剂量效应关系。在 0-15 s 内，随着照
射处理时间的延长，菌体的死亡率快速上升。15 s
以后随照射时间延长，致死率缓慢上升。当照射处
理时间为 30 s 时，死亡率达到 100%。当照射处理
时间为 15 s 时，致死率为 80%。因此，选择 ARTP
照射时间为 15 s 进行诱变。为了能够同时得到较高
的正突变率和较大的突变幅度。最终选择 15 s 为诱
变的辐照时间，即致死率为 80% 左右的诱变剂量。
2.2 最佳2 2 -联吡啶诱变浓度的确定
实 验 以 2，2’- 联 吡 啶 浓 度（μmol/L） 为 变 量，
测定致死率，结果见图 2，致死率和 2，2’- 联吡啶浓
度之间有明显的剂量效应关系。菌体的死亡率随着
2，2’- 联吡啶浓度的提高而不断升高，两者有明显
的线性关系 ；在 2，2’- 联吡啶浓度达到 100 μmol 时，
菌体的致死率达到 100%。为了筛选出的菌株具有比
原始菌株更强的抗 ROS 能力，本研究选用 2，2’- 联
吡啶的浓度为 100 μmol/L，即致死率刚刚达到 100%
的 2，2’- 联吡啶浓度作为诱变选育的 2，2’- 联吡啶
筛选浓度。
2.3 诱变选育
对 ARTP 诱变筛选出的裂殖壶菌菌株继续进行
多轮 ARTP 诱变，在自主建立的高通量初筛的基础
上，进一步筛选出高产 DHA 裂殖壶菌优良菌株，并
对获得产量较高的菌株进行发酵，检测其对应的生
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10202
物量、油脂量、DHA 含量，部分结果如表 1 所示，
DHA 产量 D32 最高为 7.31 g/L，较对照提高 29.8%。
表 1 不同裂殖壶菌突变菌株的发酵性能分析
菌株编号
生物量 /
（g·L-1）
DHA 含 /%
油脂含
量 /%
DHA 产量 /
（g·L-1）
ATCC20888 41.5 36.4 42.5 5.63
A17 42.7 37.5 42.8 6.01
B1 40.5 36.6 44.8 5.88
B21 37.7 36.9 41.8 5.20
C12 37.3 39.4 39.5 5.15
D32 40.5 50.0 41.1 7.31
2.4 脂肪酸组成分析
ARTP 诱变所得菌株 D32 与原始菌株 Schizochy-
trium ATCC 20888 在油脂脂肪酸组成方面具有明显
的差异性。如表 2 所示，裂殖壶菌油脂中饱和脂
肪酸含量明显降低（P<0.005），而不饱和脂肪酸含
量 明 显 增 加（P<0.005）， 如 C14∶0 和 C16∶0 含
量分别由 ATCC 20888 中的 13.72% 和 24.12% 降到
了 D32 的 1.77% 和 13.50%，EPA 和 DHA 含量则由
ATCC 20888 中的 1.18% 和 36.38% 提高到了 D32 的
5.84% 和 50.03%。
2.5 遗传稳定性分析
对菌株 D32 连续传代培养，以 4℃冰箱保存 5 d
生长良好的第一代菌株为对照，结果其第 1、2、3、
4 和 5 代的 DHA 含量 47%-51.3% 与产量 7.25-7.58
g/L，并没有发生明显变化，表明菌株 D32 传 4 代
对发酵水平无明显影响，说明菌株 D32 遗传稳定性
较好。
3 讨论
常压室温等离子体（ARTP）诱变系统具有温度
低、活性粒子浓度高、设备简单、操作简易、运行
成本低廉、且对环境无污染和危害等特点，使其在
微生物突变育种及生物医学领域中已经引起人们广
泛关注［16］。ARTP 富含的活性能量粒子对菌株 / 植
株 / 细胞等的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞
启动 SOS 修复机制。SOS 修复过程为一种高容错率
修复，在修复过程中会产生种类丰富的错配位点，
并最终稳定遗传进而形成突变株［17］。因此 ARTP 可
以作为一种快速简便的方法应用到裂殖壶菌育种。
研究表明微生物体中 DHA 含量高的菌株具有
较高的抗氧化胁迫能力［13］。高产 DHA 菌株具有较
高的抗氧化能力，能够清除菌体生长过程中产生的
ROS，为 DHA 合成提供了有利条件 ；而 DHA 在细
胞中形成稳定的结构，进一步提高了细胞对 ROS 等
不良生长因素的抗性。一种 ROS 的预处理使机体不
仅耐受了这种特定的 ROS，还能全面的耐受其他多
种 ROS，于是全面提高各种抗氧化酶活性［18］。2，
2’- 联吡啶可在氧化还原反应中作为电子受体，在细
胞内经呼吸链电子传递可产生氧自由基。而氧自由
基的存在正好诱导了 Mn-SOD 的大量生成，从而使
ROS 毒性具有抵御功能［19］。但 SOD 对活性氧的清
除能力是有限的，超过这个限度就会对机体产生伤
害。通过筛选耐高浓度的 2，2’- 联吡啶的裂殖壶菌
菌株，可能合成较高的 DHA 生产性能。本实验采用
ARTP 诱变和 2，2’- 联吡啶的定向选育方式，确定最
100
80
60
40㠤↫⦷%
20
0
0 5 10 15ᰦ䰤s 25 3020
图 1 ARTP 照射时间裂殖壶菌的致死效应
100
80
60
40㠤↫⦷%
20
0
0 20 40 60㚄ੑ஦μmol·L-1 10080
图 2 2，2’- 联吡啶浓度对裂殖壶菌的致死效应
2015,31(10) 203袁军等：常压室温等离子体（ARTP）诱变快速选育高产 DHA的裂殖壶菌突变株
佳条件 ：电功率 100 W，气量 10 L/min，照射时间
15 s，2，2’- 联吡啶浓度为 100 μmol/L。建立起一套
完整选育裂殖壶菌优良品种的方法，并根据菌株生
物量和 DHA 产量为指标进行复筛，筛选得到 DHA
产量都比初始菌株提高的菌株，其中 D32 DHA 产量
为 7.31 g/L，较对照提高 29.8%。
D32 菌株与出发菌株相比，主要的饱和脂肪
酸 C14∶0 和 C16∶0 含量明显下降，而不饱和脂肪
酸含量增加，说明突变菌株中 PKS 代谢途径得到
增强［10］。
4 结论
以 Schizochytrium sp. ATCC 20888 为 出 发 菌 株，
经 ARTP 处理后，涂布到 2，2’- 联吡啶平上板培养，
将所得的突变菌株摇瓶发酵培养，通过磷酸香草醛
油脂快速检测法和气相色谱分析从突变菌株中筛选
得到 DHA 高产菌株。实验证明本方法得到的高产
DHA 突变菌株与出发菌株相比，主要的饱和脂肪酸
C14∶0 和 C16∶0 含量明显下降，而不饱和脂肪酸
含量增加。
参 考 文 献
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表 2 裂殖壶菌 Schizochytrium ATCC20888 与突变株油脂中主要脂肪酸组成对比
脂肪酸
总脂肪酸组成比例 /%
C14∶0 C15∶0 C16∶0 C18∶0 C18∶1 EPA DPA DHA SFA UFA
ATCC
20888
13.72 0.55 24.12 0.64 2.58 1.18 12.2 36.38 39.03 60.97
D32 1.77 0.79 13.5 0.81 2.53 5.84 12.19 50.03 16.9 83.1
注 ：SFA ：饱和脂肪酸 ；UFA ：不饱和脂肪酸
表 3 菌株 D32 传代次数对 DHA 合成的影响
传代
数
生物量 /
（g·L-1）
DHA 含量 /% 油脂含量 /%
DHA 产量 /
（g·L-1）
1 40.5 50.03 41.1 7.31
2 41.7 51.3 39.5 7.41
3 43.1 47 42.0 7.58
4 40.9 48.6 42.5 7.43
5 44.0 48.2 41.5 7.25
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10204
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（责任编辑 李楠）