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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):153-158
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是
一种能产生杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal prote-
ins，ICPs）的革兰氏阳性细菌［1，2］，ICPs 主要由 cry
基因和 cyt 基因编码，并具有广谱的杀虫活性［3］，
且一种晶体蛋白可以对一种或多种害虫具有杀虫活
性［4］。Bt 杀虫剂有毒力高、对人畜与天敌安全、不
污染环境等优点［5，6］。目前，全世界几十个国家已
广泛使用 Bt 制剂，用于农业害虫的生物防治［7］。
长期以来由真菌引起的植物病害十分普遍且日
趋严重，给农业生产带来巨大的损失。其中由镰孢
菌属（Fusarium）真菌引起的马铃薯干腐病尤为常见，
已严重影响马铃薯的生产。马铃薯干腐病是马铃薯
储藏期的主要病害之一［8］，据报道，每年因马铃薯
镰孢菌干腐病导致的产量损失可达 6%-25%，窖贮
损失率高达 60%，该病害已成为马铃薯产业进一步
发展的瓶颈问题［9］。为了拓展 Bt 在生防领域的应用
范围，国内外早已开始对 Bt 抑制 Fusarium 进行研
究。2008 年韩苗苗等［10］发现 Bt519-1 菌株对禾谷镰
收稿日期 ：2014-12-15
基金项目 ：转基因生物新品种培育科技重大专项（2014ZX0800913B-002），国家基础科学人才培养基金资助项目（J1210069），国家高技术
研究发展计划课题（2011AA10A203），国家自然科学基金项目（31401812），黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12521021）
作者简介 ：周国旺，男，硕士，研究方向 ：生物防治微生物功能基因的发掘、研究和利用 ；E-mail ：1449717662@163.com
通讯作者 ：高继国，男，博士生导师，研究方向 ：生物大分子的分离纯化，苏云金芽胞杆菌抗性机理、生物安全性 ；
E-mail ：gaojiguo1961@hotmail.com
苏云金芽胞杆菌 LTS290 菌株抑制镰孢菌的作用
周国旺  李玉红  张圆  李海涛  刘荣梅  高继国
（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）
摘 要 ： 旨在扩大苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的生防范围，通过对 BtLTS290 菌株的对峙培养和菌株无菌发
酵液对镰孢菌的抑制作用进行研究。结果表明，BtLTS290 菌株可抑制 6 种马铃薯致病镰孢菌的生长，并且 BtLTS290 无菌发酵液的
抑菌效果显著。抑菌物质对温度不敏感，经过 121℃处理 20 min 后仍然具有抑菌活性。在 pH3-11 范围内存放 12 h 后，抑菌活性
变幅不大，并且用蛋白酶 K 处理后其抑菌活性依然存在。实验证明苏云金芽胞杆菌 BtLTS290 是一株可以高效抑制马铃薯致病镰孢
菌的生防菌株。
关键词 ： 苏云金芽胞杆菌 ；马铃薯干腐病 ；镰孢菌 ；抑菌活性 ；生防菌株
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.022
A Study of Bacillus thuringiensis Strain LTS290 Inhibiting Fusarium
Zhou Guowang Li Yuhong Zhang Yuan Li Haitao Liu Rongmei Gao Jiguo
（College of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）
Abstract ： In oder to expand the biocontrol scope of Bacillus thuringiensis（Bt）, the inhibiting effects of confront culture and sterile
fermented liquid of strain BtLTS290 on the growth of Fusarium were investigated. Results showed that BtLTS290 inhibited the growth of 6 strains
of Fusarium, and the sterile fermented liquid of Bt had solid antibacterial effect. The fungistatic substances were not sensitive to temperature, and
it still had the bacteriostatic activity for 20 min under 121℃. After storing 12 h while pH varied from 3 to 11, the range of antibacterial activity
was not significantly changed. The bacteriostatic activity still existed after being treated with proteinase K. Conclusively, the work convinced that
the BtLTS290 was a biocontrol strain that had efficient antagonistic activity against Fusarium of causing dry rot of potato.
Key words ： Bacillus thuringiensis ；dry rot of potato ；Fusarium ；bacteriostatic activity ；biocontrol strain
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8154
孢菌（Fusarium graminearum）和尖孢镰孢菌（Fus-
arium oxysporum） 具 有 抑 制 作 用。2013 年 Akram
等［11］发现 Bt199 菌株可以诱导多种方式抵御尖孢
镰孢菌（Fusarium oxysporum）。2014 年 Rocha 等［12］
证明苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种（B. thuringiensis
subsp. kurstaki） 菌 株 对 轮 状 镰 孢 菌（Fusarium
verticillioides）具有很好的抑制作用。
针对大多数苏云金芽胞杆菌对真菌抑制作用不
高的弱势，本实验室经筛选获得一株可以高效抑制
镰孢菌的菌株 BtLTS290，本研究首次对该菌株在抑
制镰孢菌生长及抑菌物质理化性质等方面进行测试
分析，旨在为 Bt 在抑制镰孢菌作用上的进一步研究
及应用提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供 试 菌 株 苏 云 金 芽 胞 杆 菌 BtLTS290 菌
株，由本实验室分离自从吉林采集的土壤样品。供
试病原真菌 ：从黑龙江各地区分离的马铃薯干腐
病 的 6 种 致 病 菌， 腐 皮 镰 孢 菌［Fusarium solani
（Mart.）］、 拟 丝 孢 镰 孢 菌（Fusarium trichothecioides
Wollenw）、燕麦镰孢菌［Fusarium avenaceum（Corda
& Fr.）Sacc］、接骨木镰孢菌（Fusarium sambucinum
Fuckel）、茄病镰孢菌（Fusarium solani）和拟枝孢镰
孢菌（Fusarium sporotrioides Sherb），由东北农业大
学生命科学学院植物教研室李凤兰老师馈赠。
1.1.2 培养基 液体 LB 培养基 ：胰蛋白胨 10 g、酵
母提取物 5 g、氯化钠 10 g、蒸馏水 1 L，pH7.0。
固体 LB 培养基 ：在液体 LB 培养基中加 13 g/L
的琼脂。固体 1/2LB 培养基 ：胰蛋白胨 10 g、酵母
提取物 5 g、氯化钠 10 g、琼脂 13 g、蒸馏水 1 L，
pH7.0。
PDA 培养基 ：马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂
18 g、蒸馏水 1 L，pH7.0。发酵培养基 ：牛肉膏 5 g、
蛋白胨 10 g、氯化钠 5 g、蒸馏水 1 L，pH7.2。
1.2 方法
1.2.1 BtLTS290 菌株晶体形态观察 方法及具体步
骤参照文献［13］。
1.2.2 菌落对峙法测定抑真菌生物活性 在内径 9
cm 的 PDA 培养皿距中心 2.5 cm 的 4 个对称点接种
活化的 Bt 菌株，培养 24 h 后，分别在培养皿中央
接种直径 8 mm 的马铃薯干腐病菌菌饼，重复 3 次，
于 25℃恒温培养箱中培养 3-4 d 后，观察并测量抑
菌效果，计算 R 值，即抑菌圈直径与菌落直径之比。
同时用解剖针分别挑取正常生长的真菌菌丝和被抑
制的真菌菌丝于载玻片上，载玻片上预先滴一滴无
菌蒸馏水，然后轻轻盖好盖玻片，尽量控制气泡产
生，把制好的玻璃片放在高倍显微镜下观察。
1.2.3 Bt 菌株无菌发酵液的制备 将冻存管中储存
的 BtLTS290 在 LB 平板上划线活化［14］，30℃培养
12 h 后，挑取单菌落接入装有 5 mL LB 液体培养基
的试管中，30℃、180 r/min 下培养 12 h。取 1 mL 活
化菌液接入装有 100 mL 发酵培养基的 500 mL 三角
瓶中，30℃、180 r/min 条件下振荡培养 3 d。同时取
1 mL 液体 LB 培养基接入装有 100 mL 发酵培养基的
500 mL 三角瓶中作为对照，30℃、180 r/min 条件下
振荡培养 3 d。之后，将发酵菌液在 4℃、8 000 r/min
下离心 20 min，收集上清液经细菌滤器（滤膜孔径
0.25 μm）过滤除菌，即得到无菌发酵液，4℃保存
备用。
1.2.4 Bt 菌株无菌发酵液抑菌活性的测定 采用菌
丝生长速率法［15］，以供试的 6 种马铃薯干腐病致
病菌为检测菌，测定 Bt 菌株发酵液中活性代谢产物
的抑菌活性。将 BtLTS290 菌株的无菌发酵液 1 mL
与 9 mL 冷却到 45℃左右的 PDA 培养液混匀，倒入
无菌的培养皿中制成培养基平板。待凝固后将供试
病原真菌菌饼（8 mm）倒置放在平板中央，每处理
3 次重复，以 9 mL PDA 培养液和 1 mL 未接菌的发
酵培养基作为对照。将上述处理在 25℃下培养 4 d
后，用十字交叉法测量供试菌菌落生长直径（mm），
计算菌丝生长抑制率。计算公式 ：菌丝生长抑制率
（%）=（对照菌落直径 - 处理后菌落直径）/（对照
菌落直径 - 8 mm）×100%。
1.2.5 Bt 菌株抑菌活性物质产生时间及稳定性测定
1.2.5.1 Bt 菌发酵时间 分别设 1.0、1.5、2.0、2.5、
3.0、3.5、4.0、4.5 和 5.0 d，共 9 个采样点，测定不
同发酵时间发酵液的抑菌活性。
1.2.5.2 热稳定性 取无菌发酵液分装离心管中，分
别置于水浴 40℃、60℃、80℃、100℃、121℃加热
20 min，待自然冷却后，测定各处理液的抑菌活性。
2015,31(8) 155周国旺等：苏云金芽胞杆菌 LTS290 菌株抑制镰孢菌的作用
1.2.5.3 pH 稳定性 取无菌发酵液 50 mL，分别用
1 mol/L 的 HCl 和 1 mol/L 的 NaOH 处理将其 pH 值分
别调至 3、5、7、9、10 和 11，并于 4℃冰箱中过夜，
然后调回原 pH 约 7.0 左右，测定各处理液的抑菌
活性。
1.2.5.4 抗蛋白酶 K 稳定性 取离心管 3 支，编号
为 1、2、3，1 号和 2 号管中各装入无菌发酵液 10
mL，3 号管中加入未接菌的发酵液 10 mL，1 号和 3
号管中分别加入蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL）50 μL，
充分混匀后，置于 37℃下 1 h，然后分别测定各处
理液的抑菌活性。以上实验均重复 3 次，以燕麦镰
孢菌作为指示菌，以未接菌的发酵液作对照，采用
菌丝生长速率法测定各处理液的抑菌活性。
2 结果
2.1 晶体形态观察
Bt 菌株 LTS290 产生的晶体形态，光学显微镜
（图 1-A）下箭头所示，从左到右依次为球形晶体和
芽胞 ；电镜（图 1-B）中箭头所指，从左到右依次
为球形晶体和芽胞。
长抑制如图 3 所示，通过计算，结果表明 Bt LTS290
无菌发酵液对燕麦镰孢菌和接骨木镰孢菌菌丝生长
抑制率分别为 91.38% 和 91.76%，而对其他供试镰
孢菌的菌丝生长抑制率在 73%-87% 之间。
2.4 抑菌时间及稳定性分析
2.4.1 发酵液中抑菌活性代谢产物产生时间 图 4
表明，菌株 Bt LTS290 发酵 1 d 时未产生抑菌物质，
在发酵 3 d 时抑菌物质积累最多，对燕麦镰刀菌菌
丝生长抑制率最高，发酵时间 3-4 d 内对燕麦镰刀
菌菌丝生长抑制率未见明显变化，但 4.5 d 后发酵液
的抑菌活性开始下降。
2.4.2 热稳定性 对菌株 Bt LTS290 无菌发酵液的
热耐受性实验结果表明，当发酵液的处理温度为
A B
图 1 Bt 野生菌株 LTS290 的光学显微镜图（A）和电镜晶
体图（B）
2.2 菌落对峙法测定抑真菌生物活性
Bt LTS290 菌 株 对 6 种 镰 孢 菌 都 有 抑 制 作 用，
仅 以 经 燕 麦 镰 孢 菌 为 例， 如 图 2-A 所 示， 计 算
BtLTS290 菌株对燕麦镰孢菌的抑制率 R 值，约为
0.3。通过对燕麦镰孢菌菌丝显微结构进行观察，结
果（图 2-B，C）显示，正常生长的菌丝长，且呈直
线型生长，而被抑制的菌丝短，并且变得弯曲，菌
丝被抑制效果显著。
2.3 Bt菌株无菌发酵液抑菌活性的测定
Bt LTS290 无菌发酵液对 6 种镰刀菌菌丝的生
A
B
C
1 1
11
2
A ：BtLTS290 菌株对燕麦镰孢菌的抑制作用（1 为 BtLTS290，2 为燕麦镰孢
菌）；B ：光学显微镜下正常生长的菌丝形态 ；C ：光学显微镜下被抑制的菌
丝形态
图 2 BtLTS290 菌株对黄色镰刀菌的抑制作用
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8156
40-100℃时处理 20 min 时，发酵液上清仍然具有抑
菌活性，并且抑菌活性基本不变，仍维持在 90% 左
右。经过 121℃处理 20 min 后仍然具有抑菌活性，
但抑菌活性明显降低。
2.4.3 pH 稳定性 Bt LTS290 无菌发酵液经不同 pH
处理后，其稳定性结果（图 5）表明，BtLTS290 发
酵液在 pH3-11 范围内均有抑菌活性，并且变化幅
度不大，pH 为 7 时抑菌活性最高。
2.4.4 抗蛋白酶 K 的稳定性 1 号和 2 号处理的无
菌发酵液对燕麦镰孢菌都具有抑菌活性，并且测定
数值非常接近。而 3 号未接菌的发酵液对燕麦镰孢
菌没有抑制作用，说明 BtLTS290 菌株发酵液中的活
1 2
1 2
1 2
1 2
1 2
1 2
A
C
E
B
D
F
A ：腐皮镰孢菌 ；B ：接骨木镰孢菌 ；C ：拟丝孢镰孢菌 ；D ：拟枝孢镰孢菌 ；E ：茄病镰孢菌 ；F ：燕麦镰
刀菌 ；1 ：对照（镰孢菌菌饼 +9 mL PDA 培养液 +1 mL 未接菌的发酵培养液）；2 ：镰孢菌菌饼 +9 mL PDA
培养液 +1 mL Bt LTS290 的无菌发酵培养液
图 3 Bt LTS290 无菌发酵液对马铃薯干腐病 6 种致病镰孢菌的抑菌作用
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
60
65
70
75
80
85
90
95
100ᣁࡦ⦷/%
pH
图 4 BtLTS290 不同发酵时间对燕麦镰刀菌的抑菌活性
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
0
20
40
60
80
100ᣁࡦ⦷/% ਁ䞥ᰦ䰤/d
图 5 Bt LTS290 产抑菌物质在不同 pH 值下的稳定性
2015,31(8) 157周国旺等：苏云金芽胞杆菌 LTS290 菌株抑制镰孢菌的作用
性代谢产物对蛋白酶 K 具有较强的稳定性。
3 讨论
苏云金芽胞杆菌作为一种重要的生防细菌，主
要用于农业虫害的防治。但随着农业和环境可持续
发展的需要，筛选出多功能 Bt 菌株变得尤为重要。
关于苏云金芽胞杆菌抑真菌的报道非常多，但
对于其抑真菌机制尚无明确报道［16］。本研究证明
BtLTS290 菌株对马铃薯干腐病镰孢菌具有一定的抑
制作用，由于 PDA 培养基以及培养的温度不利于
BtLTS290 的生长，抑菌圈不是十分明显，但通过显
微镜可以明显观察到镰孢菌菌丝的生长被严重抑制。
由于未进行更微观的显微结构观察，如孢子的萌发
是否被抑制，因此有必要参照一些文献［10，11］，对孢
子的萌发程度进行检测。但 BtLTS290 的无菌发酵液
对镰孢菌菌丝的抑制率明显，说明无菌发酵液中的
抑菌物质对镰孢菌有很强的抑制作用。已报道的芽
胞杆菌抑菌物质种类很多，有细菌素、脂肽、小分
子蛋白及几丁质酶等。目前关于几丁质酶的报道较
多，几丁质酶不但对真菌的生长有抑制作用，而且
可以协同 Cry 毒素进行杀虫［17-19］。而对于 BtLTS290
无菌发酵液中的抑菌物质是什么，我们并不十分清
楚，但可以肯定的是此物质具有良好的热稳定性和
pH 稳定性。因此，对于抑菌作用来源于何种物质仍
需进一步深入研究。除此之外，对于 BtLTS290 菌株
中何种 cry 基因编码了晶体蛋白，可参考一些新基
因的克隆方法进行鉴定［20，21］。
4 结论
由本实验室分离得到的野生菌株 BtLTS290 对
马铃薯干腐病致病镰孢菌具有较好的抑制作用，尤
其对菌丝生长的抑制作用明显。以腐皮镰孢菌、拟
丝孢镰孢菌、燕麦镰孢菌、接骨木镰孢菌、茄病镰
孢菌和拟枝孢镰孢菌作为指示菌，测得 BtLTS290
菌株的无菌发酵液对这 6 种马铃薯干腐病致病镰孢
菌的菌丝生长抑制率均在 73%-91% 之间。对菌株
BtLTS290 所产的抑菌活性物质的理化性质进行研究
发现，其抑菌活性物质对温度不敏感，在 pH3-11
内抑菌活性变化不大，并且对蛋白酶 K 不敏感，说
明抑菌活性物质具有良好的稳定性。
参 考 文 献
［1］Schnepf E, Crickmore N, Van Rie J, et al. Bacillus thuringiensis and
its pesticidal crystal proteins［J］. Microbiol Mol Biol Rev, 1998,
62（3）：775-806.
［2］ 中国科学院微生物研究所翻译 . 伯杰氏细菌鉴定手册［M］.
北京 ：科学出版社 , 1984.
［3］李玉红 , 李海涛 , 高继国 , 等 . 苏云金芽胞杆菌 cry2Ab、cry9Ea
基因的表达及活性分析［J］. 生物技术通报 , 2012, 3（10）：
100-105.
［4］de Maagd RA, Bravo A, Crickmore N. How Bacillus thuringiensishas
evolved specific toxins to colonize the insect world［J］. Trends
Genet, 2001, 17（4）：193-199.
［5］Marroquin LD, Elyassnia D, Griffitt JS. Bacillus thuringiensis
（Bt）toxin susceptibility an disolation of resistance mutants in the
nematode Caenorhabditis elegans［J］. Genetics, 2000, 155（4）：
1693-1699.
［6］Garcia-robles I, Sanchchez J, Gruppe A. Mode of action of Bacillus
thuringiensis pS86Q3 strain in hymenopteran forest pests［J］.
Insect Biochem Mol Biol, 2001, 31（9）：849-856.
［7］魏艳敏 . 生物农药及其应用技术问答［M］. 北京 ：中国农业
大学出版社 , 2007 ：68-71.
［8］周全 , 张廷义 , 杜玺 . 马铃薯块茎干腐病发生危害及防治［J］.
植物保护 , 2006, 32（2）：103-105.
［9］赵生山 , 牛乐华 . 马铃薯贮藏期病害调查及药剂防治研究［J］.
农业科技与信息 , 2008, 11 ：44-46.
［10］韩苗苗 , 肖亮 , 蔡峻 , 等 . 一株抑真菌、对甜菜夜蛾高效的
苏云金芽胞杆菌菌株［J］. 微生物学通报 , 2008, 35（11）：
1750-1754.
［11］Waheed A, Asrar M, Asmat AJ. Bacillus thuringiensis strain
199 can induce systemic resistance in tomato against Fusarium
wilt［J］. Eur J Microbiol Immunol（Bp）, 2013, 3（4）：275-
280.
［12］Rocha LO, Tralamazza SM, Reis GM, et al. Multi-Method approach
for characterizing the interaction between Fusarium verticillioides
and Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki［J］. PLoS ONE, 2014,
9（8）：e92189.
［13］何宝楠 , 李海涛 , 刘荣梅 , 等 . 苏云金芽胞杆菌 V4 菌株 cry 杀
虫基因的鉴定、表达及杀虫活性分析［J］. 生物技术通报 ,
2014（9）：125-130.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8158
［14］周昕 , 秦玉花 , 刘伟伟 . 《微生物与免疫学》实验教学的实践
与思考［J］. 实验科学与技术 , 2012, S2 ：245-246.
［15］王国平 , 郑必强 , 章初龙 , 等 . 内生真菌 ZJUF0986 代谢的抗
菌活性物质特性［J］. 植物保护学报 , 2008, 35（2）：127-
131.
［16］Hyakumachi M, Nishimura M, Arakawa T, et al. Bacillus
thuringiensis suppresses bacterial wilt disease caused by Ralstonia
solanacearum with systemic induction of defense-related gene
expression in tomato［J］. Microbes Environ, 2013, 28（1）：
128-134.
［17］祁红兵 , 刘铭 , 李红敬 . 产几丁质酶苏云金芽孢杆菌的筛选
及其对甜菜夜蛾高毒菌株的增效活性［J］. 江苏农业科学 ,
2003（6）：61-63.
［18］Thamthiankul S, Moar WJ, Miller ME, et al. Improving the
insecticidal activity of Bacillus thuringiensis subsp. aizawai against
Spodoptera exigua by chromosomal expression of a chitinase
gene［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 65（2）：183-192.
［19］刘东 , 陈月华 , 蔡峻 , 等 . 苏云金芽胞杆菌几丁质酶 B 特性及
其杀虫抑真菌的作用［J］. 微生物学报 , 2009, 49（2）：180-
185.
［20］Noguera PA, Ibarra JE. Detection of new cry genes of Bacillus
thuringiensis by use of a novel PCR primer system［J］. Appl
Environ Microbiol, 2010, 76（18）：6150-6155.
［21］李长友 , 李国勋 , 张杰 , 等 . 苏云金芽胞杆菌菌株 B-Hm-16 的
生物学特性及 cry 基因型鉴定［J］. 青岛农业大学学报 ：自
然科学版 , 2007, 24（1）：1-4.
（责任编辑 马鑫）