全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（２）： ２０１ － ２０６ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０２􀆰 ００４
基金项目：国家重大转基因专项（２０１１ＺＸ０８００９⁃００３⁃００１⁃００９）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｌｉｐｉｎｇ６５７５＠ １６３． ｃｏｍ， ａｐｚｈ０６０２＠ ｇｍａｉｌ． ｃｏｍ， Ｔｅｌ： ０２８⁃８６２９０９０３
收稿日期： ２０１４ － １０ － １０
苏云金芽胞杆菌 ｃｒｙ１Ｉｅ新基因的克隆、
表达与生物活性测定
余宗兰１，２ 　 贺利业１，２ 　 龚　 莉１，２ 　 黄刚辉１，２ 　 李　 平１，２∗　 郑爱萍１，２∗
（１．四川农业大学水稻研究所， 温江 ６１１１３０； ２．四川农业大学， 西南作物基因资源与遗传改良
教育部重点实验室， 雅安 ６２５０１４）
摘要： 为获得新的鳞翅目害虫杀虫基因，根据已知 ｃｒｙ１Ｉ 类基因编码区设计简并引物，采用直接克
隆法，以苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ）菌株 ＢＮ２３⁃５ 质粒 ＤＮＡ为模板进行扩增，并对得
到的基因进行鉴定和分析。 结果表明：克隆得到一个完整的 ｃｒｙ１Ｉｅ基因，全长 ２ １６０ ｂｐ，由 ７１９ 个氨
基酸组成，该氨基酸序列与已知的 ４ 种 Ｃｒｙ１Ｉｅ 蛋白不同，与 Ｃｒｙ１Ｉｅ２ 和 Ｃｒｙ１Ｉｅ３ 的氨基酸序列同源
性最高，为 ９５􀆰 ４％ ，被国际 Ｂｔ杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为 Ｃｒｙ１Ｉｅ５（登录号为 ＫＪ７１０６４６）。
将该基因插入表达载体 ｐＥＴ⁃２８ａ，转化大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３），ＩＰＴＧ 低温诱导成功表达，ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ
电泳验证其大小为 ８１ ｋＤ，与预测的分子量相符合。 生物活性测定表明，Ｃｒｙ１Ｉｅ５ 表达的包涵体蛋
白对小菜蛾和亚洲玉米螟具有杀虫活性，ＬＣ５０分别为 ０􀆰 ４３ μｇ ／ ｍＬ 和 ４８􀆰 ３９ μｇ ／ ｍＬ；对棉铃虫的致
死率不高，但能明显抑制其生长；对甜菜夜蛾没有杀虫活性。
关键词： 苏云金芽胞杆菌； ｃｒｙ１Ｉｅ５ 基因； 鳞翅目害虫； 克隆
Ｃｌｏｎｉｎｇ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｃｒｙ１Ｉｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｔｒａｉｎ
Ｙｕ Ｚｏｎｇｌａｎ１，２ 　 Ｈｅ Ｌｉｙｅ１，２ 　 Ｇｏｎｇ Ｌｉ１，２ 　 Ｈｕａｎｇ Ｇａｎｇｈｕｉ１，２ 　 Ｌｉ Ｐｉｎｇ１，２∗ 　 Ｚｈｅｎｇ Ａｉｐｉｎｇ１，２∗
（１． Ｒｉｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｅｎｊｉａｎｇ ６１１１３０， Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｃｒｏｐ Ｇｅｎｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ＆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａ’ａｎ ６２５０１４， Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｎｏｖｅｌ ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｇｅｎｅｓ， ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙ１Ｉ⁃ｔｙｐｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ （Ｂｔ） ｓｔｒａｉｎｓ ＢＮ２３⁃５． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＮＣＢＩ
ｏｐｅｎ ｃｒｙ１Ｉ⁃ｔｙｐｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｒｅａ， ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ． Ａ ｆｕｌｌ⁃ｌｅｎｇｔｈ ｃｒｙ１Ｉｅ ｇｅｎｅ
ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＢＮ２３⁃５ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ． Ｉｔ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ａｎ ｏｐｅｎ
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ ２ １６０ ｂｐ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ７１９ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ Ｃｒｙ１Ｉｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ， ｉｔ ｓｈａｒｅｄ ９５􀆰 ４％ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ Ｃｒｙ１Ｉｅ２ ａｎｄ Ｃｒｙ１Ｉｅ３． Ｉｔ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ａｓ Ｃｒｙ１Ｉｅ５
ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒ ｗａｓ ＫＪ７１０６４６． Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ２８ａ， ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｃｒｙ１Ｉｅ５ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ８１
ｋＤ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｓｔｒａｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ． Ｔｈｅ ｂｉｏａｓｓａｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
Ｃｒｙ１Ｉｅ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｔｈｅ ｌａｒｖａｅ ｏｆ Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ ｗｉｔｈ ａ ＬＣ５０
ｖａｌｕｅ ｏｆ ０􀆰 ４３ μｇ ／ ｍＬ ａｎｄ ４８􀆰 ３９ μｇ ／ ｍＬ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ａｎｄ ｈａｄ ｌｏｗ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ， ｂｕｔ
ｃｏｕｌｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｉｔ； ｉｔ ｈａｄ ｎｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｂｅｅｔ ａｒｍｙｗｏｒｍ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ； ｃｒｙ１Ｉｅ５； Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｐｅｓｔ； ｃｌｏｎｅ
　 　 苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ）为革
兰氏阳性细菌（Ｓｃｈｎｅｐｆ ｅｔ ａｌ． ，１９９８），主要分布在土
壤、尘埃、淤泥、虫尸、污水等介质中。 Ｂｔ 可以在形
成芽孢的同时产生晶体，晶体蛋白（ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｃｒｙｓ⁃
ｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＩＣＰｓ）主要由 ｃｒｙ和 ｃｙｔ基因编码，具有特
异的杀虫活性，如农业害虫玉米螟、棉铃虫 Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒ⁃
ｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ、线虫以及卫生害虫蚊子等（刘石泉等，
２００８；Ｓｗｉｅｃｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． ，２００８）。 另外，Ｂｔ 具有高效专
一、无毒、不污染环境等特点，因此被作为微生物杀
虫剂广泛应用于农林、果蔬以及卫生害虫的防治，近
年来也大量推广应用在转基因植物中，并取得了良
好的生物防治效果（Ｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ． ，１９９５；Ｃａｏ ｅｔ ａｌ． ，
１９９９；Ｍｉｓｚｔａｌ ｅｔ ａｌ． ，２００４）。
目前，Ｃｒｙ１Ａ类蛋白是应用最广泛的 Ｂｔ 蛋白，
主要有 Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｈ 等（Ａｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ． ，
２００３；Ｃｈｉｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． ，２００３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ，２００８）。
Ｃｒｙ１Ｉ类蛋白在结构和杀虫机制上不同于 Ｃｒｙ１Ａ 类
蛋白，它们的表达产物没有交互抗性（Ｔａｂａｓｈｎｉｋ ｅｔ
ａｌ． ，２００２）。 ｃｒｙ１Ｉ类基因是一类十分特殊的 ｃｒｙ１ 类
基因，其编码蛋白只有 ８０ ｋＤ，而大多数的 Ｃｒｙ１ 类蛋
白大小为 １３０ ｋＤ（Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ． ，１９９８）。 目前已
公布的 ｃｒｙ１Ｉ 类基因包括 ７ 类（ｃｒｙ１Ｉａ、ｃｒｙ１Ｉｂ、ｃｒｙ１Ｉｃ、
ｃｒｙ１Ｉｄ、ｃｒｙ１Ｉｅ、ｃｒｙ１Ｉｆ和 ｃｒｙ１Ｉｇ），共 ５８ 种，其中 ｃｒｙ１Ｉａ
类最多，共 ３５ 种。 Ｃｒｙ１Ｉ 类蛋白的特点是具有较强
的杀虫活性和相对较广的杀虫谱，目前为止所发现
的 ｃｒｙ１Ｉ基因表达的蛋白主要对鳞翅目夜蛾科、卷叶
蛾科、菜蛾科和鞘翅目叶甲科的害虫有效（Ｓｅｋａｒ ｅｔ
ａｌ． ，１９９７； Ｓｅｌｖａｐａｎｄｉｙａｎ ｅｔ ａｌ． ，１９９８； Ｓａｕｋａ ｅｔ ａｌ． ，
２００７）。 其中，Ｃｒｙ１Ｉｅ 类蛋白对玉米螟、棉铃虫和小
菜蛾 Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ有效，并已经转入烟草和玉米
中，转基因植株主要对玉米螟和棉铃虫杀虫效果较
好（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． ，２００４；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ，２０１３），但目前转入
植株中抗小菜蛾的 ｃｒｙ１Ｉｅ基因还未见报道。
小菜蛾是全球最具破坏性的十字花科鳞翅目类
害虫（Ｙｉ ｅｔ ａｌ． ，２０１３），且是第 １ 种在户外被发现对
Ｂｔ蛋白产生抗性的物种，是全世界最难防治的害虫
之一（Ｓａｒｆｒａｚ ＆ Ｋｅｄｄｉｅ，２００５）。 因此，ｃｒｙ１Ｉ 类基因
的研究具有尤为重要的理论意义和实用价值，并将
为解决 Ｂｔ毒素杀虫谱窄、害虫抗药性产生等问题提
供新的基因资源。 Ｂｔ菌株 ＢＮ２３⁃５ 是本实验室从四
川成都土壤中分离得到的 １ 株对鳞翅目害虫有高活
性的野生型菌株（未发表）。 为获得新的鳞翅目害
虫杀虫基因，本研究以 ＢＮ２３⁃５ 菌株质粒为模板，根
据已知 ｃｒｙ１Ｉ类基因编码区设计简并引物，采用直接
克隆法克隆得到新的 ｃｒｙ１Ｉｅ 全长基因，并进一步测
定该基因表达产物对小菜蛾、亚洲玉米螟 Ｏｓｔｒｉｎｉａ
ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、棉铃虫及甜菜夜蛾 Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ 的生
物活性，以期为该基因的后期研究和开发利用提供
基础依据。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试菌株与质粒：野生型苏云金芽胞杆菌菌株
ＢＮ２３⁃５、Ｃｒｙ１Ａｃ⁃ＢＬ２１ 和质粒 ｐＥＴ⁃２８ａ（具卡那霉素
抗性）为本实验室保存。 Ｔｒａｎｓ１⁃Ｔ１ 化学感受态细
胞、大肠杆菌 ＤＨ５α 化学感受态细胞、ｐＥＡＳＹＴＭ⁃Ｔ１
克隆载体（具氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性）购自
中国全式金生物技术有限公司；大肠杆菌 ＢＬ２１
（ＤＥ３）化学感受态细胞购自中国宝生物工程有限
公司。
供试昆虫及培养基：小菜蛾、亚洲玉米螟、棉铃
虫和甜菜夜蛾均为本实验室饲养的标准化试虫。 小
菜蛾使用新鲜白菜叶饲养，其余试虫均于 ２５℃光照
培养箱中使用人工饲料饲养。 ＬＢ（Ｌｕｒｉａ⁃Ｂｅｒｔａｎｉ）培
养基：胰蛋白胨 １􀆰 ０％ 、酵母提取物 ０􀆰 ５％ 、氯化钠
１􀆰 ０％ ，ｐＨ ７􀆰 ０。
试剂：限制性内切酶、 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶、 ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ、高分子量标准蛋白 Ｍａｒｋｅｒ、氨苄青霉素、卡
拉霉素、ＩＰＴＧ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶购自日本 ＴａＫａＲａ 公
司；ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ 聚合酶购自日本 ＴｏＹｏＢｏ 公司；
大肠杆菌质粒提取试剂盒 Ｅ． Ｚ． Ｎ． Ａ． ® Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ
Ｋｉｔ购自美国 Ｏｍｅｇａ 公司；ＤＮＡ 回收试剂盒购自天
根生化科技（北京）有限公司；其它试剂均为国产分
析纯。
仪器：ＡＢ Ｖｅｒｉｔｉ ９６ ＰＣＲ仪，美国 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ⁃
ｔｅｍｓ 公司；Ｓｏｒｖａｌｌ Ｌｅｇｅｎｄ Ｍｉｃｒｏ １７Ｒ 离心机，美国
Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公司；ＰｏｗｅｒＰａｃ 电泳仪，美国 Ｂｉｏ⁃
Ｒａｄ公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ Ｂｔ及大肠杆菌质粒 ＤＮＡ的提取
Ｂｔ质粒的提取（Ｒｅｙｅｓ⁃Ｒａｍíｒｅｚ ＆ Ｉｂａｒｒａ，２００８）：
将 Ｂｔ菌株 ＢＮ２３⁃５ 于 ＬＢ 液体培养基中培养，３０℃、
２０２ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
２５０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养至菌体 ＯＤ６００介于 ０􀆰 ９ ～ １􀆰 ０ 之间，
１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，弃上清；加入预冷 ＴＥＳ 溶
液（３０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 三异丙基乙磺酰、５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙二胺
四乙酸、５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 氯化钠， ｐＨ ８􀆰 ０） １ ｍＬ，混匀，
１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １ ｍｉｎ，弃上清，２ 次重复；加 ３００
μＬ裂解液（含 ２０％蔗糖的三羟甲基甲胺基乙磺酸、
２ ｍｇ ／ ｍＬ溶菌酶、１０ μｇ ／ ｍＬ ＲＮＡ酶），混匀，３７℃放
置 ９０ ｍｉｎ，再加入 ３ ｍｏｌ ／ Ｌ、ｐＨ ４􀆰 ８ 醋酸钠 １５０ μＬ，
－ ２０℃放置 ３０ ｍｉｎ。 １８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、４℃离心 ２０ ｍｉｎ，
汲取上清于新试管中，再加入 ２ 倍体积预冷的无水
乙醇，沉淀过夜。 １８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、４℃离心 ２０ ｍｉｎ，弃
上清，低温干燥，置于 － ２０℃冷冻保藏，备用。 大肠
杆菌质粒 ＤＮＡ的提取使用质粒提取试剂盒。
１􀆰 ２􀆰 ２ 含 ｃｒｙ１Ｉｅ基因的克隆及测序
ｃｒｙ１Ｉｅ基因的扩增引物，参照 ＧｅｎＢａｎｋ 中公布的
ｃｒｙ１Ｉ类基因编码区的 Ｎ⁃端和 Ｃ⁃端序列同源性，设计
并合成 １ 对引物 Ｐ１∶ ５′⁃ＡＴＧＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＡＴＣＭＡＧ⁃
３′；Ｐ２ ∶ ５′⁃ＣＴＡＣＡＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＡＡＴＡＴＴ⁃３′，以 Ｂｔ 菌
株 ＢＮ２３⁃５ 的质粒 ＤＮＡ 为模板，利用高保真 ＫＯＤ
Ｐｌｕｓ ＤＮＡ聚合酶进行 ＰＣＲ 扩增。 扩增产物进行胶
回收，将产物回收纯化后与 ｐＥＡＳＹＴＭ⁃Ｔ１ 载体进行
连接，连接产物转化 Ｔｒａｎｓ１⁃Ｔ１ 感受态细胞，过夜培
养长出单菌落后随机挑选单菌落进行 ＰＣＲ 鉴定。
所得阳性克隆由华大基因科技有限公司完成测序。
测序得到的序列使用在线 ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴｘ 软件进行
同源性分析；基因的酶切位点使用 ＤＮＡＭＡＮ软件分
析；多序列比对使用 Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ １１ 的 Ａｌｉｇｎ
Ｘ程序进行。
１􀆰 ２􀆰 ３ ｃｒｙ１Ｉｅ基因的表达及 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测
测序后得到 ｃｒｙ１Ｉｅ 基因的完整开放阅读框，使
用 ＤＮＡＭＡＮ软件分析该基因序列，根据大肠杆菌表
达载体 ｐＥＴ⁃２８ａ克隆位点及该基因开放阅读框两端
序列设计 １ 对特异引物：上游引物 Ｓ５１Ｉ：５′⁃ＧＣＣＧ⁃
ＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＡＴＣＡＡＧＡＴＡＡＧ⁃３′（下划
线为 ＢａｍＨＩ 酶切位点 ）， 下游 引 物 Ｓ３１Ｉ： ５′⁃
ＣＣＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣＡＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＡＡＴＡＴ⁃３′（下划
线为 ＨｉｎｄＩＩＩ酶切位点）。 以 Ｂｔ菌株 ＢＮ２３⁃５ 的质粒
ＤＮＡ为模板，利用高保真 ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ 聚合酶进
行 ＰＣＲ扩增。 扩增产物进行胶回收，将回收的目的
片段进行双酶切（ＢａｍＨＩ和 ＨｉｎｄＩＩＩ），并与经过同样
酶切处理的 ｐＥＴ２８⁃ａ 以 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶进行连接，
４℃过夜。 将连接产物转化大肠杆菌 ＤＨ５α，３７℃过
夜，待长出单菌落后，挑选单菌落进行检测，以 ＰＣＲ
和限制性酶切筛选获得阳性克隆。 阳性克隆质粒再
转入表达细胞大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）。
将阳性的表达细胞克隆子接种于 ＬＢ 培养基
中，３７℃、２１０ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下扩大培养，菌体 ＯＤ６００值
达到 ０􀆰 ５ 时，加入 ＩＰＴＧ，使终浓度达到 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
进行诱导，于 ３０℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下进行诱导表达
１２ ｈ。 取 １ Ｌ菌液离心收集，弃上清，加入 ３０ ｍＬ １０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ（ ｐＨ ８􀆰 ０）超声波破碎，进一步用
ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测表达的蛋白（Ｓｃｈäｇｇｅｒ ＆ ｖｏｎ Ｊａｑｏｗ，
１９８７）。
１􀆰 ２􀆰 ４ ｃｒｙ１Ｉｅ基因的室内生物活性分析
提取含有 ｃｒｙ１Ｉｅ 基因表达蛋白的包涵体，ＳＤＳ⁃
ＰＡＧＥ定量分析后，分别测定其对小菜蛾、亚洲玉米
螟、棉铃虫和甜菜夜蛾的杀虫活性，并使用 ＳＰＳＳ
１０􀆰 ０ 软件对生物测定结果进行分析，计算 ＬＣ５０及
９５％置信区间。 小菜蛾杀虫活性的测定采用浸叶法
测定：将该蛋白浓度稀释为 ０􀆰 １、０􀆰 ２、０􀆰 ４、０􀆰 ８、１􀆰 ６
和 ３􀆰 ２ μｇ ／ ｍＬ，白菜叶用水洗净晾干，选取鲜嫩一致
的叶片浸入稀释好的待测样品 １０ ｓ，取出晾干，放入
培养皿中，每皿接 ２ 龄幼虫 ２０ 头，每处理重复 ３ 次，
置于 ２５℃光照培养箱中培养 ３ ｄ，调查死亡数。 亚
洲玉米螟、甜菜夜蛾和棉铃虫杀虫活性的测定参考
Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００３）方法：将上述蛋白浓度稀释为 ５、
１０、２０、４０、８０ 和 １６０ μｇ ／ ｍＬ，加入人工饲料中混匀，
待凝固冷却后分装在生测板中，每处理接各试虫的
２ 龄幼虫 ２０ 头，每个样品 ３ 次重复，置于 ２５℃光照
培养箱中，甜菜夜蛾和棉铃虫培养 ３ ｄ 后调查结果，
亚洲玉米螟培养 ７ ｄ后调查结果。 生物活性的测定
以大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）为阴性对照，清水为空白对
照；小菜蛾的生物测定以 Ｃｒｙ１Ａｃ⁃ＢＬ２１ 为阳性对照。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 全长 ｃｒｙ１Ｉｅ基因的扩增、克隆及测序
使用引物 Ｐ１ 和 Ｐ２ 进行 ＰＣＲ扩增，得到 ２􀆰 ２ ｋｂ
左右的片段，将其回收、连接、转化，获得多个阳性克
隆，筛选 ３ 个阳性克隆分别进行测序，结果表明 ３ 个
序列完全一致。 将其转化子命名为 Ｔｒａｎｓ１⁃Ｉｅ，将含
有目的片段的重组质粒命名为 ＴＭ⁃Ｉｅ。
２􀆰 ２ ｃｒｙ１Ｉｅ基因序列测定及分析
对重组质粒 ＴＭ⁃Ｉｅ 的测序结果进行分析，发现
该基因为一个完整的 ｃｒｙ１Ｉｅ 基因，全长 ２ １６０ ｂｐ。
由 ＤＮＡ序列推导出该 ｃｒｙ１Ｉｅ 基因由 ７１９ 个氨基酸
组成（表 １），分子量为 ８１ ｋＤ，等电点 ｐＩ为 ５􀆰 ６，是弱
酸性蛋白质，其中丝氨酸、亮氨酸和苏氨酸 ３ 种氨基
酸含量最高，分别为 ９􀆰 １７％ 、８􀆰 ８９％和 ８􀆰 ０６％ 。 使
３０２２ 期 余宗兰等： 苏云金芽胞杆菌 ｃｒｙ１Ｉｅ新基因的克隆、表达与生物活性测定
用软件 Ａｌｉｇｎ Ｘ将获得的序列与其它 ＧｅｎＢａｎｋ 中公
布的 ４ 个 Ｃｒｙ１Ｉｅ 蛋白进行分析比较，发现其与
Ｃｒｙ１Ｉｅ２ 和 Ｃｒｙ１Ｉｅ３ 的同源性最高，均为 ９５􀆰 ４％ ，且
均具有 ３３ 个氨基酸的差异。 该蛋白被国际 Ｂｔ杀虫
晶体蛋白命名委员会命名为 Ｃｒｙ１Ｉｅ５，ＧｅｎＢａｎｋ 登录
号为 ＫＪ７１０６４６。
表 １ Ｃｒｙ１Ｉｅ５ 蛋白的氨基酸组成
Ｔａｂｌｅ １ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｙ１Ｉｅ５ ｐｒｏｔｅｉｎ
氨基酸
Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
百分比 （％ ）
Ｐｅｒｃｅｎｔ
氨基酸
Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
百分比 （％ ）
Ｐｅｒｃｅｎｔ
氨基酸
Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
百分比 （％ ）
Ｐｅｒｃｅｎｔ
丙氨酸 Ａｌａｎｉｎｅ ５􀆰 ８３ 甘氨酸 Ｇｌｙｃｉｎｅ ５􀆰 ６９ 脯氨酸 Ｐｒｏｌｉｎｅ ４􀆰 ０２
精氨酸 Ａｒｇｉｎｉｎｅ ５􀆰 １４ 组氨酸 Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ２􀆰 ２２ 丝氨酸 Ｓｅｒｉｎｅ ９􀆰 １７
天冬酰胺 Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ６􀆰 ３９ 异亮氨酸 Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ５􀆰 ８３ 缬氨酸 Ｖａｌｉｎｅ ６􀆰 ８１
天冬氨酸 Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ ４􀆰 ７２ 亮氨酸 Ｌｅｕｃｉｎｅ ８􀆰 ８９ 苏氨酸 Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ８􀆰 ０６
半胱氨酸 Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ０􀆰 ２８ 赖氨酸 Ｌｙｓｉｎｅ ３􀆰 ７５ 色氨酸 Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ １􀆰 ６７
谷氨酰胺 Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ３􀆰 ８９ 甲硫氨酸 Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ １􀆰 ３９ 酪氨酸 Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ４􀆰 ４４
谷氨酸 Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ６􀆰 ５３ 苯丙氨酸 Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ５􀆰 １４ 终止密码子 Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ ０􀆰 １４
２􀆰 ３ ｃｒｙ１Ｉｅ５ 基因在大肠杆菌中的表达
将重组表达质粒转化大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３），经
ＩＰＴＧ诱导后，ｃｒｙ１Ｉｅ５ 基因在大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）
中获得了表达。 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ 分析结果表明，ｃｒｙ１Ｉｅ５
基因的表达产物分子量约为 ８１ ｋＤ（图 １），与该基因
氨基酸序列推导的理论分子量相符。
２􀆰 ４ Ｃｒｙ１Ｉｅ５ 蛋白的生物活性
Ｃｒｙ１Ｉｅ５ 蛋白的生物活性测定结果表明，其对小
菜蛾具极高的杀虫活性，ＬＣ５０（９５％ ＣＬ）为 ０􀆰 ４３ μｇ ／
ｍＬ（０􀆰 ２８ ～ ０􀆰 ５８ μｇ ／ ｍＬ），高于阳性对照 Ｃｒｙ１Ａｃ⁃
ＢＬ２１ 蛋白对小菜蛾的杀虫活性，其 ＬＣ５０ （９５％ ＣＬ）
为 ０􀆰 ５３ μｇ ／ ｍＬ（０􀆰 ０１ ～ ０􀆰 ５９ μｇ ／ ｍＬ）。 Ｃｒｙ１Ｉｅ５ 蛋白
对亚洲玉米螟的杀虫活性也较高，ＬＣ５０（９５％ ＣＬ）为
４８􀆰 ３９ μｇ ／ ｍＬ（４５􀆰 ９７ ～ ５１􀆰 ７９ μｇ ／ ｍＬ） （表 ２）；而对
棉铃虫的致死率不高，但能明显抑制其生长；对甜菜
夜蛾不具有杀虫活性。 阴性对照大肠杆菌 ＢＬ２１
（ＤＥ３）和空白对照对小菜蛾、亚洲玉米螟、棉铃虫和
甜菜夜蛾均不具有杀虫活性。
图 １ ｃｒｙ１Ｉｅ５ 基因在大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）
中表达产物的 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测
Ｆｉｇ． １ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｒｙ１Ｉｅ５ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）
１： ｃｒｙ１Ｉｅ５； ２： ｐＥＴ⁃２８ａ； Ｍ： 标准蛋白。 １： ｃｒｙ１Ｉｅ５
ｇｅｎｅ； ２： ｐＥＴ⁃２８ａ； Ｍ： ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ．
　
表 ２ Ｃｒｙ１Ｉｅ５ 蛋白对 ４ 种昆虫的生物活性测定结果
Ｔａｂｌｅ ２ Ｂｉｏａｓｓａｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｃｒｙ１Ｉｅ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｆｏｕｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｓｅｃｔｓ
供试昆虫
Ｔｅｓｔｅｄ ｉｎｓｅｃｔ
Ｃｒｙ１Ｉｅ５ Ｃｒｙ１Ａｃ
ＬＣ５０（μｇ ／ ｍＬ） ９５％ＣＬ （μｇ ／ ｍＬ） ＬＣ５０（μｇ ／ ｍＬ） ９５％ＣＬ （μｇ ／ ｍＬ）
小菜蛾 Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ ０􀆰 ４３ ０􀆰 ２８ ～ ０􀆰 ５８ ０􀆰 ５３ ０􀆰 ０１ ～ ０􀆰 ５９
亚洲玉米螟 Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ ４８􀆰 ３９ ４５􀆰 ９７ ～ ５１􀆰 ７９ － －
棉铃虫 Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ Ｎ Ｎ － －
甜菜夜蛾 Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ Ｎ Ｎ － －
阴性对照 Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｎ Ｎ － －
空白对照 Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｎ Ｎ － －
　 　 － ： 未检测； Ｎ： 无杀虫活性。 － ： Ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ； Ｎ： ｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．
４０２ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
３ 讨论
ｃｒｙ１Ｉｅ５ 基因的两端分别有 １９ 个（Ｎ 端）和 ２１
个（Ｃ端）核苷酸来自引物，虽然这些是参照 ｃｒｙ１Ｉ
类基因编码区的 Ｎ⁃端和 Ｃ⁃端序列同源性设计合成
的，不一定就是 ｃｒｙ１Ｉｅ５ 本身的序列；但是，通过多序
列比对，ｃｒｙ１Ｉａ以及 ｃｒｙ１Ｉｅ 基因，它们的前引物序列
第 １６ 位碱基有所不同，既有胞嘧啶（ｃｙｔｏｓｉｎｅ，Ｃ）又
有腺嘌呤（ａｄｅｎｉｎｅ，Ａ），因此本研究设计了简并引物
Ｍ（Ｍ ＝ Ａ ／ Ｃ），最终测序结果表明 ｃｒｙ１Ｉｅ５ 基因的第
１６ 位碱基为 Ａ；而后引物序列的 ２１ 个碱基完全一
致。 因此，ｃｒｙ１Ｉｅ５ 两端引物序列的真实性较高。
从测序结果来看，Ｃｒｙ１Ｉｅ５ 蛋白氨基酸序列与已
经报道的 ４ 种 Ｃｒｙ１Ｉｅ序列存在差异，其中与 Ｃｒｙ１Ｉｅ１
有 ３９ 个氨基酸的差异，与 Ｃｒｙ１Ｉｅ２ 和 Ｃｒｙ１Ｉｅ３ 之间
均有 ３３ 个氨基酸不同，与 Ｃｒｙ１Ｉｅ４ 有 ５５ 个氨基酸的
差异。 这些差异主要是在 Ｎ端区域，而 Ｎ 端区域是
蛋白质活性的关键区域（Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ． ，１９９５）。 据报
道，Ｃｒｙ１Ｉｅ２ 蛋白对亚洲玉米螟的活性很高，ＬＣ５０为
０􀆰 １２ μｇ ／ ｍＬ（刘东明，２０１１），而本试验中 Ｃｒｙ１Ｉｅ５ 蛋
白对亚洲玉米螟的杀虫活性 ＬＣ５０为 ４８􀆰 ３９ μｇ ／ ｍＬ，
差别很大，这与它们的氨基酸序列有关，Ｃｒｙ１Ｉｅ５ 与
Ｃｒｙ１Ｉｅ２ 的全长均为 ７１９ 个氨基酸，在 Ｎ 端的前 ６０
个氨基酸中就有 １９ 个氨基酸不同，而后面的 ６５９ 个
氨基酸中只有 １４ 个氨基酸不同，具体哪个位点的突
变造成活性的变化还需进一步研究。
由大肠杆菌表达的 Ｃｒｙ１Ｉｅ５ 蛋白对小菜蛾的
ＬＣ５０为 ０􀆰 ４３ μｇ ／ ｍＬ，高于 Ｃｒｙ１Ａｃ 对小菜蛾（ＬＣ５０为
０􀆰 ５３ μｇ ／ ｍＬ）的杀虫活性。 目前为止，全世界发现
并克隆得到许多 Ｂｔ基因，其中不少基因被用作生物
杀虫剂或者被转入植物中控制害虫。 但是，许多害
虫已经对 Ｂｔ 蛋白产生抗性（ＭｃＧａｕｇｈｅｙ，１９８５），小
菜蛾是第 １ 种在户外被发现对 Ｂｔ 产生抗性的物种
（Ｓａｒｆｒａｚ ＆ Ｋｅｄｄｉｅ，２００５）；且小菜蛾的基因容易发生
突变，对几乎所有的杀虫剂都能产生抗性（Ｚｈａｏ ｅｔ
ａｌ． ，２００６）。 目前，转入植物中抵抗小菜蛾的 Ｂｔ 基
因主要有 ｃｒｙ１Ａ基因（Ｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ． ，１９９５）、ｃｒｙ１Ｃ 基因
（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ． ，１９９９）和 ｃｒｙ１Ｂ 基因（Ｙｉ ｅｔ ａｌ． ，２０１１）。
另外，由于 Ｂｔ蛋白对昆虫的作用与其中肠上的受体
有关，不同的蛋白在昆虫中肠细胞膜上的结合位点
和作用机制不同，Ｃｒｙ１Ｉ类蛋白与 Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｃ等蛋
白具有不同的结构，它们之间不存在交互抗性（ ｄｅ
Ｅｓｃｕｄｅｒｏ ｅｔ ａｌ． ，２００６）。 但关于 Ｃｒｙ１Ｉｅ５ 蛋白的结构
和杀虫机理还需进一步进行深入研究。 ｃｒｙ１Ｉｅ５ 作
为新的基因，可用于我国抗虫转基因作物和工程菌
的研制，为筛选、延缓和克服昆虫产生抗性的基因组
合提供了新的可选材料。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
Ａｋｈｕｒｓｔ ＲＪ， Ｔａｍｅｓ Ｗ， Ｂｉｒｄ ＬＪ， Ｂｅａｒｄ Ｃ． ２００３． Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ
ＣｒｙｌＡｃ δ⁃ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌ⁃
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ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ， ９６（４）： １２９０ － １２９９
Ｃａｏ Ｊ， Ｔａｎｇ ＪＤ， Ｓｔｒｉｚｈｏｖ Ｎ， Ｓｈｅｌｔｏｎ ＡＭ， Ｅａｒｌｅ ＥＤ． １９９９． Ｔｒａｎｓ⁃
ｇｅｎｉｃ ｂｒｏｃｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｃｒｙ１Ｃ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ ｌａｒｖａｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ Ｃｒｙ１Ａ ｏｒ
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ｏｎｅ ｏｒ ｔｗｏ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｖａｒ． ｋｕｒｓｔａｋｉ Ｂｅｒｌｉｎｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｆｏｒ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｃｔｕｉｄ （Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ） ｐｅｓｔｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｃｏ⁃
ｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ， ９６（３）： ７５５ － ７６２
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ｃｌｕｓ Ｄ， Ｂａｕｍ Ｊ， Ｄｅａｎ ＤＨ． １９９８． Ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｍｅｎｃｌａ⁃
ｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ ｃｒｙｓｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｍｉ⁃
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ６２（３）： ８０７ － ８１３
ｄｅ Ｅｓｃｕｄｅｒｏ ＩＲ， Ｅｓｔｅｌａ Ａ， Ｐｏｒｃａｒ Ｍ， Ｍａｒｔíｎｅｚ Ｃ， Ｏｇｕｉｚａ ＪＡ， Ｅｓ⁃
ｃｒｉｃｈｅ Ｂ， Ｆｅｒｒé Ｊ， Ｃａｂａｌｌｅｒｏｌ Ｐ． ２００６． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔｉ⁃
ｃｉｄａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＣｒｙｌＩ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｉｎｓｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｆａｍｉｌｉｅｓ Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ， Ｔｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ， Ｐｌｕｔｅｌｌｉｄａｅ ａｎｄ Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ．
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５０２２ 期 余宗兰等： 苏云金芽胞杆菌 ｃｒｙ１Ｉｅ新基因的克隆、表达与生物活性测定
ａｎｄ ｃａｂｂａｇｅ （Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ｃａｐｉｔａｔａ）． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，
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Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ δ⁃ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂｅａｎ ｓｈｏｏｔ ｂｏｒｅｒ
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ｇｅｎｔｉｎａ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ９４（２）： １２５ － １２９
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（２）： ３６８ － ３７９
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Ｒｅｖｉｅｗｓ， ６２（３）： ７７５ － ８０６
Ｓｅｋａｒ Ｖ， Ｈｅｌｄ Ｂ， Ｔｉｐｐｅｔｔ Ｊ， Ａｍｉｒｈｕｓｉｎ Ｂ， Ｒｏｂｅｆｆ Ｐ， Ｗａｎｇ Ｋ， Ｗｉｌ⁃
ｓｏｎ ＨＭ． １９９７． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＣｒｙＶ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ６３（７）： ２７９８ － ２８０１
Ｓｅｌｖａｐａｎｄｉｙａｎ Ａ， Ｒｅｄｄｙ ＶＳ， Ｋｕｍａｒ ＰＡ， Ｔｅｗａｒｉ ＫＫ， Ｂｈａｔｎａｇａｒ
ＲＫ． １９９８． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｗｉｔｈ ａ ｎａｔｉｖｅ
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ａｒｍｉｇｅｒａ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， ４（６）： ４７３ － ４７８
Ｓｏｎｇ ＦＰ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ｇｕ ＡＸ， Ｗｕ Ｙ， Ｈａｎ ＬＬ， Ｈｅ ＫＬ， Ｃｈｅｎ ＺＹ，
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ｎｏｖｅｌ ｃｒｙ１Ｉ⁃ｔｙｐｅ ｇｅｎｅ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ⁃
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ｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａ ｑｕａ⁃
ｓｉｃｕｂｏｉｄａｌ ｃｒｙｓｔａｌ ｏｆ Ｃｒｙ１Ａｂ２１ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｌａｒｖａｅ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ．
Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ７４（４）： ９２３ － ９３０
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（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ） ｂｙ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｃｏｔｔｏｎ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｏｘｉｎ Ｃｒｙ２Ａｂ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
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（责任编辑：李美娟）
６０２ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷