免费文献传递   相关文献

Isolation of Ethyl Acetate Extract from Periplaneta americana and Its Antimicrobial Activity

美洲大蠊乙酸乙酯提取物的分离和抑菌活性分析



全 文 :林业科学研究 2013,26(2) :163 166
Forest Research
文章编号:1001-1498(2013)02-0163-04
美洲大蠊乙酸乙酯提取物的分离和抑菌活性分析
王 奎,冯 颖* ,孙 龙,何 钊,陈智勇
(中国林业科学研究院资源昆虫研究所 国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室,云南 昆明 650224 )
收稿日期:2012-11-23
基金项目:国家林业局“西南特色昆虫资源及经济树种种质资源收集保存与良种繁育基地建设”项目
作者简介:王 奎(1985—) ,男,河北保定人,硕士研究生,主要从事药用昆虫活性成分研究.
* 通讯作者.
摘要:采用活性追踪法和柱层析法,以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等 5 种细菌为供试菌种,对美洲大蠊乙酸乙酯提取
物进行分离和抑菌试验。研究发现:美洲大蠊乙酸乙酯提取物对供试的革兰氏阳性菌具有一定的抑制作用,其中,
对枯草芽孢杆菌的抑菌活性最好;经硅胶柱层析初分离后,从乙酸乙酯提取物获得了 9 个具有抑菌活性的组分,其
中,组分 Fr7 对 5 种供试菌均显示了较好的抑菌活性;组分 Fr7 及其相邻组分 Fr8 经硅胶和凝胶柱层析进一步分离
纯化后,得到了 7 个具有抑菌活性的不饱和脂肪酸类化合物,均对藤黄微球菌表现出最好的抑菌活性。结果表明:
美洲大蠊乙酸乙酯提取物的抑菌活性物质为不饱和脂肪酸类化合物,对供试的革兰氏阳性菌的抑菌活性较强。
关键词:美洲大蠊;乙酸乙酯提取物;抑菌活性;不饱和脂肪酸
中图分类号:S718. 43 文献标识码:A
Isolation of Ethyl Acetate Extract from Periplaneta americana
and Its Antimicrobial Activity
WANG Kui,FENG Ying,SUN Long,HE Zhao,CHEN Zhi-yong
(Research Institute of Resources Insects,Chinese Academy of Forestry,Key Laboratory of Cultivation and Utilization of Resources Insects,
State Forestry Administration,Kunming 650224,Yunnan,China)
Absract:Antimicrobial chemical components,which isolated from the ethyl acetate extract of Periplaneta americana
L.,were tested for the ability to inhibit Staphyloccocus aureus,Escherichia coli,etc.,based on bioassay-guided
method. The results indicated that the ethyl acetate extract of P. americana showed some inhibiting effects to all
gram-positive bacteria tested,and the best inhibition effect was against Bacillus subtilis. Nine factions were obtained
after silica gel column chromatography. Among them,the faction Fr7 showed inhibiting effects to all bacteria tested.
Applying the isolation method of silica gel column and gel chromatography,seven unsaturated fatty acids compounds
were isolated from the faction Fr7 and Fr8. All these compounds showed the best inhibiting effects against Micrococ-
cus luteus. The results suggested that unsaturated fatty acids were antimicrobial chemical components of the ethyl ac-
etate extract from P. americana. The inhibition effects of the unsaturated fatty acids against gram-positive bacteria
were stronger than against gram-negative bacteria.
Key words:Periplaneta americana;ethyl acetate extract;antimicrobial activity;unsaturated fatty acid
昆虫是动物界中最大的类群,长期的进化形成
了一套高效快速抵抗各种病原菌的本领,是寻找新
型抗菌物质的重要来源之一。除研究最为广泛的抗
菌肽[1],昆虫体内还有众多的小分子代谢产物具有
抗菌活性。Zhengwei 等[2]在长白山红蚁(Tetramori-
um sp.)的抗菌物质研究中获得了 2 个新的具有抑
菌活性的香豆素类化合物。Jae Yoon Leem 等[3]从
帕克阿扁叶蜂 (Acantholyda parki Shinohara and
Byun)中分离得到的对羟基肉桂醛表现出了广谱的
抗菌活性。李蕾等[4]在云南琵琶甲(Balaps japanen-
林 业 科 学 研 究 第 26 卷
sis yunnanensis Mars.)的抑菌化学成分研究中得到
的 2-甲基-1,4-苯二醇和对苯二酚具有广谱抗菌活
性。Stephen等[5]对澳大利亚白蚁(Nasutitermes trio-
diae)的抗菌物质进行了研究,发现了一族具有抗菌
活性且骨架新奇的二萜类化合物,具有很好的开发
价值。这些研究结果表明,昆虫体内的小分子代谢
产物对筛选新型抗菌物质具有重要意义。
美洲大蠊(Periplaneta americana L.)是一种传
统药用昆虫,为蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫,研究表
明,美洲大蠊有促进血管增生、组织修复,强心升压、
改善微循环,抗菌抗炎、抗病毒,抗肿瘤、增强免疫等
作用,目前已开发出“康复新”、“隆肝胶囊”、“心脉
隆”等多种药物,临床上用于治疗烫伤、烧伤、肝癌、
心血管等疾病,其药效成分主要为水溶性成
分[6 - 11],还未见其脂溶性成分的药效研究。本文研
究发现美洲大蠊乙酸乙酯提取物具有一定抑菌活
性,为了阐明其活性物质基础,通过活性追踪法和柱
层析法从乙酸乙酯提取物中分离得到了 7 个有抑菌
活性的长链不饱和脂肪酸类化合物。本研究为美洲
大蠊小分子抑菌物质研究奠定了一定的基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试虫 美洲大蠊购自云南省腾冲制药有限公
司,经中国林业科学研究院资源昆虫研究所陈晓鸣研
究员鉴定为大蠊属昆虫(Periplaneta americana L.)。
1. 1. 2 供试菌种 金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus
aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、枯草芽孢
杆菌(Bacillus subtilis)为革兰氏阳性菌;大肠杆菌
(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aerugin-
osa)为革兰氏阴性菌;购自云南大学微生物中心,4
℃保存;供试菌种使用前接种到 pH 值 7. 2 的 LB 固
体培养基上,37 ℃恒温培养 16 18 h,备用。
1. 1. 3 主要仪器和试剂 Bruker AM-400 核磁共振
光谱仪(TMS 为内标,δ 为 ppm,J 为 Hz)。Agilent
5975C质谱仪。柱色谱硅胶(200 300 目)和薄层
色谱硅胶 GF254均为青岛海洋化工厂生产;凝胶为
Sephadex LH-20(Pharmacia Fine Chemical Co. Ltd) ;
石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、二甲基亚砜
(DMSO)等均为分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 提取物的制备 美洲大蠊干燥虫体(13 kg)
粉碎,分别用石油醚 10 L 浸泡提取 4 次,每次静置
24 h后,过滤,残渣晾干后,分别用乙酸乙酯 10 L 浸
泡提取 4 次、过滤,合并滤液,减压浓缩得乙酸乙酯
提取物。
1. 2. 2 抑菌活性物质的分离 乙酸乙酯提取物
(400 g)经硅胶拌样,干法上硅胶柱层析,以石油醚、
石油醚 /乙酸乙酯(15∶ 1、8∶ 1、5∶ 1、3∶ 1、1∶ 1)、乙酸乙
酯、乙醇梯度洗脱,每种洗脱液 3 000 mL,每 500 mL
收集一个馏分,经硅胶薄层层析(TLC)合并相同的
馏分得组分 Fr1 Fr9,对各组分进行减压浓缩和抑
菌活性测定。抑菌谱较广、活性较好的组分 Fr7 及
相邻组分 Fr8 经硅胶柱层析和 Sephadex LH-20 凝胶
柱层析(氯仿 /甲醇 1∶ 1)进一步分离纯化后,从组分
Fr8 中分离得到了化合物 1 4,从组分 Fr7 中分离
得到了化合物 5 7,检测化合物的抑菌活性并采用
核磁共振、质谱测定其结构类型。
1. 2. 3 抑菌活性测定方法 抑菌活性测定采用平
板滤纸片法[12],根据抑菌圈直径大小来判断抑菌能
力。细菌培养采用 LB培养基,取牛肉膏 3. 0 g、蛋白
胨 5. 0 g、氯化钠 5. 0 g、琼脂 17. 0 g,加蒸馏水至
1 000 mL,调 pH 值至 7. 2,高温灭菌后趁热倒入直
径 9 cm的培养皿中,每皿倒入约 25 mL,制成平板。
供试菌种培养复苏后,用 0. 9%的生理盐水将培养
至对数期细菌配成 1 × 106 CFU·ml -1菌液,每皿取
400 μL菌液均匀涂布于平板上。将灭菌干燥后的
滤纸片(直径 6. 0 mm)放在平板上,将样品配置成一
定浓度的 DMSO 样液,每个滤纸片加 10 μL 溶液样
品,在 37 ℃下培养 24 h后测量并记录抑菌圈大小,
抑菌圈测量采用十字交叉法,每个样品做 3 次重复,
取平均值,扣除滤纸片大小,阴性对照为 DMSO。抑
菌圈直径≥3. 00 mm 为抑菌作用强,抑菌圈直径在
2. 00 3. 00 mm 间为抑菌作用较强,抑菌圈直径在
1. 00 2. 00 mm 间为抑菌作用较弱,抑菌圈直径≤
1. 00 mm为抑菌作用微弱,抑菌圈直径为 0. 00 mm
为无抑菌作用。
2 结果与分析
2. 1 提取物的抑菌活性
美洲大蠊乙酸乙酯提取物在 1 g·mL -1条件下
对 5 种供试菌的抑菌作用见表 1。由表 1 可知:乙酸
乙酯提取物对供试的革兰氏阳性菌均有抑制作用,
其中,对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强,对金黄色葡
萄球菌和藤黄微球菌的抑制作用微弱,对供试的革
兰氏阴性菌无活性。
461
第 2 期 王 奎等:美洲大蠊乙酸乙酯提取物的分离和抑菌活性分析
表 1 美洲大蠊乙酸乙酯提取物的抑菌活性
提取物
供试菌种抑菌圈直径 /mm
金黄色
葡萄球菌
藤黄
微球菌
枯草芽
孢杆菌
大肠
杆菌
绿脓
杆菌
乙酸乙酯提取物 0. 30 0. 10 2. 00 0. 00 0. 00
阴性对照 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
注:抑菌圈直径已扣除滤纸片大小。
2. 2 组分 Fr1 Fr9 的抑菌活性
美洲大蠊乙酸乙酯提取物经硅胶柱层析初分离
得到 9 个组分 Fr1 Fr9,极性由小到大,在 0. 1 g·
mL -1下条件对 5 种供试菌的抑菌活性见表 2。由表
2 可知:组分 Fr1 Fr9 对供试菌的抑菌活性并没有
随着极性改变出现规律性变化,同一组分对不同供
试菌的抑菌活性也存在明显差异。组分 Fr3、Fr6、
Fr7 和 Fr8 对金黄色葡萄球菌表现出了抑菌活性,其
中,组分 Fr3 的抑菌活性最强,组分 Fr6 的抑菌活性
最弱。组分 Fr2 Fr8 均对藤黄微球菌表现出了抑
菌活性,其中,组分 Fr3 的抑菌活性最强,组分 Fr2
的抑菌活性最弱。除组分 Fr9 外,其他组分均对枯
草芽孢杆菌表现出了抑菌活性,其中,组分 Fr7 的抑
菌活性最强,组分 Fr1 的抑菌活性最弱。组分 Fr4、
Fr7 和 Fr9 对大肠杆菌的抑菌活性较弱。组分 Fr4
和 Fr7 对绿脓杆菌表现出微弱的抑菌活性。
表 2 组分 Fr1 Fr9 的抑菌活性
组分
供试菌种抑菌圈直径 /mm
金黄色
葡萄球菌
藤黄微
球菌
枯草芽
孢杆菌
大肠
杆菌
绿脓
杆菌
组分 Fr1 0. 00 0. 00 0. 20 0. 00 0. 00
组分 Fr2 0. 00 1. 00 1. 00 0. 00 0. 00
组分 Fr3 3. 80 5. 10 3. 22 0. 00 0. 00
组分 Fr4 0. 00 1. 04 2. 90 1. 46 1. 30
组分 Fr5 0. 00 1. 80 2. 40 0. 00 0. 00
组分 Fr6 0. 90 3. 00 2. 94 0. 00 0. 00
组分 Fr7 2. 60 4. 00 3. 94 1. 50 1. 80
组分 Fr8 2. 30 2. 90 2. 90 0. 00 0. 00
组分 Fr9 0. 00 0. 00 0. 00 1. 50 0. 00
阴性对照 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
注:抑菌圈直径已扣除滤纸片大小。
2. 3 化合物的抑菌活性
经反复硅胶和凝胶柱层析,从组分 Fr7 和 Fr8
中分离得到 7 个化合物,在 5 mg·mL -1条件下对 5
种供试菌的抑菌活性见表 3。由表 3 可知:除化合物
3 外,其他化合物均对金黄色葡萄球菌显示了不同
程度的抑菌活性,其中,化合物 6 的抑菌活性最强,
化合物 1 的抑菌活性最弱。化合物 1 7 均对藤黄
微球菌显示了强的抑菌活性,其中,化合物 2 的抑菌
活性最强,化合物 7 的抑菌活性最弱。化合物 1 7
均对枯草芽孢杆菌显示了不同程度的抑菌活性,其
中,化合物 3 的抑菌活性最强,化合物 1 的抑菌活性
最弱。除化合物 5 外,其他化合物均对大肠杆菌显
示的抑菌活性较弱,其中,化合物 2 和 3 的抑菌活性
最强,化合物 7 的抑菌活性最弱。化合物 1 7 均
对绿脓杆菌显示了不同程度的抑菌活性,其中,化合
物 6 和 7 的抑菌活性最强,化合物 5 的抑菌活性最
弱。同一化合物对不同供试菌的抑菌活性存在一定
差异,但所有化合物均对藤黄微球菌显示了最好的
抑菌活性。
表 3 化合物的抑菌活性
化合物
供试菌种抑菌圈直径 /mm
金黄色
葡萄球菌
藤黄微
球菌
枯草芽
孢杆菌
大肠
杆菌
绿脓
杆菌
化合物 1 1. 00 6. 74 0. 82 1. 20 1. 20
化合物 2 2. 10 19. 70 3. 10 1. 34 1. 26
化合物 3 0. 00 12. 20 6. 00 1. 34 1. 06
化合物 4 3. 00 13. 00 4. 03 1. 00 1. 26
化合物 5 2. 00 17. 54 3. 00 0. 00 0. 18
化合物 6 3. 52 8. 50 4. 00 0. 44 2. 20
化合物 7 3. 20 5. 44 2. 20 0. 40 2. 20
阴性对照 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
注:抑菌圈直径已扣除滤纸片大小。
2. 4 化合物的结构分析
经1H-NMR、13C-NMR、MS谱图分析,化合物 1
7 均为不饱和脂肪酸及其衍生物,结构有待鉴定。
3 结论与讨论
美洲大蠊乙酸乙酯提取物对供试的革兰氏阳性
菌具有一定抑菌活性,经硅胶柱层析初分离后得到
了 9 个具有抑菌活性的组分,其中,组分 Fr3 对供试
的革兰氏阳性菌表现出了强的抑菌活性,组分 Fr7
对 5 种供试菌均表现出了抑菌活性;经反复硅胶和
凝胶柱层析从组分 Fr7 和 Fr8 中分离纯化得到了 7
个有抑菌活性的化合物,均对藤黄微球菌表现出最
强抑菌活性;经核磁共振、质谱分析,化合物均为极
性较大的不饱和脂肪酸类化合物。
采用活性追踪法研究天然产物过程中,由于原
料多是粗提取物,测试的干扰因素太多,常常得到假
阳性或者假阴性的结果[13];本文研究中发现,美洲
大蠊乙酸乙酯提取物对供试的革兰氏阴性菌无抑菌
活性,经初分离后有组分表现出了抑菌活性;组分
561
林 业 科 学 研 究 第 26 卷
Fr8 对供试的革兰氏阴性菌无抑菌活性,而从中分
离得到的化合物 1 4 均表现出了抑菌活性;孙龙
等[14]在喙尾琵甲幼虫抗菌肽的研究中也得到了类
似的结果;分析原因可能是乙酸乙酯提取物和组分
Fr8 中对供试的革兰氏阴性菌具有抑菌活性的物质
含量较低,经分离后具有抑菌活性的物质得到了富
集,从而显示出抑菌活性。组分 Fr7 和 Fr8 分别对
藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性相当,但从
中分离得到化合物 1 7 对藤黄微球菌的抑菌活性
均明显强于对枯草芽孢杆菌的抑菌活性,原因可能
是对枯草芽孢杆菌有最好抑菌活性的化学成分在分
离纯化过程中丢失[15],或者是这些化学成分间存在
协同作用,增加了组分对枯草芽孢杆菌的抑菌活
性[16]。比较提取物、组分、化合物对供试菌种的抑
菌活性,推测对枯草芽孢杆菌具有最好抑菌活性的
化学成分可能在组分 Fr3 中。组分 Fr3 含量较大,
15%硫酸无水乙醇 TLC 薄层显色为紫色条带,极性
相似,分离难度较大,其抑菌活性成分有待进一步
研究。
不饱和脂肪酸广泛存在于植物、微生物、昆虫
中,具有降低血糖、调节血脂、减少胆固醇含量、保护
心脏和防止记忆下降等多种生理功能[17 - 18];研究表
明,具有 10 28 个碳的不饱和脂肪酸具有广谱抑
菌活性,通过多种不同机制对细菌起到抑制甚至杀
灭作用,但抑菌作用机制还不完全清楚,认为主要是
作用于细菌的细胞膜并影响细胞膜的各种生理功
能;因此,不饱和脂肪酸具有开发成抗菌药物的潜在
价值[19]。本研究发现:从美洲大蠊乙酸乙酯提取物
中分离得到的不饱和脂肪酸在体外表现出了抑菌活
性;在该虫体内是否具有抑菌活性有待进一步研究。
参考文献:
[1]Bulet P,Hetru C,Dimarcq J L,et al. Antimicrobial peptides in in-
sects;structure and function[J]. Developmental and comparative im-
munology,1999,23(4 - 5) :329 - 344
[2]Song Zhengwei,Yin Weiping,Liu Pu,et al. Isolation and i-
dentification of antibacterial neo-compounds from red ants of Chang-
Bai Mountain,Tetramorium sp.[J]. Bioorganic and medicinal chem-
istry letters,2012,22(6) :2175 - 2181
[3]Leem J Y,Jeong I J,Park K T,et al. Isolation of p-hydroxycin-
namaldehyde as an antibacterial substance from the saw fly,Acan-
tholyda parki S.[J]. Bioorganic and medicina chemistry letters,
1999,442(1) :53 - 56
[4]李 蕾,罗氘芸,刘 勇. 云南琵琶甲抗菌活性成分研究
[J].中草药,2001,32(3) :197 - 199
[5]Zhao C,Trowell S C,Rodney R W,et al. Antibiotics from Aus-
tralian terrestrial invertebrates. part1:antibacterial trinervitadienes
from the termite nasutitermes triodiae[J]. Tetrahedron,2004,60
(47) :10753 - 10759
[6]南京中药大学.中药大辞典(第 2 版) [M].上海:上海科技
出版社,2006:3784 - 3785
[7]何正春,彭 芳,宋丽艳,等.美洲大蠊化学成分及药理作用
研究进展[J].中国中药杂志,2007,21(32) :2326 - 2331
[8]高永翔,扈晓宇,钟 森,等.蟑螂提取物抗肝损伤及抗病毒
作用探讨[J].国际中医中药杂志,2006,28(3) :155 - 158
[9]李洪文,耿 玲,刘光明,等.美洲大蠊脱脂膏及其活性炭脱
色物体外抗菌活性研究[J]. 中国实验方剂学杂志,2012,18
(11) :159 - 161
[10]焦春香,刘光明,周 萍.天然药物康复新的研究进展[J].时珍
国医国药,2008,19(11) :2623 - 2624
[11]吴建新,钮荣祥,黄秀群,等.心脉龙注射液抗衰老作用的实验
研究[J].贵阳医学院报,2002,27(2) :125 - 127
[12]中华人民共和国卫生部医政司. 全国临床检验操作规程(第 3
版) [M].南京:东南大学出版社,2006:890
[13]姚新生.中药天然药物活性成分的研究方法[J].药学服务与研
究,2003,3(4) :205 - 209
[14]孙 龙,冯 颖,何 钊,等.诱导和非诱导条件下喙尾琵甲幼
虫抗菌肽分离及抑菌活性比较[J]. 林业科学研究,2012,25
(3) :373 - 377
[15]史清文,李力更,霍长虹,等. 天然药物化学研究与新药开发
[J].中草药,2010,41(10) :1583 - 1589
[16]Tallarida R J. Drug synergism:its detection and applications[J].
Pharmacology and experimental,2001,289(3) :865 - 872
[17]王 炜,张伟敏.单不饱和脂肪酸的功能特性[J]. 中国食物与
营养,2005(4) :44 - 46
[18]蔡双莲,李 敏.多不饱和脂肪酸研究进展[J].生命科学研究,
2003,7(4) :289 - 292
[19] Desbois A P,Smith V J. Antibacterial free fatty acids:activities,
mechanisms of action and biotechnological potential[J]. Applied
Microbiol and Biotechnology,2010,85(6) :1629 - 1642
661