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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-09-09
基金项目 : 贵州省社发攻关项目（黔科合 S 系［2007］1038）, 贵阳医学院研究生创新计划专项基金
作者简介 : 龙高群 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 医学昆虫分子生物学 ; E-mail: longgaoqun@126.com
通讯作者 : 张春林 , 男 , 硕士 , 教授 , 研究方向 : 医学昆虫分子生物学 ; E-mail: zcl@gmc.edu.cn
美洲大蠊 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达
龙高群1 王 2 张春林1
（1 贵阳医学院生物学教研室，贵阳 550004 ；2 贵阳医学院生物技术教研室，贵阳 550004）
摘 要： 旨在通过 5-RACE获得美洲大蠊 3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因的全长 cDNA序列，进行生物信息学分析，
构建原核表达载体，诱导重组蛋白表达，为进一步研究其功能奠定基础。通过 3-RACE技术，PCR扩增获取编码美洲大蠊 GAPDH
蛋白的全长 cDNA序列；采用生物信息学方法推导出该序列编码的氨基酸序列及其理化性质；预测信号肽、蛋白疏水性、可溶性、
跨膜区结构、二级结构、三级结构，并构建系统发育树；构建原核表达载体 pET28a-GAPDH，IPTG诱导重组蛋白表达，并用 His-
tag抗体Western blotting验证。结果显示，美洲大蠊 GAPDH基因，其完整阅读框含 999个碱基，编码 332个氨基酸。序列分析显示，
该蛋白与家蚕 GAPDH相似性为 89%，具有 GAPDH保守功能域，经 IPTG诱导获得重组蛋白。
关键词： 美洲大蠊 3-磷酸甘油醛脱氢酶 克隆 序列分析 原核表达
Molecular Cloning and Expression of Glyceraldehyde-3-phosphate
Dehydrogenase (GAPDH) Gene of Periplaneta americana
Long Gaoqun1 Wang Yun2 Zhang Chunlin1
（1Department of Biology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004；2Department of Biotechnology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004）
Abstract: It was to clone the GAPDH gene of Periplaneta american, analyze its sequence, express recombinant protein of the Peripla-neta
americana GAPDH, predict the protein structure. Base on a fragment sequence of the GAPDH from Periplaneta american cDNA library, obtained
full-length GAPDH sequence by RACE. The recombinant plasmid pET28a （+）-GAPDH was built to express His-GAPDH fusion protein in
E. coli BL21 （DE3） by IPTG induction, and identified by SDS-PAGE and Western blotting. Results showed the Periplaneta american GAPDH
gene include an reading fragment of 999 bp code for 332 amino acid residues. It revealed 89% identity with GAPDH gene of Bombyx mori.
Key words: Periplaneta americana GAPDH Clone Sequence analysis Prokaryotic express
3- 磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosp-
hate dehydrogenase，GAPDH）广泛存在于原核生物
和真核生物细胞中，作为关键酶参与糖酵解、糖原
异生以及卡尔文循环等能量代谢，是维持生命最基
本活动的酶之一。GAPDH 基因被认为是管家基因
（Housekeeping gene）［1］，在机体不同组织和细胞中
表达丰度高且相对稳定。
近年随着不同物种 GAPDH 基因的报道及其
功能的研究，发现 GAPDH 除参与基本的能量代谢
外，在不同类群的物种中还表现出多样的生物学功
能，是多功能蛋白质。在哺乳动物中，GAPDH 蛋
白在 DNA 修复、细胞凋亡、核 RNA 转运及细胞周
期的调控中都发挥重要作用。高等植物的 GAPDH
基因与植物的抗逆代谢相关，对高盐、缺氧、氧
化、热激等胁迫因子具有抗逆作用。而病原生物
的 GAPDH 研究更为广泛，主要涉及各种病原生物
的 GAPDH 基因克隆和功能研究。Yang 等［2］对曼氏
血吸虫的 GAPDH 进行了克隆和免疫原性鉴定，证
明其具有潜在的疫苗价值 ；阴道毛滴虫 GAPDH 具
有表面纤维素结合蛋白的功能［3］。吴德等［4］成功
克隆表达出华支睾吸虫 GAPDH 融合蛋白，并鉴定
其功能。GAPDH 作为疟原虫糖酵解过程中的关键
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期114
酶，其基因的体外重组克隆、表达研究亦有相关
报道［5, 6］。
迄今，未见美洲大蠊 GAPDH 基因研究的相关
报道。在本实验室已建立美洲大蠊 cDNA 文库的基
础上，通过 RACE 技术获得全长 cDNA 序列，克隆
表达出美洲大蠊 GAPDH 重组蛋白，旨在为进一步
研究其功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 GAPDH全长cDNA序列的获取
筛选本实验室所构建的 cDNA 文库，获得了美洲
大蠊GAPDH基因的部分序列。据此设计3-RACE引
物［7-9］，见表 1。以美洲大蠊 cDNA 为模板进行 PCR
扩增，克隆到 pMD18-T 载体后送上海生工生物有限
公司测序。经序列拼接获得编码美洲大蠊 GAPDH 的
全长 cDNA 序列，据拼接序列设计引物 PCR 扩增并
测序鉴定，其结果与拼接序列一致。并将美洲大蠊
GAPDH 的全长 cDNA 序列上传至 GenBank（登录号：
AEM75021.1）。
1.2 生物信息学分析
利用 NCBI 软件的 ORF Finder、Protein Blast 及
Conserved Domains 工具对全长 cDNA 序列进行 ORF
分析、序列比对及保守区分析，运用 ExPASY 软件
的 ProtParam 工具预测其分子质量、等电点等理化性
质。利用 SignalP 3.0 Server、SOSUI、DNAstar、Kyte-
Doolittle 程序推测其信号肽、可溶性、二级结构、亲
水性［10］。用 Swiss-Model 蛋白质三维结构在线软件
预测 GAPDH 蛋白的三维结构。同时利用 MEGA4.0
软件将美洲大蠊 GAPDH 氨基酸序列与其他物种
GAPDH 氨基酸序列进行多序列比对，用 N-J 法构建
分子系统树。
表 1 美洲大蠊 GAPDH 3-RACE引物
引物名称 引物序列（5-3） 长度（bp）
GAPDH-3 GSP GGCCTGCAGGAATTCGGCACGAGGGC 26
GAPDH-3 Nestav AGCTGCGCTTGAAAAGGGGGCTCAGGT 27
GeneRacerTM 3 Primer GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG 25
GeneRacerTM 3 Nested Primer CGCTACGTAACGGCATGACAGTG 23
1.3 美洲大蠊GAPDH重组蛋白表达
1.3.1 pET28a-GAPDH重组质粒的构建 利用Primer
Primer5 软件，设计 5 端带有 NcoⅠ和 3 端带有
XhoⅠ的引物，以美洲大蠊 cDNA 为模板进行 PCR
扩增。同时双酶切处理 PCR 产物和 pET-28a 载体，
定量后 16℃连接过夜，并转化至感受态大肠埃希
菌 BL21，次日挑取阳性菌，放入含卡那霉素（50
mg/mL）的 LB 液体培养基中培养过夜，提取质粒进
行 PCR、双酶切及测序鉴定。
1.3.2 pET28a-GAPDH 重组蛋白的表达及鉴定 取
过夜培养的菌液 60 μL，加入含有卡那霉素的 6 mL
LB 液体培养基中，37℃、280 r/min 震摇约 3 h 至
OD600=0.6，加入 IPTG 诱导表达，分别取 0、2、4、
6 和 8 h 表达液，SDS-PAGE 电泳分析。按照 His-
Western blot kit 蛋白抗体试剂说明书进行。蛋白经
12% SDS-PAGE 分离后转移到硝酸纤维膜上，室
温下封闭液封闭 1 h 后于摇床上用 PBS 漂洗 3 次，
10 min/次。然后用 6-His tag 蛋白抗体孵育结合，
PBS漂洗3次，10 min/次；再用抗His tag蛋白抗体 （二
抗）孵育结合，PBS 漂洗 3 次，10 min/次。二氨基
联苯胺（DAB）显色 5 min，后将 NC 膜转移入 PBS 液，
终止反应。
2 结果
2.1 美洲大蠊GAPDH基因全长cDNA序列的获取
通过 3-RACE 获得了一条长约 1 300 bp 的单
一条带，测序拼接后获得编码美洲大蠊 GAPDH 基
因的全长 cDNA 序列（图 1）。据拼接序列设计引物
PCR 扩增并测序，结果与拼接序列一致。美洲大蠊
GAPDH 基因完整编码序列，长 999 bp，编码 332 个
氨基酸，蛋白理论分子质量为 35.05 kD，pI 为 5.1。
经 Blastx 比对发现，美洲大蠊 GAPDH 氨基酸序列
与家蚕、小菜蛾、豆无网长管蚜、虱、丽蝇蛹集金
2012年第4期 115龙高群等 ：美洲大蠊 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达
小蜂、冈比亚按蚊、粘虫和果蝇的 GAPDH 一致性
分 别 为 89%、88%、88%、87%、88%、86%、88%
和 85%，其中与家蚕 GAPDH 的相似性最高。
2.2 美洲大蠊GAPDH基因的生物信息学分析
美洲大蠊 GAPDH 具有 2 个保守区域 ：其中保
守区 Gp-dh-C 的 C 端为 α-螺旋和（或）反平行 β-
折叠的混合结构，是行使糖运输和代谢的催化功能
域 ；另一个保守区是 Gp-dh-N，为 NAD+ 结合功能
域。用 ProtFun 软件对蛋白功能进行预测，结果表明，
美洲大蠊 GAPDH 属于氧化还原酶类，主要在中间
2.3 GAPDH分子系统树分析
根据所建系统发育树（图 3）可见，鳞翅目、
蜚蠊目、膜翅目、同翅目、双翅目各目分别聚为一
M. DNA Marker ；1. 3-RACE PCR ；2. 全长 cDNA 序列 PCR
图 1 GAPDH基因的 3-RACE PCR及全长 cDNA序列 PCR
产物代谢和能量代谢中起作用。以上预测结果符合
GAPDH 蛋白的功能特点。
GAPDH 氨基酸序列二级结构及拓扑结构预测结
构显示，其中 α-螺旋占 14.89%（49 aa）、β-折叠占
32.52%（107 aa）。无信号肽序列，为非分泌蛋白 ；
也无跨膜区，GAPDH 蛋白整条肽链都位于细胞膜外；
具有极强的疏水性。三级结构预测如图 2 所示，与
其功能结构域预测结果相似，显示该蛋白具有完整
的 N 端 NAD（P）结合功能域和 C 端糖的运输和代
谢催化功能域。
图 2 GAPDH三级结构预测
图 3 美洲大蠊 GAPDH分子进化树
小支，最后聚为昆虫纲一支。哺乳纲各物种聚为一支，
并且昆虫纲与哺乳纲聚为一大支，而芽孢杆菌纲则
另聚为一大支。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期116
2.4 pET28a-GAPDH重组质粒的构建
重组质粒 pET28a-GAPDH 经菌液 PCR 及提取
重组质粒经 NcoⅠ和 XhoⅠ双酶切处理鉴定与测序鉴
定，均与预期结果一致（图 4）。测序结果与拼接序
列碱基一致，表明以正确的方向将 GAPDH 基因克
隆到表达载体 pET-28a。
2.5 表达产物SDS-PAGE及Western blotting鉴定
SDS-PAGE 分析（图 5）表明，在 0 h 未有目的
蛋白表达，但经 2 h 后在约 35.05 kD 处有少量重组
蛋白表达，经 4、6 及 8 h 诱导后在约 35.05 kD 处有
大量蛋白表达，与理论预测融合蛋白大小相一致。
His-tag 抗体 Western blotting 分析（图 6）显示，在
35.05 kD 处重组蛋白能与 His-tag 抗体特异结合。阴
性对照（空质粒）并无此条带，进一步说明该条带
即为融合表达得目的蛋白条带。
3 讨论
GAPDH 广泛存在于原核和真核生物中，在糖代
谢中具有重要作用。最近的研究表明，GAPDH 除了
M1. λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker ；1.pET-28a ；2.pET-28a 经 NcoⅠ和 XhoⅠ
双酶切 ；3. 重组 pET28a-GAPDH 质粒 ；4. 重组 pET28a-GAPDH 经 NcoⅠ和
XhoⅠ双酶切 ；5. 重组 pET28a-GAPDH 质粒 PCR ；M2.DNA DL2000 Marker
图 4 重组质粒 pET28a-GAPDH限制性内切酶鉴定
糖酵解的功能外，在生命系统中有着各种不同的功
能［11-13］。目前，有关昆虫的 GAPDH 研究多为公共
数据库（如 GenBank）中序列的报道，而功能研究
较为少见。关于美洲大蠊 GAPDH 研究尚未见报道。
本研究进行了美洲大蠊 GAPDH 的基因克隆和体外
表达，并获得重组 GAPDH 蛋白，可为进一步研究
其 GAPDH 的功能奠定基础。
经 Blastp 分析发现，美洲大蠊 GAPDH 的氨基
酸序列与家蚕、小菜蛾、豆无网长管蚜、虱、丽蝇
蛹集金小蜂、冈比亚按蚊、粘虫和果蝇的 GAPDH
一致性（identity）分别为 89%、88%、88%、87%、
88%、86%、88% 和 85%，其中与家蚕 GAPDH 的相
似性最高为 89%。据此可确定该序列编码的蛋白即
1-5. pET28a-GAPDH/BL21 分别经 IPTG 诱导 0、2、4、6 和 8 h；
6. pET-28a/BL21 经 IPTG 诱导 4 h ；7. pET-28a/BL21 未经 IPTG
诱导 ；M. 蛋白质 Marker
图 5 pET28a-GAPDH基因表达产物的 SDS-PAGE分析
M. 蛋白质 Marker ；1. pET28a-GAPDH/BL21 经 IPTG 诱导 ；2. pET28a-
GAPDH/BL21 未经 IPTG 诱导 ；3. pET-28a/BL21
图 6 重组 pET28a-GAPDH蛋白Western blotting分析
2012年第4期 117龙高群等 ：美洲大蠊 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达
为美洲大蠊 GAPDH 蛋白。
根据所建系统进化树可见，昆虫纲聚为一支，
哺乳纲聚为一支，并且昆虫纲与哺乳纲聚为一大支，
而芽孢杆菌纲各物种另聚为一大支。可以看出不同
物种 GAPDH 的同源性能够较好反应各纲间物种的
亲缘关系，因此认为 GAPDH 是研究物种进化与分
类的分子模型［14］。
目前已知 GAPDH 分子由 4 个序列相同的 GapC
亚基组成，细胞质中每个 GapC 亚基均含有 2 个保
守结构域 ：一个是 NAD+ 结合区，该区与许多 NAD+
特异性脱氢酶相应区域的氨基酸序列极为相似［15］；
另一结构域为催化功能区。美洲大蠊 GAPDH 的生
物信息学分析结果表明，美洲大蠊 GAPDH 蛋白同
样具有完整的 N 端 NAD(P) 结合功能域和 C 端糖的
运输和代谢催化功能域，与其他物种 GAPDH 结构
相似。另外，生物信息学分析显示，该蛋白无跨膜区，
提示它不可能作为膜受体起作用，也不可能是定位
于膜的锚定蛋白或者离子通道蛋白等，因此推测美
洲大蠊 GAPDH 存在于细胞质中。
利用生物信息学对未知基因进行初步识别，可
为进一步试验研究指明方向，并在较短的时间内获
得可靠的试验结果，因而越来越受到科研工作者的
重视和广泛应用。
4 结论
本试验首次发现了美洲大蠊 GAPDH 基因，其
完整阅读框含 999 个碱基，编码 332 个氨基酸。生
物信息学分析该基因编码的蛋白具备典型的 GAPDH
结构，该蛋白与家蚕 GAPDH 相似性为 89%，具有
GAPDH 保守功能域，并成功构建了 pET28a-GAPDH
原核表达重组质粒，在体外得以表达，为今后
GAPDH 的功能研究奠定基础。
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（责任编辑 马鑫）