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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
近年来，基于现代分子生物学技术的非培养
（culture-independent）方法已广泛应用于植物微生物
生态学的研究领域，可较为客观地反应微生物的群
落结构及其与植物之间的相互作用关系［1，2］。然而，
以传统的微生物分离及筛选技术为基础的微生物培
养方法亦有其不可替代的优点，通过该方法能够了
解可培养微生物在特定生境下的生存状况，另一方
面可获得具有潜在应用价值的微生物菌种［1］。
种子不仅是植物的繁殖器官，而且还是多种有
益细菌和病原菌的传递载体，其表面及内部蕴藏着
多种微生物群落，直接或间接地影响着植物诸多方
面的性状［3］。近年来对于植物内生细菌特别是其中
有益细菌的研究已日益深入，但对于植物种子内生
细菌的报道还相对较少［3］，特别是针对于功能性植
物资源种子内生细菌的研究还非常缺乏。
收稿日期 ：2013-03-28
基金项目 ：中国食品发酵工业研究院科技发展基金（博士基金）项目（2012KJFZ-BS-01）
作者简介 ：程池，男，教授级高级工程师，博士生导师，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：cheng100027@163.com
西沙野生诺尼种子内生细菌的分离与筛选
程池1  刘洋1  曹艳花1  李辉1  李金霞1  姚粟1  谭望桥2 
（1. 中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100027 ；2. 海南诺尼生物工程开发有限公司，海口 570125）
摘 要： 通过微生物培养方法首次对我国西沙野生诺尼种子内生细菌进行分离及筛选，共得到 20 株内生细菌，经形态学观察、
16S rDNA 扩增及系统发育分析，将其归为变形菌门（Proteobacteria）中的肠杆菌（Enterobacter sp.）、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia
sp.）和泛菌（Pantoea sp.）3 个菌属。
关键词 ： 诺尼 种子 内生细菌 培养方法
Separation and Screening of Endophytic Bacteria in Xisha Wild Noni
（Morinda citrifolia L.）Seed
Cheng Chi1 Liu Yang1 Cao Yanhua1 Li Hui1 Li Jinxia1 Yao Su1 Tan Wangqiao2
（1. China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100027 ；
2. Hainan Noni Biological Engineering Development Co.，Ltd.，Haikou 570125）
Abstract:  This is the first report that the endophytic bacteria in Xisha wild Noni seed were isolated, screened and identified by the
microbial culture-dependent method combing with morphological observation, 16S rDNA amplification and phylogenetic analysis, indicated that
the total 20 strains from Noni seed were clustered into 3 genus belonging to Proteobacteria, Enterobacter sp., Burkholderia sp. and Pantoea sp..
Key words:  Noni Seed Endophytic bacteria Culture-dependent method
本研究采用微生物培养方法对我国重要的植
源 性 保 健 食 品 原 材 —— 西 沙 野 生 诺 尼（Morinda
citrifolia L.）种子内生细菌进行了分离及筛选，旨在
为下一步研究这些微生物与诺尼植物生长及功效性
成分产生之间的相关性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物样品 西沙野生诺尼成熟果实，于 2012
年 12 月采集自中国海南省三沙市永兴岛，具体位置
为北纬 16.83˚，东经 112.34˚。在无菌条件下剥离诺
尼种子，种子样品于 4℃保存。
1.1.2 培养基及试剂 LB 及 R2A 成品培养基，购
自北京陆桥公司 ；细菌基因组 DNA 提取试剂盒及
PCR 相关试剂购自 TIANGEN 公司 ；PCR 引物由北
京诺赛生物公司合成。
2013年第9期 143程池等 ：西沙野生诺尼种子内生细菌的分离与筛选
1.2 方法
1.2.1 样品表面灭菌 称取 5 g 种子样品，并用无
菌水冲洗，之后依次用 70% 乙醇、次氯酸钠溶液
（2.5% 有 效 Cl-） 和 70% 乙 醇 浸 泡 3 min、5 min 和
30 s，再用无菌水淋洗 6 次，并于无菌条件下晾干 ；
同时取最后一次淋洗水 120 μL 涂于 LB 固体培养基
平板上，28℃培养 72 h，以检测表面灭菌效果［3］。
1.2.2 内生细菌的分离与纯化 采用刘琳等［1］方法
进行。将表面灭菌处理的诺尼种子置于无菌研钵中
研磨成粉末，然后依次用无菌水稀释成浓度为 10-1、
10-2 和 10-3 悬液。分别取 200 μL 涂布于 R2A 和 LB
平板上，每个处理 3 个平行。28℃培养 2-3 d。根据
菌落形态（大小、形状、颜色、表面光泽度、边缘
整齐度、透明度等），随机挑取平板上具有差异的代
表性菌落，纯化后将其接种于相对应斜面培养基 4℃
保存备用。
1.2.3 内生细菌的 16S rDNA 序列分析 采用细菌基
因组 DNA 提取试剂盒（TIANGEN）提取菌株基因组
DNA 作为 PCR 反应的模板。采用细菌通用引物 27F
（5-AGAGTTTCATCTGGCTCAG-3）和 1492R（5-G-
GTTACCTTGTTACGACTT-3）［4］对菌株 16S rDNA 片
段 进 行 PCR 扩 增。PCR 反 应 体 系（50 μL）：10×
buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4 μL、引物 27F（10
mmol/L）1 μL、引物 1492R（10 mmol/L）1 μL、Taq
酶（5 U/L）0.25 μL、DNA 模板 3 μL、ddH2O 补足至
50 μL。PCR 反应程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃
1 min，72℃ 1 min，30 个循环 ；72℃ 10 min。1% 琼
脂糖检测凝胶电泳检测 PCR 扩增产物。采用 ABI
3730 型 DNA 测序仪测序（ABI，USA），将序列信
息提交至 NCBI，并将测序得到的结果在 EzTaxon
server 2.1 进行比对［5］，确定与已知序列的同源关系。
2 结果
2.1 诺尼种子内生细菌的分离纯化
通过传统微生物分离培养共获得诺尼种子内生
细菌 20 株，根据菌落及菌体形态学特征观察将这些
菌株初步划分为 4 个类群，分别包含 3、7、6 及 4
株内生细菌菌株，每类群挑选 1 个代表菌株，分别
命名为 NZ1、NZ2、NZ12 及 NZ14，其菌落及菌体形
态特征如表 1 所示，分离所得的内生细菌菌落形态
主要呈现白色和黄色，且均表面光滑和边缘整齐 ；
经革兰氏染色观察，全部为革兰氏阴性细菌。
表 1 诺尼种子内生细菌及其形态特征
菌株 菌落及菌体形态特征
NZ1
菌落乳白色，圆形，表面光滑、湿润、凸起，不透明，边
缘整齐，G-，好氧
NZ2
菌落黄色，圆形，表面光滑、凸起，不透明，边缘整齐，G-，
好氧
NZ12
菌落白色，圆形，表面光滑、湿润、稍凸起，边缘整齐，G-，
好氧
NZ14
菌落黄色，圆形，表面光滑、湿润、稍凸，边缘整齐，G-，
好氧
2.2 诺尼种子内生细菌基因组DNA提取及16S rDNA
片段PCR扩增
用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取诺尼果内生
细菌基因组 DNA，1% 凝胶电泳结果（图 1）显示，
总 DNA 大小约为 23 kb。以菌株基因组 DNA 为模板
的 PCR 扩增（图 2）显示，1% 凝胶电泳显示 PCR
产物条带单一，大小约为 1 500 bp。
23.1
kb
M 1 2 3 4
M ：λDNA/Hind III Marker ；1 ：NZ1 ；2 ：NZ2 ；3 ：NZ12 ；4 ：NZ14
图 1 诺尼种子样品基因组 DNA 提取结果
1500
bp
M 1 2 3 4
M ：100 bp DNA Ladder ；1 ：NZ1 ；2 ：NZ2 ；3 ：NZ12 ；4 ：NZ14
图 2 诺尼种子内生细菌 16S rDNA 片段扩增结果
2.3 诺尼种子内生细菌16S rDNA系统发育分析
诺尼种子内生细菌的 16S rDNA 序列比对分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期144
结 果（ 表 2） 显 示， 所 得 序 列 GenBank 登 录 号 为
KC702725-KC702728。 经 16S rDNA 序 列 比 对 及 其
系统发育分析（图 3），诺尼种子内生细菌分属变形
菌 门（Proteobacteria） 中 的 肠 杆 菌 属（Enterobacter
sp.）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia sp.）和泛菌
属（Pantoea sp.）。其中 NZ1 同霍氏肠杆菌（Entero-
bacter hormaechei）的相似性最高，为 99.42% ；NZ2
同斯氏泛菌（Pantoea stewartii）的相似性最高，为
99.63% ；NZ12 同唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkho-
lderia gladioli） 的 相 似 性 最 高， 为 99.62% ；NZ14
同分散泛菌（Pantoea dispersa）的相似性最高，为
100%（表 2）。
表 2 诺尼种子内生细菌 16S rDNA 序列相似性分析
门 属 NCBI 中相似性最高的菌株 相似性（%） GenBank 登录号
Enterobacter Enterobacter hormaechei ATCC 49162T（AFHR01000079） 99.42 KC702725
Proteobacteria Pantoea
Pantoea stewartii subsp. indologenes LMG 2632T（Y13251） 99.63 KC702726
Pantoea dispersa LMG 2603T（DQ504305） 100.00 KC702727
Burkholderia Burkholderia gladioli CIP 105410T（EU024168） 99.62 KC702728
NZ2
Pantoea stewartii subsp. indologenes LMG 2632T (Y13251)
NZ14
NZ1
Enterobacter hormaechei ATCC 49162T (AFHR01000079)
NZ12
Burkholderia gladioli CIP 105410T (EU024168) 100
100
100
99
71
0.02
Pantoea dispersa LMG 2603T (DQ504305)
括号内为 GenBank 中的收录号 ；每个分支点处的数字为 Bootstrap（1 000 次抽样）的支持百分率 ；标尺代表 2% 的序列差异度
图 3 邻接法构建的诺尼种子生细菌 16S rDNA 序列系统发育树
3 讨论
诺尼（Morinda citrifolia L.）系茜草科植物，是
一种发源于南太平洋岛屿的热带植物，富含 160 余
种营养成分［6］，在我国的西沙群岛分布有诺尼野生
种资源，同时在我国海南省有一定规模的引种。诺
尼的果实、叶片、种子、花、茎、根及树皮均具有
良好的药用及保健功效［7］。国内外已有众多关于诺
尼植物对多种病症具有显著疗效的科学研究报道，
如抗病毒（如 SARS、HIV 等病毒）、抗癌，对治疗
自身免疫疾病（如风湿病），阻止和减少急、 慢性病
痛的发生，对哮喘等呼吸道疾病、糖尿病、肾炎、
关节炎、癔症、敏感症、动脉粥样硬化、瘀血、消
化系统疾病、多种硬化症、心血管疾病（高血压、
心肌梗死）都具有一定的疗效［8，9］。
植物种子还是多种有益细菌和病原菌的传递载
体，其表面及内部蕴藏着多种微生物群落，直接或
间接地影响着植物的诸多方面的性状。近半个世纪
以来，一系列的研究表明植物的内生菌与植物的基
因型、生长发育时期及功效性成分的产生具有一定
的相关性［3］。刘洋等［3，10-12］曾利用非培养方法对玉
米种子内生及种子际细菌区系进行研究，鉴定得到
的细菌群落中不乏能够促进植物生长的促生细菌类
群。本研究组邹媛媛等［13］曾统计了已报道的在大麦、
水稻、大豆、油菜、棉花、甜菜和番茄等植物中与
种子相联合的细菌种类，共计 50 余个属，100 余个种，
其中也不乏一些植物促生细菌种类。
本研究自我国重要的植源性保健食品原材——
西沙野生诺尼种子中分离培养得到 4 种内生细菌。
其中，分散泛菌对水稻白叶枯病菌（Xanthomonas
campestris pv. oryzae）具有良好的拮抗作用［14］，能
够间接促进水稻植物的生长和健康，属于常见的
植物促生细菌 ；唐菖蒲伯克霍尔德氏菌对辣椒疫
霉（Phytophthora capsici）、大丽轮枝菌（Vertieillium
dahliae Kleb.）、 烟 草 疫 霉（ Phytophthora nicotianae
Breda.）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）等植物
病原菌都有一定的拮抗作用，且该菌还具有溶磷的
2013年第9期 145程池等 ：西沙野生诺尼种子内生细菌的分离与筛选
特性［15］；霍氏肠杆菌能够通过液体发酵生产青霉素
酶，目前该酶已主要用于对食品中青霉素残留量的
快速定量测定［16］。
由此可见，西沙野生诺尼种子内生细菌群落中
存在有益细菌资源，因此，利用多种培养条件进一
步分离筛选诺尼种子内生细菌，以获得种类更为丰
富的内生菌资源，为进一步研究其中的有益功能菌
种与诺尼植物的生长健康及其功效性成分产生之间
的相关性奠定了微生物资源基础。这是国内外首次
利用培养方法对诺干种子内生菌进行研究的报道。
4 结论
首次利用微生物培养方法分离筛选诺尼种子的
内生细菌，分属变形菌门（Proteobacteria）中的肠杆
菌属（Enterobacter sp.）、伯克霍尔德氏菌属（Burk-
holderia sp.）和泛菌属（Pantoea sp.），其中包含植
物促生细菌及发酵功能菌种类。
致谢 ：本研究得到了海南省三沙市政府的大力
支持与帮助，在此表示衷心的感谢。
参 考 文 献
［1］ 刘琳 , 刘洋 , 宋未 . 杂交水稻种子固有细菌群落多样性探究［J］.
生物技术通报 , 2009（1）：95-99.
［2］ 刘琳 , 刘洋 , 宋未 . PCR-DGGE 技术及其在植物微生态研究中
的应用［J］. 生物技术通报 , 2009（3）：54-56.
［3］ 刘洋 , 左山 , 邹媛媛 , 等 . 杂交玉米农大 108 及其亲本种子内生
细菌群落多样性的研究［J］. 中国农业科学 , 2011, 44（23）：
4763-4771.
［4］ Liu Y, Liu L, Qiu F, et al. Paenibacillus hunanensis sp. nov., isolated
from rice seeds［J］. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 2010, 60（6）：1266-1270.
［5］ Chun J, Lee JH, Jung Y, et al. EzTaxon ：a web-based tool for the
identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene
sequences［J］. Int J Syst Evol Micr, 2007, 57（10）：2259-2261.
［6］ 褚大为 . 来自伊甸园的礼物——热带野果萝荔的故事［M］.
上海 ：上海科学普及出版社 , 2002 ：1-2.
［7］ 张伟敏 , 魏静 , 施瑞诚 . Noni 果的活性成分和生理功能的研究
进展［J］. 天然产物研究与开发 , 2007, 19 ：1087-1091.
［8］ 李法营 , 蓝增全 , 刘昌芬 , 等 . 诺丽研究进展——国内外研究进
展［J］. 安徽农业科学 , 2009, 37（32）：15819-15821.
［9］ 彭勇 , 肖伟 , 刘伟 , 等 . 世界药用植物新宠——海巴戟果［J］.
国外医药 , 2007, 22（3）：93-96.
［10］ Liu Y, Zuo S, Zou Y, et al. Investigation on diversity and population
succession dynamics of endophytic bacteria from seeds of maize
（Zea mays L., Nongda108）at different growth stages［J］.
Annals of Microbiology, 2013, 63 ：71-79.
［11］ Liu Y, Zuo S, Xu L, et al. Study on diversity of endophytic bacterial
communities in seeds of hybrid maize and their parental lines［J］.
Archives of Microbiology, 2012, 194 ：1001-1012.
［12］ Liu Y, Zuo S, Zou Y, et al. Investigation on diversity and
population succession dynamics of indigenous bacteria in the
maize spermosphere［J］. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, 2012, 28 ：391-396.
［13］ 邹媛媛 , 刘洋 , 王建华 , 等 . 种子微生物生态学研究进展［J］.
生态学报 , 2011, 31（10）：2906-2914.
［14］ 洪永聪 , 胡方平 , 陈庆河 , 等 . 从稻谷上分离、筛选用于拮抗
水稻白叶枯病的泛菌［J］. 福建农业科技 , 2011, 4 ：1-3.
［15］ 胡晓峰 , 郭晋云 , 张楠 , 等 . 一株溶磷抑病细菌的筛选及其溶
磷特性［J］. 中国农业科学 , 2010, 43（11）：2253-2260.
［16］ 岳喜庆 , 王桐 , 单提波 , 等 . 霍氏肠杆菌 WM1 产青霉素酶发
酵条件的研究［J］. 中国酿造 , 2010, 8 ：91-93.
（责任编辑 马鑫）