全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
木霉属（Trichoderma）真菌属于半知菌亚门
（Deuteromycotina）、丝孢纲（Hyphomycetes）、丝孢
目（Hyphomycetales）的黏孢菌类（Gloiosporae），其
有性阶段为子囊菌亚门（Ascomycotina）、肉座目
（Hypocreales）、肉座科（Hypocreaceae）的肉座菌属
（Hypocrea）［1］。它是一类普遍存在且易于分离培养
的丝状真菌，常见于土壤，是土壤微生物的重要组
成群落之一，从植物根围、叶围、种子及球茎表面，
收稿日期 : 2012-02-08
作者简介 : 丁德娟 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 木霉菌分子生物学 ; E-mail: xingfuxiaoyatou@163.com
通讯作者 : 唐顺明 , 男 , 博士 , 研究方向 : 绢丝昆虫分子生物学 ; E-mail: tangsm1971@just.edu.cn
木霉菌属 ITS PCR-RFLP及抗病多样性差异分析
丁德娟1， 2 李世贵2， 3 唐顺明1 顾金刚2， 3
（1 江苏科技大学生物与化学工程学院，镇江 212018 ；2 农业部微生物资源收集与保藏重点实验室，北京 100081 ；
3 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081）
摘 要： 采用 ITS PCR-RFLP方法对供试 116株木霉属菌株进行多样性分析，对其中 22株抗病优良菌株进行抗病多样性差
异分析，用 NTSYS-PC生物软件对 DNA条带进行聚类分析，结果显示，Hae III酶切共获得 11个条带，可将供试菌株分为 12种基
因型；Hinf I共获得 13个条带，可将供试菌株分为 15种基因型。由 116株木霉菌株的聚类图表明，木霉属菌株遗传相似系数变异
范围为 0.72-1.00。由 22株抗病优良菌株的聚类图表明，在遗传相似系数为 0.66处可将 22株菌分为 2类，其中 ACCC 30371由于
其酶切图谱的特异性在遗传相似系数为 0.66处同其他菌株完全分开；在遗传相似系数为 0.73处可将剩余 21株菌分为 2类，第一
类中对 9种病原菌全部表现抗性的菌株有 6株，第二类中对 9种病原菌全部表现抗性的菌株有 2株。结果证明，本研究方法基本
可将木霉属真菌归类，但所获数据在分析本属的抗病差异性这一现象上不够充分，对于其中可能存在的原因予以分析探讨。
关键词： 木霉属 ITS-RFLP 内切酶 抗病性 多样性
Analysis of ITS PCR-RFLP and Differences in Disease Resistance
Diversity of Trichoderma
Ding Dejuan1， 2 Li Shigui2， 3 Tang Shunming1 Gu Jingang2， 3
（1Jiangsu University of Science and Technology，Zhenjiang 212018；2Key Laboratory of Agricultral Microbial Resources Collection and
Preservation，Ministry of Agriculture，Beijing 100081；3Institute of Agricultural Resources and Regional Planning，CAAS，Beijing 100081）
Abstract: ITS-RFLP analysis was used to investigate the genetic diversity of 116 Trichoderma strains and the disease resistance diversity
of the 22 Trichoderma strains with strong resistance, the dendrogram was generated by Unweighed Pair Group Method with Arithmetic Mean
（UPGMA） method with NTSYS-PC biological software. There are 11 and 13 restriction fragments obtained by digestion of Hae III and Hinf I,
respectively. While there are 11 restriction fragments and 12 genotypes by the use of Hae III, 13 restriction fragments and 15 genotypes by the
use of Hinf I, the difference of the latter is higher. The similarity coefficients of 116 Trichoderma strains ranged from 0.72 to 1.00. The similarity
coefficients of 22 Trichoderma strains of fine disease resistance showed that, 22 strains were clustered into 2 groups at the similarity coefficient
of 0.66. Because of its special restriction map, ACCC 30371 can be completely separated from other 21 strains at the similarity coefficient of
0.66. The rest 21 strains were clustered into 2 groups at the similarity coefficient of 0.73. In the first group, there were 6 strains which have full
resistance of 9 pathogens, the second group have only 2 such strains. The results indicated that this method can be used to classify Trichoderma
strains, but the current result is not a sufficient evidence to explain the phenomenon of differences in diversity and disease resistance of
Trichoderma. There are some discussions about the probable reasons of this phenomenon.
Key words: Trichoderma ITS-RFLP Restriction endonuclease Disease resistance Diversity
2012年第8期 147丁德娟等 ：木霉菌属 ITS PCR-RFLP 及抗病多样性差异分析
植物残体及腐朽木材上都可以分离得到［2］。同时，
木霉能够拮抗多种植物病原菌，在生产上有巨大的
应用潜力。
长期以来，真菌的分类鉴定一直以形态学性状
为主要依据，而这些形态学性状由于难以观察、或
在人工培养条件下很难产孢而观察不到、或者本身
形态特征相近很难区分，以及易受环境条件的影响
而不稳定等原因，给真菌的分类鉴定带来了一定的
难度。20 世纪 80 年代以来，木霉分子生物学研究
取得了重大进展。现代分子生物学技术的发展及其
在真菌分类鉴定上的应用，为人们从分子水平上分
析真菌不同分类单元之间的差异和亲缘关系提供了
有力的手段。分子生物学方法能直接从 DNA 序列水
平上反映其遗传关系，较形态学和生理生化指标更
客观准确，并且操作简便，准确性可靠，特异性高。
因此，应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明真
菌种群之间和种群内的分类关系是真菌分类研究的
热点［3， 4］。
ITS 片段由于其进化速率快且片段长度适中，
成为真菌属内种间及种群分类研究的核基因标记［5］。
本试验以中国农业微生物菌种保藏管理中心（简称
ACCC）保藏的 17 种共计 116 株木霉菌株为材料，
通过 ITS PCR-RFLP 分析，将菌库中所有木霉简单归
类并寻找出已筛选出的抗病优良菌株的功能特异性
分型，旨在对供试木霉属菌株的抗病多样性差异提
供一定的分子水平依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验菌株包括 17 种共计 116 株木霉属真菌，均
为 ACCC 保藏，各个菌株信息，见表 1。实验室前
人已筛选出 22 株抗病优良菌株，它们拮抗 9 种常见
病原菌 ：棉花黄萎病菌（Verticillium dahliao）、茄子
黄萎病菌（Verticillium dahliae）、禾谷镰刀病菌（Fu-
sarium graminearum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cine-
rea）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、西瓜枯萎
病菌（Fusarium oxysporium f. sp. niveum）、黄瓜炭疽
病菌（Colletotrichum lagenarium）、人参立枯病菌（Rhi-
zoctonia solani）、棉花立枯病菌（Rhizoctonia solani-
kuhn），抗病信息，见表 2。
1.2 方法
1.2.1 菌株培养及基因组 DNA 提取 将木霉菌株接
种到装有液体PDA培养基［6］中，28℃摇床上180 r/min
培养 3 d，过滤，滤纸吸干，-20℃保存备用。采用
CTAB 法［7］提取木霉菌株总 DNA。
1.2.2 rDNA ITS 区扩增及检测 应用 White 等［8］报
道的 ITS 通用引物对 ITS1/ITS4 扩增 ITS 区段。引物
由北京宝锐通生物科技有限公司合成。反应体系总
体积为 50 μL，包括 2×PCR Master Mix 25 μL，引物
各 0.2 μL，模板 DNA 约 200 ng，灭菌双蒸水补足。
PCR 扩增程序为：95℃预变性 5 min；95℃变性 30 s，
55℃退火 45 s，72℃延伸 60 s，35 个循环 ；72℃延
伸 5 min，4℃终止。
1.2.3 ITS-PCR 产物的限制性酶切分析 rDNA ITS
区扩增后，参照文献［9-11］选用 2 种限制性内切
酶 Hae III 和 Hinf I 分别酶切，酶切体系为 20 μL，包
括 PCR 产物 4 μL，限制性内切酶 1 μL，10×Buffer
2 μL，灭菌双蒸水补足。
1.2.4 数据处理 酶切图谱以 DNA 某一片段在某样
品中出现赋值“1”和不出现赋值“0”为依据，计
算样品间的距离系数 D D=1-2（nxy）/（nx+ny）。
其中 nxy 是两样品间 PCR 扩增分子量相同的 DNA
片段总数，nx、ny 分别是样本 x 和样本 y PCR 扩增
产物的 DNA 片段总数。根据遗传距离（D），采用
UPGMA（Unweighed Pair Group Method with Arithmetic
Mean）聚类分析法，利用 NTSYS-PC 软件包自动生
成距离矩阵和 UPGMA 聚类图［11］。
2 结果
2.1 木霉基因组DNA提取
应用 CTAB 法提取的基因组 DNA 经 0.8% 琼脂
糖凝胶电泳检测部分样品如图 1 所示，基因组 DNA
效果较好，杂蛋白残留量少，质量较高，经稀释后
可用于后续试验。
2.2 rDNA ITS区段扩增
应用 ITS 通用引物对 ITS1/ITS4 对 116 株木霉菌
株的基因组 DNA 进行特异性扩增，116 个菌株均成
功扩增出 1 个条带，片段大小约为 600-680 bp。部
分菌株 ITS 区扩增产物，如图 2 所示。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期148
编号 ACCC 编号 菌株名称 种名 编号 ACCC 编号 菌株名称 种名
1 ACCC 30150 长枝木霉 Trichoderma longibrachiatum 59 ACCC 31673 哈茨木霉 T. harzianmum
2 ACCC 30152 橘绿木霉 T. citrinoviride 60 ACCC 31674 哈茨木霉 T. harzianmum
3 ACCC 30166 绿色木霉 T. viride 61 ACCC 31675 拟康宁木霉 T. koningiopsis
4 ACCC 31600 深绿木霉 T. atroviride 62 ACCC 31676 长枝木霉 T. longibrachiatum
5 ACCC 31601 橘绿木霉 T. citrinoviride 63 ACCC 31677 长枝木霉 T. longibrachiatum
6 ACCC 31602 哈茨木霉 T. harzianum 64 ACCC 31678 长枝木霉 T. longibrachiatum
7 ACCC 31603 哈茨木霉 T. harzianum 65 ACCC 31679 哈茨木霉 T. harzianmum
8 ACCC 31604 哈茨木霉 T. harzianum 66 ACCC 31680 长枝木霉 T. longibrachiatum
9 ACCC 31605 哈茨木霉 T. harzianum 67 ACCC 31681 哈茨木霉 T. harzianmum
10 ACCC 31606 哈茨木霉 T. harzianum 68 ACCC 31689 短密木霉 T. brevicompactum
11 ACCC 31607 哈茨木霉 T. harzianum 69 ACCC 31690 长枝木霉 T. longibrachiatum
12 ACCC 31608 哈茨木霉 T. harzianum 70 ACCC 31705 哈茨木霉 T. harzianmum
13 ACCC 31609 哈茨木霉 T. harzianum 71 ACCC 31707 哈茨木霉 T. harzianmum
14 ACCC 31610 哈茨木霉 T. harzianum 72 ACCC 31712 长枝木霉 T. longibrachiatum
15 ACCC 31611 哈茨木霉 T. harzianum 73 ACCC 31716 哈茨木霉 T. harzianmum
16 ACCC 31612 哈茨木霉 T. harzianum 74 ACCC 31720 交织木霉 T. intricatum
17 ACCC 31613 毛簇木霉 T. velutinum 75 ACCC 31726 卵孢木霉 T. ovalisporum
18 ACCC 31614 哈茨木霉 T. harzianum 76 ACCC 31731 绿色木霉 T. viride
19 ACCC 31615 长枝木霉 T. longibrachiatum 77 ACCC 31733 卵孢木霉 T. ovalisporum
20 ACCC 31616 长枝木霉 T. longibrachiatum 78 ACCC 31734 卵孢木霉 T. ovalisporum
21 ACCC 31617 长枝木霉 T. longibrachiatum 79 ACCC 31736 橘绿木霉 T. citrinoviride
22 ACCC 31618 长枝木霉 T. longibrachiatum 80 ACCC 31737 橘绿木霉 T. citrinoviride
23 ACCC 31619 深绿木霉 T. atroviride 81 ACCC 31738 拟康宁木霉 T. koningiopsis
24 ACCC 31620 橘绿木霉 T. citrinoviride 82 ACCC 31740 长枝木霉 T. longibrachiatum
25 ACCC 31622 短密木霉 T. brevicompactum 83 ACCC 31742 长枝木霉 T. longibrachiatum
26 ACCC 31626 哈茨木霉 T. harzianum 84 ACCC 31752 哈茨木霉 T. harzianmum
27 ACCC 31636 短密木霉 T. brevicompactum 85 ACCC 31753 卵孢木霉 T. ovalisporum
28 ACCC 31637 拟康宁木霉 T. koningiopsis 86 ACCC 31754 长枝木霉 T. longibrachiatum
29 ACCC 31639 卵孢木霉 T. ovalisporum 87 ACCC 31755 长枝木霉 T. longibrachiatum
30 ACCC 31640 卵孢木霉 T. ovalisporum 88 ACCC 31757 哈茨木霉 T. harzianmum
31 ACCC 31641 拟康宁木霉 T. koningiopsis 89 ACCC 31758 卵孢木霉 T. ovalisporum
32 ACCC 31642 卵孢木霉 T. ovalisporum 90 ACCC 31760 哈茨木霉 T. harzianmum
33 ACCC 31643 钩状木霉 T. hamatum 91 ACCC 31761 哈茨木霉 T. harzianmum
34 ACCC 31644 卵孢木霉 T. ovalisporum 92 ACCC 31767 长枝木霉 T. longibrachiatum
35 ACCC 31645 橘绿木霉 T. citrinoviride 93 ACCC 31770 长枝木霉 T. longibrachiatum
36 ACCC 31647 钩状木霉 T. hamatum 94 ACCC 31772 长枝木霉 T. longibrachiatum
37 ACCC 31648 可可木霉 T. theobromicola 95 ACCC 31773 彼得森木霉 T. petersenii
38 ACCC 31649 可可木霉 T. theobromicola 96 ACCC 31774 拟康宁木霉 T. koningiopsis
39 ACCC 31650 棘孢木霉 T. asperellum 97 ACCC 31775 橘绿木霉 T. citrinoviride
40 ACCC 31651 钩状木霉 T. hamatum 98 ACCC 31776 哈茨木霉 T. harzianmum
41 ACCC 31652 卵孢木霉 T. ovalisporum 99 ACCC 31777 哈茨木霉 T. harzianmum
42 ACCC 31653 毛簇木霉 T. velutinum 100 ACCC 31778 哈茨木霉 T. harzianmum
43 ACCC 31654 绿木霉 T. virens 101 ACCC 31779 丁莉亚木霉 T. dingleyaea
44 ACCC 31656 哈茨木霉 T. harzianmum 102 ACCC 31780 橘绿木霉 T. citrinoviride
45 ACCC 31657 长枝木霉 T. longibrachiatum 103 ACCC 31781 短密木霉 T. brevicompactum
46 ACCC 31658 长枝木霉 T. longibrachiatum 104 ACCC 31782 哈茨木霉 T. harzianmum
47 ACCC 31659 长枝木霉 T. longibrachiatum 105 ACCC 31785 卵孢木霉 T. ovalisporum
48 ACCC 31660 哈茨木霉 T. harzianmum 106 ACCC 31787 拟康宁木霉 T. koningiopsis
49 ACCC 31661 哈茨木霉 T. harzianmum 107 ACCC 31788 卵孢木霉 T. ovalisporum
50 ACCC 31662 长枝木霉 T. longibrachiatum 108 ACCC 31789 拟康宁木霉 T. koningiopsis
51 ACCC 31663 哈茨木霉 T. harzianmum 109 ACCC 31790 长枝木霉 T. longibrachiatum
52 ACCC 31664 长枝木霉 T. longibrachiatum 110 ACCC 32248 黄绿木霉 T. aureoviride
53 ACCC 31665 哈茨木霉 T. harzianmum 111 ACCC 32363 橘绿木霉 T. citrinoviride
54 ACCC 31666 长枝木霉 T. longibrachiatum 112 ACCC 32364 绿木霉 T.virens
55 ACCC 31667 哈茨木霉 T. harzianmum 113 ACCC 32491 绿木霉 T. virens
56 ACCC 31668 哈茨木霉 T. harzianmum 114 ACCC 32492 棘孢木霉 T. asperellum
57 ACCC 31670 哈茨木霉 T. harzianmum 115 ACCC 32493 绿色木霉 T. viride
58 ACCC 31672 哈茨木霉 T. harzianmum 116 ACCC 30371 哈茨木霉 T. harzianmum
表 1 供试菌株
2012年第8期 149丁德娟等 ：木霉菌属 ITS PCR-RFLP 及抗病多样性差异分析
2.3 rDNA ITS区限制性酶切图谱及聚类图分析
Hae III 和 Hinf I 内切酶对木霉属 116 个菌株的
ITS 区酶切共统计得到 24 条清晰易辨的多态性 DNA
条带，RFLP 明显。其中 Hae III 切得 11 个条带，将
供试菌株分为 12 种基因型 ；Hinf I 切得 13 个条带，
将供试菌株分为 15 种基因型 ；后者的区分度较高。
部分酶切电泳检测图谱，如图 3 所示。
从聚类图（图 4）中可看出，2 种内切酶共同作
用可将供试菌株分为 32 类，多态性较高，116 个木
霉属菌株的遗传相似系数变异范围为 0.72-1.00，遗
传相似系数变化较大，遗传背景丰富。在遗传相似
系数为 0.72 处可将除 ACCC 30371 外抗病优良菌株
归为一类。由图 4 表明，供试菌株在遗传相似系数
为 0.811 处可分为 9 个类群（A、B、C、D、E、F、G、H、
I），其中A和B为两个主要类群，所分布的菌株数目较
多，共 77 株，占供试菌株总数的 66.4%。A 类群由 T.
longibrachiatum、T. citrinoviride、T. intricatum、T. pe-
tersenii、T. velutinum、T. koningiopsis、T. brevicompa-
表 2 抗病菌株信息
ACCC 编号
棉花黄萎
病菌
（V.dahliao）
茄子黄萎
病菌
（V.dahliae）
禾谷镰刀
病菌
（F.graminearum）
番茄灰霉
病菌
（B.cinerea）
黄瓜枯萎
病菌
（F.oxysporum）
西瓜枯萎病菌
（F.oxysporium f.
sp.niveum）
黄瓜炭疽病菌
（Colletotrichum
lagenarium）
人参立枯
病菌
（R.solani）
棉花立枯
病菌
（R.solanikuhn）
ACCC30150 / √ / √ √ / / / /
ACCC30152 / √ / √ √ / / / /
ACCC30166 / √ / √ √ / / / /
ACCC30371 / / / / √ / / / /
ACCC31637 √ √ √ √ √ √ √ √ √
ACCC31639 √ √ √ √ √ √ √ √ √
ACCC31641 √ √ - √ √ √ √ √ √
ACCC31642 √ √ √ √ √ √ √ √ √
ACCC31649 √ √ √ √ √ √ √ √ √
ACCC31650 √ √ √ √ - - √ √ √
ACCC31657 √ √ - √ √ √ √ √ -
ACCC31659 √ √ - √ √ √ √ √ √
ACCC31662 √ √ √ √ √ √ √ √ √
ACCC31666 - - - - √ - - - √
ACCC31677 √ √ √ √ √ √ √ √ √
ACCC31680 √ √ - √ / √ √ √ √
ACCC31740 √ √ √ √ √ √ √ √ √
ACCC31757 √ √ √ √ √ √ √ √ √
ACCC31767 √ √ √ √ √ √ √ √ √
ACCC31770 √ √ - √ - - - - √
ACCC31774 √ √ √ √ √ √ √ √ √
ACCC32248 / √ / √ √ / / / /
注 ：√ . 有抗性，-. 无抗性，/. 未试验
M. DNA Marker V 分子质量标准 ；1-9. 部分供试菌株 rDNA ITS 区扩增产
物（分别为 1、1、2、26、90、95、105、113、115 号木霉菌）
图 2 部分供试菌株 rDNA ITS区扩增产物图 1 部分供试菌株 DNA样品电泳图
M. λDNA/Hind III 分子质量标准 ；1-3. 部分供试菌株 DNA 样
品（分别为 76、77、78 号木霉菌）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期150
ctum、T. ovalisporum、T. harzianum构成；B 类群由 T.
harzianum、T. viride、T. atroviride、T. brevicompactum、T.
ovalis-porum、T. hamatum、T. koningiopsis、T. aure-
oviride、T. virens构成；剩余 7 个类群所包含菌株数目
1. DNA Marker I 分子质量标准 ；1-24. Hae III 酶切编号为 49-72 号菌株 rDNA ITS 区的电泳结果
图 3 部分菌株分别经 Hae III （A）和 Hinf I （B）酶切图谱
A
B
较少。
2.4 木霉菌株抗病多样性差异分析
22 株抗病优良菌聚类图，如图 5 所示。从所有
菌株聚类图（图 4）上可看出，在遗传相似系数为
0.72 处可将除 ACCC 30371 外的抗病优良菌株同其
它菌株完全分离开来。已有试验结果表明，同一株
木霉可拮抗 1-9 种常见病害，不同菌株在拮抗同一
种病害中也表现出差异性 ；22 株抗病菌株对于禾谷
镰刀病菌的抗性较差，表现为抗病菌株较少，共 11
株表现抗性，6 株未做此病原菌拮抗试验 ；而对于
剩余 8 种常见病原菌的抗性相对较强。结合抗病优
良菌株的聚类图（图 5），在遗传相似系数为 0.66 处
可将 22 株菌分为 2 类，其中 ACCC 30371 由于其酶
切图谱的特异性在遗传相似系数为 0.66 处同其他菌
株完全分开 ；在遗传相似系数为 0.73 处可将剩余 21
株菌分为 2 类。
酶切图谱（图 4）显示，Hinf I 酶切 G 基因型
为抗病较好菌株所特有 ；另有抗病优良菌株 ACCC
30371 的 2 种限制性内切酶酶基因型均为特有。
3 讨论
3.1 限制性酶切图谱及聚类结果讨论
在参考前人文献［9-11］中所报道的 ITS 常用内切
酶的基础上及对本试验中所获 ITS 序列进行限制性
酶切位点分析，最终确定了 Hae III 和 Hinf I 2 种。
所得酶切图谱谱带清晰易辨，多态性较丰富，证明
所选内切酶基本符合 RFLP 分析要求。从得到的聚
类图中可看出，虽然 2 种限制性内切酶能将供试的
大部分菌株分开，但在某些类群如第 1、9、10 类
等中出现堆积情况，分析可能有 3 个原因导致这种
结果出现，第一是由于所选内切酶的数目较少，区
分度有限 ；第二可能由于供试菌株中某些物种数目
较多，如长枝木霉、哈茨木霉，而所选内切酶对于
种间的区分度有限而导致 ；第三由于供试菌株中某
些物种数目很少，如彼得森木霉只有 1 株（ACCC
31773），可可木霉只有 2 株（ACCC 31649、ACCC
31650），代表性不强、随机性较强，导致它们与其
他物种难以区分。因此本试验的后续工作可再选取
2-3 种限制性内切酶酶切，预计结果将会更加丰富。
对于木霉的分类研究，比较经典的属 Rifai［12］
的“集合种”概念，Bissett［13-16］的分类系统是在
Rifai 的基础上发展起来的，到 20 世纪 90 年代末，
Gams 和 Bissett［17］对 Bissett 分类系统进行了修订，
将木霉分为 4 组，即 Longibrachiatum组、Trichode-
rma组、Pachybasium组和 Hypocreanum组。Longibra-
2012年第8期 151丁德娟等 ：木霉菌属 ITS PCR-RFLP 及抗病多样性差异分析
chiatum组包括 T. citrinoviride、T. longibrachiatum、T.
reesei等共计 7 个种，图 4 表明 Longibrachiatum组
的试验菌株分布在 A、C、E 类群，供试菌株中 T. cit-
rinoviride和 T. longibrachiatum能明显聚在一起，这
一结果符合 Gams 和 Bissett 分类系统 ；A 类群中的
T. intricatum、T. petersenii在章初龙、徐同综述的木霉
属分类中未能找到其分类地位［18， 19］；T. koningiopsis
的分类地位见李广记等［20］ 的报道，该种属于
Trichoderma组中的 Clade Viride进化枝，在热带美洲
分布较普遍，此外在东非、欧洲和加拿大以及北美
东部也有报道［21］，但在本研究中 T. koningiopsis同
时出现在 Longibrachiatum组和 Trichoderma组，这
一结果表明对于该种的分类地位的界定有待考量。
Trichoderma组的试验菌株主要分布在 B、C 类群，
其中 T. harzianum是木霉属内最常见的一个“集合
种”［22］，章初龙、徐同［22］的研究表明，T. harzianum
及其近缘种可分为 2 个群（A、B），A 群由 T. hama-
tum、T. asperellum、T. atroviride、T. koningii、T. viride
组成，B 群由 T. spirale、T. hamatum、T. inhamatum、
T. harzianum、T. anam、Hypocrea vinosa 组成，本试
验结果基本符合该研究结果 ；本研究结果较倾向于
将 T. harzianum 集合种放在 Trichoderma组，这同章
初龙、徐同［19］对于 Trichoderma组和 Pachybasium
组的分子系统学研究结果有较大出入，分析可能由
于菌株来源、rDNA 信息量有限等因素所致［19］。部
分种如 T. virens根据 Gams 和 Bissett 对 Bissett 分类
图 4 116个木霉菌株的 ITS-PCR RFLP聚类图谱
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期152
系统应归为 Pachybasium组，但在本研究中该种同
Trichoderma组亲缘关系更近 ；再如 T. velutinum本
属 Pachybasium组，但在 Longibrachiatum组中也出
现，出现这种现象的原因可能与本试验中所选用的
限制性内切酶数量、种类有关，对于这 2 个种的区
分度不够高，需做进一步探讨。以上研究结果进
一步证明 Gams 和 Bissett 定义的 Trichoderma组和
Pachybasium组是多系的，组间区分不明显。
利用 ITS 酶切图谱进行聚类分析对于解决木霉
的亲缘关系是很有用的，但是如若分析 ITS 序列信
息，相信所获结果会更加丰富，但有时不同的种可
能有相同或相似的 ITS 序列，因此，在进一步研究
中有必要采用 mtDNA［23］、内切几丁质酶基因［24］等
来补充 rDNA 信息的不足［19］。
3.2 木霉抗病多样性差异结果讨论
在以往对于木霉抗病性的研究中，多集中于探
讨生防机制［25］、抗菌活性［26］等，对于抗病多样性
差异的研究较少。本试验通过 ITS-RFLP 分子标记手
段成功获得 Hinf I 酶切 G 基因型为抗病优良菌株所
特有，这一特殊的限制性酶切图谱或许能成为区别
于抗病优良菌株同其他菌株的标志，但由于并非所
有抗病优良菌株的限制性酶切图谱都为该类型，因
此这一特殊基因型需要经过进一步试验验证 ；另有
抗病优良菌株 ACCC 30371 的 2 种限制性内切酶酶
基因型均为特有，均不用于其余 115 株木霉菌的 2
种限制性内切酶酶基因型，酶切条带虽与其余菌株
有重复，但酶切图谱代表性强，推测此株菌特异性
较高，可有进一步研究其基因功能之用。此结果初
步表明，ITS-RFLP 分子标记手段因其操作简单、多
态性较高、所获数据易于分析，故可作为粗略寻找
抗病优良菌株特异性分型的一条途径。
在本研究中，通过对大量菌株筛选所得结果并
不十分理想，只能将部分抗同种真菌病的菌株在某
一遗传距离上归为一类，不能充分说明抗病差异性
的内在原因，分析原因可能有以下几点，第一是所
选内切酶种类及数量的限制 ；第二是 ITS 序列本身
进化相对迅速的特性［5］，它多用于真菌的分类鉴
定，而在表现抗病特性上未见报道，这是本研究的
新颖性所在，但此设想存在一定风险，所以所获试
验结果可能在说明抗病原因这一问题上证据不够充
分 ；第三是由于 ITS-RFLP 分子标记手段本身存在特
异性较低、灵敏度较差、所研究目的片段涵盖信息
量较少等缺点，因此更灵敏、精确的分子标记手段
或许可以弥补这些不足，从而找到特异性片段或功
能分型 ；第四，木霉属真菌抗病的机制复杂，目前
对抗病机制的分子水平研究主要集中在纤维素酶基
因、几丁质酶基因、Pyk 基因、组氨酸基因等功能
基因上［27］，推测 ITS 序列可能包含的抗病信息较少，
故所得试验结果可说明的抗病性差异原因相对有限，
需再做进一步试验分析验证，如克隆基因、分析序
列等。
4 结论
限制性内切酶 Hae III 和 Hinf I 对供试 17 种共
计 116 株木霉菌株具有一定的区分能力，限制性酶
切图谱清晰，聚类明显，较符合 Gams 和 Bissett 分
类系统。仅有个别种 T. intricatum、T. petersenii在章
初龙、徐同综述的木霉属分类中未能找到其分类地
位、个别种如 T. koningiopsis、T. velutinum同时出现
图 5 22个抗病优良木霉菌株的 ITS PCR-RFLP聚类图谱
2012年第8期 153丁德娟等 ：木霉菌属 ITS PCR-RFLP 及抗病多样性差异分析
2 个组以及个别种如 T. virens同 Trichoderma 组亲缘
关系更近 ；另外，本研究较倾向于将 T. harzianum
集合种放在 Trichoderma 组，这同章初龙、徐同对于
Trichoderma 组和 Pachybasium 组的分子系统学研究
结果有较大出入，有待进一步研究。研究结果表明，
PCR-RFLP 可作为粗分木霉的一种分子标记手段。
本研究得到 Hinf I 酶切 G 基因型为抗病优良菌
株所特有，这一特殊的限制性酶切图谱或许能成为
区别于抗病优良菌株同其他菌株的标志 ；研究结果
显示抗病优良菌株 ACCC 30371 的 2 种限制性内切
酶酶基因型均为特有，可做进一步研究。研究结果
表明，PCR-RFLP 可作为粗略筛选木霉菌株抗病性
的方法，但由于本试验是建立在拮抗试验基础上的
特征性图谱标记，当此方法运用于未知木霉菌株的
筛选时需做进一步菌株拮抗试验验证。
参 考 文 献
［1］ 杨合同 . 木霉分类与鉴定［M］. 北京：中国大地出版社 , 2009：1.
［2］ 杨依军 , 齐中波 . 拮抗木霉菌在生物防治中的作用 . 天津农业
科学 , 2000, 6（3）：29-33.
［3］ 陈剑山 , 郑服丛 . ITS 序列分析在真菌分类鉴定中的应用 . 安徽
农业科学 , 2007, 35（13）：3785-3786.
［4］ 董楠 , 许艳丽 . 现代分子生物学技术在木霉鉴定及多样性分析
中的应用 . 植物保护 , 2008（4）：1-5.
［5］ 刘新锐 , 谢宝贵 , 熊芳 , 等 . 高温平菇种质资源的 ITS-RFLP 分
析 . 热带作物学报 , 2010（9）：1509-1513.
［6］ 黄秀梨 . 微生物学实验指导［M］. 北京 ：高等教育出版社 ,
2005 ：114.
［7］ 易润华 , 朱西儒 , 周而勋 . 简化 CTAB 法快速微量提取丝状真
菌 DNA. 湛江海洋大学学报 , 2003, 23（6）：72-73.
［8］ White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. Amplification and direct sequen-
cing of ribosomal RNA genes for phylogenetics［M］. PCR protocols：
A guide to methods and applications. California ：Cetus Corporation,
1990 ：315-322.
［9］ 阎培生 , 罗信昌 . 木耳属真菌 rDNA 特异性扩增片段的 RFLP
研究 . 菌物系统 , 1999, 18（2）：206-213.
［10］ Sadfi-Zouaoui N, Châabani S, Rouaissi M, et al. Analysis of the
diversity of Trichoderma spp. in soil horizons using digested ITS
regions. Annals of Microbiology, 2009, 59（3）：459-463.
［11］ 祝明亮 , 张克勤 .捕食线早真菌 rDNA ITS区间RFLPs分析 .菌
物系统 , 2000, 19（2）：175-180.
［12］ Rifai M. A revision of the genus Trichoderma. Mycol Pap, 1969 ：
1-56.
［13］ Bissett J. A revision of the genus Trichoderma. I. Section Longibrac-
hiatum sect. nov. Canadian Journal of Botany, 1984, 62（5）：924-
931.
［14］ Bissett J. A revision of the genus Trichoderma. II. Infrageneric
classification. Canadian Journal of Botany, 1991, 69（11）：2357-
2372.
［15］ Bissett J. A revision of the genus Trichoderma. IV. Additional notes
on section Longibrachiatum. Canadian Journal of Botany, 1991, 69
（11）：2418-2420.
［16］ Bissett J. Trichoderma atroviride. Canadian Journal of Botany,
1992, 70（3）：639-641.
［17］ Gams W, Bissett J. Morphology and identification of Trichoderma.
Trichoderma and Gliocladium, 1998, 1 ：3-34.
［18］ 章初龙 , 徐同 . 木霉属分类研究进展 . 云南农业大学学报 ,
2000, 15（3）：269-274.
［19］ 章初龙 , 徐同 . 木霉属 Trichoderma组和 Pachybasium组的分
子系统学研究 . 菌物系统 , 2002, 21（4）：538-546.
［20］ 李广记 , 陈捷 , 刘铜 , 刘利行 . 木霉属中国新记录种 . 微生物
学通报 , 2010, 37（11）：1663-1665.
［21］ Samuels GJ, Dodd SL, Lu BS, et al. The Trichoderma koningii
aggregate species. Studies in Mycology, 2006, 56（1）：67-133.
［22］ 章初龙 , 徐同 . Trichoderma harzianum及其近缘种的分子系统
学研究 . 生物多样性 , 2003, 11（1）：10-19.
［23］ Hermosa M, Grondona I, Iturriaga EA, et al. Molecular characteriza-
tion and identification of biocontrol isolates of Trichoderma spp.
Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66（5）：1890-
1898.
［24］ Lieckfeldt E, Cavignac Y, Fekete C, Börner T. Endochitinase
gene-based phylogenetic analysis of Trichoderma. Microbiological
Research, 2000, 155（1）：7-15.
［25］ 郭润芳 , 刘晓光 , 高克祥 , 等 . 拮抗木霉菌在生物防治中的应
用与研究进展 . 中国生物防治 , 2002, 18（4）：180-184.
［26］ 曹翠玲 , 赵晋铭 , 赵晓军 , 等 . 康氏木霉代谢物对植物病原真
菌的抗菌活性测定 . 陕西农业科学 , 2006（2）：38-40.
［27］ 徐同 . 木霉分子生物学研究进展 . 真菌学报 , 1996, 15（2）：
143-148.
（责任编辑 马鑫）