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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是
一种具有广谱抑菌活性的细菌，具有较强的次生代
谢产物产生能力，能抑制尖孢镰刀菌［1］等多种植物
病原真菌。解淀粉芽孢杆菌 C101 是中国热带农业科
学院环境与植物保护研究所微生物资源研究与利用
课题组从香蕉根际土壤中分离获得的拮抗镰刀菌的
菌株，对香蕉枯萎病等植物病害有明显的防治效果
（待发表），应用前景广阔。
收稿日期 ：2013-11-06
基金项目 ：国家公益性行业（农业）科研项目（200903049）
作者简介 ：梁昌聪，男，硕士，助理研究员，研究方向 ：生物农药 ；E-mail ：lcconghn@163.com
通讯作者 ：黄俊生，研究员，研究方向 ：植物保护和植物病理 ；E-mail ：h888111@126.com
响应面法优化解淀粉芽孢杆菌 C101 发酵培养基
梁昌聪 郭立佳 刘磊 张建华 杨腊英 王国芬 黄俊生
（中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室
海南省热带农业有害生物检测与控制重点实验室，海口 571101）
摘 要 ： 采用响应面法对解淀粉芽孢杆菌 C101 菌株产芽孢发酵培养基进行了优化。利用 Plackett-Burman 试验设计筛选出影
响产孢的 3 个主要因素 ：MnSO4、KH2PO4 和（NH4）2SO4。在此基础上运用最陡爬坡路径法逼近最大响应值区域，最后利用响应面
分析法确定主要因子之间的交互作用及最佳条件。结果表明，蔗糖 20 g/L，尿素 4.0 g/L，豆粕 4.0 g/L，KNO3 2.0 g/L，Na2HPO4 2.4 g/L，
KH2PO4 0.52 g/L，（NH4） 2SO4 0.55 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，FeSO4 0.005 0 g/L，MnSO4 0.005 4 g/L，C101 最大理论芽
孢含量为 14.67×108个/mL。经 3 次平行试验验证，实际平均芽孢含量与预测芽孢含量相近，比之前的芽孢含量提高了 188%。
关键词 ： 响应面法 解淀粉芽孢杆菌 芽孢 优化
Optimization of Fermentation Medium by Bacillus amyloliquefaciens
Strain C101 Using Response Surface Methodology
Liang Changcong Guo Lijia Liu Lei Zhang Jianhua Yang Laying Wang Guofen Huang Junsheng
（Environment and Plant Protection Institute，CATAS/ Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops，Ministry of Agriculture/
Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests，Haikou 571101）
Abstract: The fermentation medium components for spore content by Bacillus amyloliquefaciens strain C101 was optimized by response
surface methodology（RSM）. Firstly, three of the most significant influence factors were screened by the method of Plackett-Burman design as
MnSO4, KH2PO4 and（NH4）2SO4. The path of steepest ascent was applied to approach the optimal region of the three significant factors. Lastly,
the optimal concentration and correlations among three factors were identified by RSM. The optimal fermentation conditions were determined as
followed ：sucrose 20 g/L, urea 4.0 g/L, soybean meal 4.0 g/L, KNO3 2.0 g/L, Na2HPO4 2.4 g/L, KH2PO4 0.52 g/L, （NH4）2SO4 0.55 g/L, NaCl
1.0 g/L, MgSO4·7H2O 0.50 g/L, FeSO4 0.005 0 g/L, MnSO4 0.005 4 g/L. Under these conditions, the maximum theoretic spore number was
14.67×108 /mL. After three parallel verifications, the maximum theoretic value was consistent with mean value of verification test and the spore
number was increased by 188% compare to that before optimization.
Key words: Response surface methodology（RSM） Bacillus amyloliquefaciens Spore Optimization
目前国内外对解淀粉芽孢杆菌发酵的优化主要
集中在产抗菌脂肽［2-4］、α-淀粉酶［5］、蛋白酶［6］等
酶类物质，较少研究解淀粉芽孢杆菌数量发酵优化；
而研究此类菌数量发酵优化中，多数研究的目标在
于提高单位体积发酵液活菌数量［7，8］，对提高芽孢
数量研究较少。但从微生物菌剂的保存、使用角度
考虑，芽孢数量较活菌数量在生产上更具实际意义。
本研究采用 Minitab16 软件中的 Plackett-Burman
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期170
设计法、爬坡路径法和响应面分析方法（Response
surface methodology，RSM）相结合，对前期筛选获
得的一株解淀粉芽孢杆菌 C101 进行发酵培养基的优
化，以提高解淀粉芽孢杆菌 C101 的芽孢产量为目标，
旨在为该菌株的工业化生产提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 解淀粉芽孢杆菌 C101，从香蕉根
际土壤中分离获得，由本实验室保藏。
1.1.2 培养基 液体种子培养基（NA 液体培养基）：
牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5.0 g，补水至 1 000
mL，pH7.0。初始发酵培养基：蔗糖 20 g，尿素 4.0 g，
豆粕 4.0 g，KNO3 2.0 g，Na2HPO4 2.4 g，KH2PO4 1.5 g，
（NH4）2SO4 1.0 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，
FeSO4 0.005 0 g，MnSO4 0.002 0 g，补水至 1 000 mL，
pH7.0。
1.2 方法
1.2.1 发酵条件 250 mL 三角瓶装 50 mL 培养基，
初始 pH7.0，高压灭菌 20 min。以体积分数为 5% 接
种量转接液体菌种，置于 37℃，180 r/min 的摇床进
行发酵培养 ；48 h 后对发酵液中芽孢含量进行测定。
1.2.2 培 养 基 的 优 化 通 过 Minitab16 软 件 中
Plackett-Burman 设计法筛选出对影响芽孢产量的重
要因子，再通过爬坡路径法和响应面分析对重要因
子的水平进行优化。
1.2.2.1 Plackett-Burman 设计法 选取培养基的 15
个（4 个空项）组分，以试验次数为 20 的 Plackett-
Burman 设计法分析发酵培养基中影响芽孢产量的重
要因子。将初始发酵培养基中的 11 个组分作为影响
因素进行全面考察，选择 15 因子 2 水平的试验设计，
以 D、H、L、P 为空项以估计试验误差，每个因素
取高低两个水平（表 1）。
1.2.2.2 爬坡路径法 根据 Plackett-Burman 设计的
试验结果，安排爬坡试验。以适当的梯度改变重要
影响因子在发酵培养基中的质量浓度，其他组分取
低水平即初始发酵培养基的质量浓度，测定发酵液
芽孢量变化趋势，确定最适质量浓度范围。
1.2.2.3 响应面分析 运用 Box-Behnken 的中心组合
设计原理，以最陡爬坡试验得到的中心点对 Plackett-
Burman 试验确定的 3 个显著性影响因子各取 3 水平。
设计了 3 因素 3 水平共 15 个试验点进行响应面分析。
1.2.2.4 验证试验 用所得到的最佳培养条件进行 3
次平行试验，取平均值，以验证模型是否可靠，进
而得出最终优化结果。
1.2.3 芽孢计数方法 将待计数样品于 80℃水浴处
理 15 min 后，再采用平板菌落计数法计数，所得计
数结果即芽孢数［9］。
1.2.4 数据分析 每个处理包含 3 个独立重复，取 3
个重复实验的平均值。利用 Minitab16 软件进行 Pla-
ckett-Burman 试验和 Box-Behnken 设计响应面分析。
2 结果
2.1 Plackett-Burman试验设计结果分析
通过不同组合观察发酵液中芽孢的含量，试验
设计及结果见表 2。Plackett-Burman 设计的各因素水
平及效应评价（表 3）显示，从 P 值大小可以看出，
对发酵液含菌量具有显著影响的因子依次是 O>F>J，
即 MnSO4>KH2PO4>（NH4）2SO4， 确 定 这 3 个 因 素
作为下一步试验的关键因素。
2.2 最陡爬坡试验
Plackett-Burman 试验结果可知，MnSO4、KH2PO4
和（NH4）2SO4 是影响发酵液芽孢产量的重要因子，
MnSO4 是 正 效 应 因 子， 应 依 次 增 大 ；而 KH2PO4、
表 1 Plackett-Burman 试验设计因子与水平
符号 因子
水平（g/L）
-1 1
A 蔗糖 20 30
B 尿素 4.0 6.0
C 豆粕 5.0 7.5
D 空项
E Na2HPO4 1.6 2.4
F KH2PO4 1.0 1.5
G KNO3 2.0 3.0
H 空项
J （NH4）2SO4 1.0 1.5
K NaCl 1.0 1.5
L 空项
M MgSO4·7H2O 0.50 0.75
N FeSO4 0.0050 0.0075
O MnSO4 0.0020 0.0030
P 空项
2014年第8期 171梁昌聪等 ：响应面法优化解淀粉芽孢杆菌 C101 发酵培养基
（NH4） 2SO4 是负效应，应依次减小。对 3 种重要影
响因子进行爬坡路径试验，确定此 3 种因子的最适
质量浓度范围。结果（表 4）显示，随 MnSO4 浓度
的增加，KH2PO4、（NH4） 2SO4 浓度的减少，C101 发
酵液芽孢含量的变化趋势先上升后下降。当 MnSO4
0.005 5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、（NH4） 2SO4 0.5 g/L 时，
对应的发酵液芽孢含量达到最大值，为 3 因子的最
大响应值区域，以此为中心点进行响应面分析。
表 4 最陡爬坡路径试验设计及结果
实验号
MnSO4
（g/L）
KH2PO4
（g/L）
（NH4）2SO4
（g/L）
芽孢数
（×108 个 /mL）
1 0.0025 1.25 1.25 8.13
2 0.0035 1.00 1.00 10.11
3 0.0045 0.75 0.75 12.53
4 0.0055 0.50 0.50 14.51
5 0.0065 0.25 0.25 12.13
2.3 响应面设计结果分析
3 个重要因子的最适浓度范围确定之后，以
MnSO4 0.005 5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、（NH4） 2SO4 硫酸
铵 0.5 g/L 为中心点实施响应面分析，各自变量水平
见表 5。根据 Box-Behnken 中心组合设计原理，设计
3 因子 3 水平的响应面分析试验，中心点设置 3 次
重复，试验设计及结果分析见表 6 和表 7。
该二次模型多元相关性系数 R2= 0.989 2，表明仅
有 1.08% 的变异不能由此模型解释 ；回归模型 P 值
（prob>F）=0.000 表明模型是显著的，失拟项 P 值为
0.896，表明失拟不显著，模型没有失拟现象。模型
的线性、平方对芽孢数的影响是显著的，交互作用
对芽孢数的影响不显著。经回归拟合后，得到二次
表 2 Plackett-Burman 试验设计及结果
序号 A B C D E F G H J K L M N O P 芽孢数（108 个 /mL）
1 1 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 2.60
2 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 4.20
3 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 1 1 -1 5.70
4 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 1 1 2.80
5 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 0.80
6 1 1 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 3.80
7 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 2.10
8 -1 1 1 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 2.00
9 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 3.10
10 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 1 -1 4.35
11 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 6.75
12 1 -1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 6.95
13 -1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 6.80
14 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 5.10
15 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 1 3.25
16 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 1 4.90
17 1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 8.90
18 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1.70
19 -1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 4.10
20 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 1 2.50
表 3 Plackett-Burman 设计的各因素水平及效应评价
符号 因子 t Pr ＞ |t| 重要性排序
A 蔗糖 -0.44 0.684 6
B 尿素 0.01 0.994 11
C 豆粕 -0.68 0.532 4
E Na2HPO4 0.15 0.891 10
F KH2PO4 -2.83 0.047 2
G KNO3 0.67 0.541 5
J （NH4）2SO4 -1.97 0.120 3
K NaCl -0.18 0.868 9
M MgSO4·7H2O -0.27 0.802 8
N FeSO4 -0.39 0.716 7
O MnSO4 2.85 0.047 1
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期172
多项式方程：Y=-161.408+52212.6X1+45.5311X2+85.6
575X3-4622149X1*X1-44.9895X2*X2-62.9579X3*X3-
544.737X1*X2-3815.79X1*X3+7.66667X2*X3
根据上述拟合回归方程，通过软件分析得到相
应的响应面分析图和相应的等高图（图 1-图3）。图
1-A 显示，当固定（NH4） 2SO4 0.5 g/L 时，KH2PO4 从
0.2 g/L 增大至 0.6 g/L，MnSO4 从 0.004 5 g/L 增大至
0.006 5 g/L 的过程中，发酵液芽孢含量均呈现先增大
后减小的趋势，曲面的顶点即为芽孢含量最大值点。
图 1-B 显示，KH2PO4 与 MnSO4 两因子交互作用显
著。同理，图 2 和图 3 中的曲面分别反映了（NH4） 2SO4
和 MnSO4、（NH4） 2SO4 和 KH2PO4 的交互作用。
2.4 验证试验
利用 Minitab16 中的响应优化器解得最优值点为
MnSO4 0.005 4 g/L、KH2PO4 0.52 g/L、（NH4） 2SO4 0.55
g/L 时，预测的最大芽孢数为 14.67×108 个/mL。为
证实预测结果，在该浓度下进行重复摇瓶试验，重
复 3 次，结果分别为 15.01×108 个/mL、14.65×108
个/mL、14.51×108 个/mL，平均值为（14.69±0.17）×
108 个/mL 与预测值 14.67×108 个/mL 接近，二者的
良好拟合性证实了模型的有效性。优化后得到解淀
粉芽孢杆菌 C101 菌株的发酵培养基配方为 ：蔗糖
20 g，尿素 4.0 g，豆粕 4.0 g，KNO3 2.0 g，Na2HPO4
2.4 g，KH2PO4 0.52 g，（NH4）2SO4 0.55 g，NaCl
1.0 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，FeSO4 0.005 0 g，MnSO4
0.005 4 g，水 1 000 mL。
3 讨论
微生物发酵产品成功实现工业化的重要环节之
一是发酵培养基的优化。由于 Plackett-Burman（PB）
设计法可以从众多的考察因素中快速、有效的筛选
出最为重要的几个因素［10］，因此广泛应用于微生物
发酵培养基的优化筛选。响应面分析法（RSM）是
用来对受多个变量影响的响应值进行优化的一种回
归分析方法，由于所需试验次数少、周期短、能确
定多种因素间的交互作用，并可通过多元二次回归
方程精确预测最终产量，已被广泛应用于微生物发
酵领域［11］。目前，利用该方法对不同微生物的发酵
培养基进行优化，均不同程度地提高目标产物的产
量。唐志红等［12］利用响应面分析法优化 YDX-1 菌
株的发酵条件，纤维素酶活性提高了 81.97%。孙力
军等［3，4］用 RSM 对解淀粉芽孢杆菌 ES-2 液体发酵
表 7 Box-Behnken 设计回归分析
来源 自由度 Seq SS Adj SS Adj MS F P
回归模型 9 170.777 170.777 18.9752 50.70 0.000
线性 3 21.596 21.596 7.1986 19.24 0.004
X1 1 5.266 5.266 5.2656 14.07 0.013
X2 1 0.951 0.951 0.9507 2.54 0.172
X3 1 15.379 15.379 15.3793 41.10 0.001
平方 3 144.549 144.549 48.1829 128.75 0.000
X1*X1 1 63.995 78.883 78.8834 210.79 0.000
X2*X2 1 23.385 29.193 29.1931 78.01 0.000
X3*X3 1 57.169 57.169 57.1687 152.76 0.000
交互作用 3 4.633 4.633 1.5442 4.13 0.081
X1*X2 1 0.074 0.074 0.0742 0.20 0.675
X1*X3 1 3.640 3.640 3.6401 9.73 0.026
X2*X3 1 0.918 0.918 0.9184 2.45 0.178
残差误差 5 1.871 1.871 0.3742
失拟 3 0.413 0.413 0.1377 0.19 0.896
纯误差 2 1.458 1.458 0.7291
合计 14 172.648
R2=0.9892
表 5 Box-Behnken 设计各因子水平编码
符号 因子
水平（g/L）
-1 0 1
X1 MnSO4 0.0045 0.0055 0.0065
X2 KH2PO4 0.25 0.50 0.75
X3 （NH4）2SO4 0.25 0.50 0.75
表 6 Box-Behnken 设计及结果
实验号 X1 X2 X3 芽孢数（108 个 /mL）
1 -1 -1 0 7.39
2 1 -1 0 5.71
3 -1 1 0 8.64
4 1 1 0 6.42
5 -1 0 -1 4.17
6 1 0 -1 4.79
7 -1 0 1 8.95
8 1 0 1 5.75
9 0 -1 -1 6.67
10 0 1 -1 6.11
11 0 -1 1 8.39
12 0 1 1 9.74
13 0 0 0 13.82
14 0 0 0 14.17
15 0 0 0 15.44
2014年第8期 173梁昌聪等 ：响应面法优化解淀粉芽孢杆菌 C101 发酵培养基
抗菌脂肽的培养基及其主要影响因子进行了筛选，
发现 PDB 和 Landy 培养基都是 ES-2 菌株抗菌脂肽产
生和积累的较好的培养基。花玉鹏等［13］对 RSM 优
化发酵培养基进行了研究，结果表明，通过优化纳
他霉素产量提高了 32.9%-34.8%。陆继臣等［14］对
RSM 优化培养基进行了研究，表明通过优化后，生
防菌 CNY-04 的 OD600 较优化前提高了 30.9%。这表
明，响应面分析法是一种科学、合理的优化分析方法。
有效活菌数是衡量微生物菌剂品质的重要指标，
但是微生菌剂随着保存时间的延长，活菌数量不断
减少，有效活菌数降低，影响微生物制剂的使用效果。
芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆休
眠体，由于芽孢不进行新陈代谢活动，能经受多种
环境伤害，包括高盐、高渗、热、紫外线、多种溶
A
X2 KH2PO4 g/L 㣭ᆒᮠ 108 њ/mL 151050.8 0.6 0.4 0.2 0.00480.00540.00600.0066X1 MnSO 4 g/L
B
0.0045
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.0055 0.0065
<7.5
7.5-9.0
9.0-10.5
10.5-12.0
12.0-13.5
>13.5
0.00600.0050
X
2
K
H
2P
O
4 g/L 㣭ᆒᮠ 108њ/mL
X1 MnSO4 g/L
A
15
10
5
0.8
0.6 0.4
0.2
0.0048
0.0054
0.0060
0.0066㣭ᆒᮠ 108 њ/mL
X1
Mn
SO4
g/L
X3 NH4 2SO4 g/L
B
0.0045
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.0055 0.0065
<6
6-8
8-10
10-12
12-14
>14
0.00600.0050
X1 MnSO4 g/L X3 NH 4 2SO 4 g/L
㣭ᆒᮠ 108њ/mL
A
15
10
5
0.8
0.6
0.4
0.4
0.6
0.8
0.2 0.2 X2
KH
2P
O 4
g/L
X3 NH4 2SO4 g/L 㣭ᆒᮠ 108 њ/mL
B
0.3
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.5 0.7
<7.5
7.5-9.0
9.0-10.5
10.5-12.0
12.0-13.5
>13.5
0.60.4
X
2
K
H
2P
O
4 g/L
X3 NH4 2SO4 g/L
㣭ᆒᮠ 108њ/mL
图 3 X3（NH4） 2SO4 -X2 KH2PO4 交互作用对芽孢数影响的响应面图（A）和等高线图（B）
图 2 X3（NH4） 2SO4 -X1 MnSO4 交互作用对芽孢数影响的响应面图（A）和等高线图（B）
图 1 X2 KH2PO4 -X1 MnSO4 交互作用对芽孢数影响的响应面图（A）和等高线图（B）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期174
剂、酸、碱等试剂的处理［15］，因此芽孢能延长微生
物菌剂的保存期。目前报道的解淀粉芽孢杆菌发酵
的活菌数可达 109-1010 CFU/mL，但均未提及对芽孢
数量的提高，如车晓曦等［8］通过响应曲面优化解淀
粉芽孢杆菌的发酵产量的区间，活菌数量达 3.0×109
CFU/mL，车晓曦等［16］通过优化解淀粉芽孢杆菌发
酵培养基和培养条件，活菌数量达 46×109 CFU/mL，
张荣胜等［7］通过优化解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基
和培养条件，活菌数量达到 3.75×109 CFU/mL。本
研究在最佳培养基组合下，淀粉芽孢杆菌 C101 实际
芽孢含量达到 14.69×108个/mL，与理论最大芽孢含
量 14.67×108个/mL 接近，说明运用响应面法优化淀
粉芽孢杆菌 C101 液体发酵芽孢含量是合理可靠的。
经优化，芽孢含量比优化前提高了 188%。
本试验通过对解淀粉芽胞杆菌 C101 发酵培养
基的优化为其高产发酵芽孢工艺奠定了基础，在实
际发酵过程中该发酵参数有待于进一步验证。
4 结论
本研究通过 Plackett-Burman 设计，快速有效地
从 11 个影响解淀粉芽孢杆菌 C101 产芽孢的因素中
筛选出 3 个显著性影响因素 ：MnSO4、（NH4） 2SO4 和
KH2PO4，然后利用最陡爬坡法逼近最大响应值区域，
并用 Box-Behnken 设计得出最佳培养基组合 ：蔗糖
20 g，尿素 4.0 g，豆粕 4.0g，KNO3 2.0 g，Na2HPO4
2.4 g，KH2PO4 0.52 g，（NH4）2SO4 0.55 g，NaCl 1.0 g，
MgSO4·7H2O 0.50 g，FeSO4 0.005 0 g，MnSO4 0.005 4 g，
水 1 000 mL。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）