全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（３）： ４８３ － ４９２ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０３􀆰 ０１８
基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项（２０１４ＺＸ０８００９１３Ｂ），国家“８６３”计划（２０１１ＡＡ１０Ａ２０３）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｊｚｈａｎｇ＠ ｉｐｐｃａａｓ． ｃｎ
收稿日期： ２０１５ － ０３ － １６
对大黑鳃金龟甲幼虫高效的苏云金芽胞杆菌
筛选及 ｃｒｙ基因鉴定
王小奇１ 　 束长龙１ 　 蒋　 健１ 　 张风娇１ 　 刘春琴２ 　 张　 杰１∗
（１．中国农业科学院植物保护研究所， 植物病虫害生物学国家重点实验室， 北京 １００１９３；
２．河北省沧州市农林科学院， 沧州 ０６１００１）
摘要： 为获得对大黑鳃金龟甲幼虫具有较高杀虫活性的菌株，利用拌土法测定了本实验室分离的
５００ 株苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ）对大黑鳃金龟甲的杀虫活性，建立 Ｂｔ 菌株比较鉴
别技术来进行多样性分析，并对菌株的晶体形态及幼虫感染 Ｂｔ后的中肠组织切片进行观察。 结果
显示，从 ５００ 株 Ｂｔ菌株中筛选到 ４２ 株对大黑鳃金龟甲幼虫具有不同程度活性的菌株，分属于 １４
个菌株类型；其中有 １０ 株校正死亡率大于 ６０％ ，２６１⁃１ 菌株杀虫活性最高，７ ｄ 校正死亡率达
１００％ 。 从 １４ 个菌株类型中各选取 １ 个代表菌株进行基因鉴定，仅 Ｐ６５⁃１、１１２６⁃１、ＦＣＤ１１４ 和 ７８⁃２
菌株分别含有 ｃｒｙ８Ｍａ、ｃｒｙ８Ｃａ、ｃｒｙ８Ａｂ、ｃｒｙ８Ｇａ、ｃｒｙ８Ｅａ 共 ５ 个 ｃｒｙ８ 类新基因，其它 １０ 个菌株均不含
ｃｒｙ３、ｃｒｙ８、ｃｒｙ１８、ｃｒｙ２３、ｃｒｙ３７、ｃｒｙ４３ 等对鞘翅目害虫有效的杀虫基因。 １４ 个菌株中，７８⁃３、１２７⁃２ 和
１１９８⁃１ 菌株能产生双锥体型晶体，２６１⁃１、ＦＣＤ１１４、Ｐ６５⁃１、ＦＴＬ８４、７８⁃２ 和 １１２６⁃１ 菌株能产生球形晶
体。 幼虫感染 ２６１⁃１、１１９８⁃１、ＦＣＤ１１４、１１２６⁃１、ＱＤＬ４０⁃２ 菌株后，中肠组织发生明显的病理变化：２ ｄ
时肠壁细胞明显出现空洞化，排列疏松，４ ｄ时受到严重破坏并脱离底膜。 表明筛选到的 Ｂｔ菌株具
有防治大黑鳃金龟甲幼虫的潜力。
关键词： 苏云金芽胞杆菌； 多样性分析； 大黑鳃金龟甲； ｃｒｙ８ 基因； 组织病理
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ
ｈｉｇｈｌｙ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｔｈｅ ｌａｒｖａｅ ｏｆ Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ ｏｂｌｉｔａ
Ｗａｎｇ Ｘｉａｏｑｉ１ 　 Ｓｈｕ Ｃｈａｎｇｌｏｎｇ１ 　 Ｊｉａｎｇ Ｊｉａｎ１ 　 Ｚｈａｎｇ Ｆｅｎｇｊｉａｏ１ 　 Ｌｉｕ Ｃｈｕｎｑｉｎ２ 　 Ｚｈａｎｇ Ｊｉｅ１∗
（１． Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔｓ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃａｎｇｚｈｏｕ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ
Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃａｎｇｚｈｏｕ ０６１００１， Ｈｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ （Ｂｔ） ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｌａｒｖａｅ ｏｆ Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ ｏｂｌｉｔａ， ５００ Ｂｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ； ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｈａｐｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ Ｂｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｔｈｅ
ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ ｏｆ Ｈ． ｏｂｌｉｔａ ｌａｒｖａｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ａ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｃｒｙｓｔａｌｓ
ａｎｄ ｓｐｏｒｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｅｓｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｌｉｃｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ４２ ｉｓｏｌａｔｅｓ
ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｌａｒｖａｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｐｅｓｔ， ａｎｄ ｔｈｅｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｉｎｔｏ １４ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ， ｏｆ ｗｈｉｃｈ
ｔｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｈａｄ ａ ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｏｆ ｏｖｅｒ ６０％ ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ２６１⁃１ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｒｅａｃｈｉｎｇ
１００％ ｉｎ ｓｅｖｅｎ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｏｎｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅａｃｈ ｔｙｐｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｃｒｙ
ｇｅｎｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｆｏｕｒ ｉｓｏｌａｔｅｓ， Ｐ６５⁃１， １１２６⁃１， ＦＣＤ１１４ ａｎｄ ７８⁃２， ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｆｉｖｅ ｎｏｖｅｌ
ｃｒｙ８ ｇｅｎｅｓ， ｉ． ｅ． ｃｒｙ８Ｍａ， ｃｒｙ８Ｃａ， ｃｒｙ８Ａｂ， ｃｒｙ８Ｇａ ａｎｄ ｃｒｙ８Ｅａ， ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ
ｉｓｏｌａｔｅ ２６１⁃１， ｄｉｄ ｎｏｔ ｃｏｎｔａｉｎ ｃｒｙ ｇｅｎｅｓ ｔｏｘｉｃ ｔｏ Ｈ． ｏｂｌｉｔａ ｌａｒｖａｅ， ｓｕｃｈ ａｓ ｃｒｙ３， ｃｒｙ８， ｃｒｙ１８， ｃｒｙ２３，
ｃｒｙ３７ ａｎｄ ｃｒｙ４３． Ｔｈｒｅｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ， ７８⁃３， １２７⁃２ ａｎｄ １１９８⁃１， ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｄｏｕｂｌｅ ｐｙｒａｍｉｄ⁃ｓｈａｐｅｄ ｃｒｙｓｔａｌｓ，
ａｎｄ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｓｉｘ ｉｓｏｌａｔｅｓ， ２６１⁃１， ＦＣＤ１１４， Ｐ６５⁃１， ＦＴＬ８４， ７８⁃２ ａｎｄ １１２６⁃１．
Ｉｓｏｌａｔｅｓ ２６１⁃１， １１９８⁃１， ＦＣＤ１１４， １１２６⁃１ ａｎｄ ＱＤＬ４０⁃２ ｃｏｕｌｄ ｃａｕｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ
ｌａｒｖａｌ ｍｉｄｇｕｔ． Ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ ｃｅｌｌｓ ｂｅｃａｍｅ ｌｏｏｓｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｅａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｂｖｉｏｕｓ ｖａｃｕｏｌｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ
ｗｅｒｅ ｓｅｒｉｏｕｓｌｙ ｄａｍａｇｅｄ ａｎｄ ｅｖｅｎ ｄｅｖｉａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｔｈｅ Ｂｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｍａｙ
ｈａｖｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｈ． ｏｂｌｉｔａ ｌａｒｖａｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ； ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ； Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ ｏｂｌｉｔａ； ｃｒｙ８； ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ
　 　 大黑鳃金龟甲 Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ ｏｂｌｉｔａ 属鞘翅目金龟
总科，是我国东北、华北和黄淮海等地区主要地下害
虫，其幼虫（蛴螬）为害植物地下部分，成虫取食植
物地上部分（魏鸿钧等，１９８９），给我国农业生产造
成巨大的经济损失。 由于大黑鳃金龟甲趋光性较
弱、栖居于地下、为害时间长以及卵分批产于土中的
特点，传统的化学防治方法难以取得理想的效果
（陈建明等，２００４）。 因此，亟需探索和建立新的防
治技术和方法。
苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ）是一
种已被广泛用于农业害虫防治的昆虫病原细菌，随
着芽孢的形成，在其一端或两端形成具有不同形态
的伴胞晶体，即杀虫蛋白晶体，它主要是由 ｃｒｙ或 ｃｙｔ
基因编码（Ｓｃｈｎｅｐｆ ｅｔ ａｌ． ，１９９８；Ｂｒａｖｏ ｅｔ ａｌ． ，２０１１）。
目前，国内外围绕 Ｂｔ开展对地下害虫蛴螬防治技术
的研究已有 ２０ 余年，发现对蛴螬有活性的 Ｂｔ 基因
有 ｃｒｙ３（Ｋｕｒｔ ｅｔ ａｌ． ，２００５）、ｃｒｙ８（Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ． ，２００７）、
ｃｒｙ２３、ｃｒｙ３７（Ｄｏｎｏｖａｎ ｅｔ ａｌ． ，２０００）、ｃｒｙ４３（Ｙｏｋｏｙａｍａ
ｅｔ ａｌ． ，２００４）等，其中研究最多的是 ｃｒｙ８ 类基因。
２０００ 年，我国开始开展对蛴螬有效的 Ｂｔ 菌株筛选
与杀虫基因发掘工作，如冯书亮等（２０００）和 Ｓｈｕ ｅｔ
ａｌ． （２００９ａ）分别在国内筛选出对铜绿丽金龟甲
Ａｎｏｍａｌａ ｃｏｒｐｕｌｅｎｔａ 和大黑鳃金龟甲有活性的菌株
ＨＢＦ⁃１ 和 ＨＢＦ１８。 随后 Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ． （２００９ｂ）从 ＨＢＦ１８
菌株中克隆出 ｃｒｙ８Ｇａ１ 基因。 Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１３）也
筛选出对大黑鳃金龟甲有活性的菌株 Ｂ⁃ＪＪＸ，并从
中克隆出 ｃｒｙ８Ａｂ１ 基因。
近年来，随着高通量测序技术的更新换代，加快
了杀虫基因克隆的速度（ Ｉｂｒａｈｉｍ ｅｔ ａｌ． ，２０１０）。 本
实验室利用基因组高通量测序方法从 Ｂｔ 菌株
ＨＢＦ１８ 中发现并克隆了对大黑鳃金龟甲等 ３ 种金
龟子幼虫均具有高活性的 ｃｒｙ８⁃ｌｉｋｅ、ｖｉｐ１Ａｄ 和 ｖｉｐ２Ａｇ
三种新基因（Ｂｉ ｅｔ ａｌ． ，２０１５）。 在菌株基因组高通
量测序之前，首先必须对供试菌株进行比较、鉴别，
去除冗余菌株，以免造成资金、人力、物力的巨大浪
费。 现有的菌株比较鉴别技术操作繁琐，且通量极
低，难以对大量菌株进行准确分析。 因此，鉴别、去
除冗余菌株成为 Ｂｔ杀虫基因发掘的一项重要工作。
束长龙（２０１３）建立了新的菌株多样性分析技术，利
用该技术对 ８８８ 株 Ｂｔ菌株进行了多样性分析，去除
了冗余菌株，获得了可用于高通量测序的 Ｂｔ 菌株
６４０ 个。 针对我国农业生产中大黑鳃金龟甲防治的
重要需求，本研究从自主分离的 Ｂｔ菌株对大黑鳃金
龟甲幼虫的毒力测定入手，对筛选获得的高毒力菌
株进行鉴定比较，去除冗余菌株；并在此基础上对所
得筛选菌株的杀虫基因进行鉴定，以期为高效杀虫
基因的分离克隆奠定基础。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试菌株：５００ 株供试 Ｂｔ 菌株为本实验室分
离、筛选并保存；对照菌株中 ＨＢＦ１ 和 ＨＢＦ１８ 由河
北省农林科学院植物保护研究所提供，Ｂｔ１８５ 和
ＢｔＳＵ４为本实验室分离、筛选所得，其中，ＨＢＦ１ 菌株
含有 ｃｒｙ８Ｃａ２ 基因， ＨＢＦ１８ 菌株含有 ｃｒｙ８Ｇａ１、
ｃｒｙ８ｌｉｋｅ、 ｖｉｐ１Ａｄ 和 ｖｉｐ２Ａｇ 基因， Ｂｔ１８５ 菌株含有
ｃｒｙ８Ｅａ１ 和 ｃｒｙ８Ｆａ１ 基因，ＢｔＳＵ４ 菌株含有 ｃｒｙ８Ｈａ１
和 ｃｒｙ８Ｉａ１ 基因。 Ｂｔ 标准菌株中 ＨＤ７３、 ＨＤ１２、
Ｔ１０Ａ００１、ＨＤ２２４、ＨＤ５１６、ＨＢＦ⁃１、Ｔ０３Ｂ００１、Ｔ２２００１、
ＨＤ１１、Ｂｔｉ菌株由美国俄亥俄州立大学的芽胞杆菌
遗传资源保藏中心提供，Ｙ４１ 和 ＦＢ 菌株为本实验
室分离、筛选所得。 Ｂｔ 标准菌株 ＨＤ７３ 的无晶体突
变株 ＨＤ７３ －为本实验室构建并保存。
供试昆虫：华北大黑鳃金龟甲幼虫由河北省沧
州市农林科学院植物保护研究所提供。 从田间采集
到成虫后，用新鲜的榆树叶片为饲料，雌雄配对在室
内进行人工饲养。 温度为 ２５℃、相对湿度为 １６％ ～
１８％ 、光周期为 １２ Ｌ ∶ １２ Ｄ。 成虫产卵后，将卵置于
４８４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
相对湿度为 １８％ ～ ２０％的土壤中进行孵育。 孵化
出来的幼虫用萌发的小麦种子在土中饲养。
培养基：ＬＢ（Ｌｕｒｉａ⁃Ｂｅｒｔａｎｉ）培养基：１％胰蛋白
胨、０􀆰 ５％ 酵母粉、 １％ ＮａＣｌ、 １􀆰 ３％ 琼脂， ｐＨ ７􀆰 ０，
１２１℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。
试剂：抗生素购自美国 Ａｍｒｅｓｃｏ 公司；Ｔａｑ Ｍｉｘ
聚合酶购自中国 ＢｉｏＭｅｄ 公司；ＰＣＲ 产物回收试剂
盒、质粒提取试剂盒、酶切纯化回收试剂盒购自美国
Ａｘｙｇｅｎ公司；限制性内切酶、连接试剂盒和 ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ 购自日本 ＴａＫａＲａ 公司和加拿大 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
公司；蛋白 Ｍａｒｋｅｒ 购自美国 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ 公司；ＰＣＲ 引
物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
仪器：Ｓ⁃４８００ 扫描电子显微镜，日本 Ｈｉｔａｃｈｉ 公
司；ＣＸ２１ 显微镜，日本 Ｏｌｙｍｐｕｓ 公司；Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ
ＰＣＲ 仪，德国 Ｂｉｏｍｅｔｒａ 公司；新 ＪＹ３００Ｃ 核酸电泳
仪，北京君意东方电泳设备有限公司；Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ⅲ蛋白电泳仪，美国 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ 公司；ＧｅＩＤｏｃ⁃Ｉｔ®凝胶
成像系统，天美（中国）科学仪器有限公司；ＳＰＸ 智
能型人工气候箱，宁波江南仪器厂。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ Ｂｔ菌株室内杀虫活性的测定
大黑鳃金龟甲幼虫室内杀虫活性测定参照茅洁
瑜等（２０１１）方法进行。 Ｂｔ菌株接种于 １ ／ ２ ＬＢ 固体
培养基上培养至 ５０％以上菌体裂解，刮取菌体悬浮
于 １０ ｍＬ灭菌超纯水中，将干燥马铃薯丝浸泡于菌
悬液中 ２０ ｍｉｎ后，连同菌悬液一起倒入经暴晒后的
１００ ｇ土中，搅拌均匀后，分装于 ６ 孔生测板内，每孔
接 １ 头试虫。 以 ５ ～ ７ 日龄的健康、个体均匀的大黑
鳃金龟甲幼虫作为试虫，每处理 ２０ 头，重复 ３ 次，设
清水为空白对照。 在人工气候箱中饲养，温度
２６℃、相对湿度 ７０％ 、光周期 １２ Ｌ ∶ １２ Ｄ，分别在 ７ ｄ
和 １４ ｄ后观察死亡和存活幼虫数量，计算校正死亡
率。 利用针头刺激虫体，无任何反应的视为死亡，反
之则为存活幼虫。 校正死亡率 ＝ （处理组死亡率 －
对照组死亡率） ／ （１ －对照死亡率） × １００％ 。
１􀆰 ２􀆰 ２ Ｂｔ菌株的多样性分析
根据 Ｂｔ菌株室内杀虫活性测定结果，提取具有
杀虫活性的 Ｂｔ 菌株基因组作为菌株多样性分析的
模板，设置已明确基因类型及其功能的 Ｂｔ 菌株
ＨＢＦ１８、Ｂｔ１８５、ＢｔＳＵ４、ＨＢＦ１ 为对照，Ｂｔ 基因组 ＤＮＡ
的提取参考 Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ． （２０１３）的方法。 Ｂｔ菌株在 ＬＢ
固体培养基中 ３０℃培养 １５ ｈ，收集菌体约 １００ ｍｇ
于 １􀆰 ５ ｍＬ离心管中，加入 １００ μＬ 混有溶菌酶的缓
冲液（１ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＥＤＴＡ、１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ、１ ｍｏｌ ／ Ｌ
蔗糖，ｐＨ ７􀆰 ０），混匀，３７℃孵育 ３０ ｍｉｎ，加入细胞裂解
液（１ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ，ｐＨ ８􀆰 ０）和 Ｔｒｉｓ 饱和酚轻轻混
匀，６５℃ 孵育 １ ｈ，再加入 ３００ μＬ 氯仿，混匀，
１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，取上清，加入等体积的异丙
醇， －２０℃静置 ２０ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，沉
淀用 ７０％乙醇洗涤 ２次，最后溶于 ２００ μＬ无菌水中。
根据现有杀虫基因序列，通过聚类分析，针对 Ｂｔ
蛋白中最大的一类杀虫蛋白（具有 ３个结构域的杀虫
晶体蛋白）中最保守的 Ｂｌｏｃｋ１ 和 Ｂｌｏｃｋ５，设计可以扩
增多个基因家族的通用引物，设计上游简并引物
Ｆｃｏｎ＿１ｆ：５′⁃ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＴＡＴＧＣＷＣＡＡＧＣ⁃
ＷＧＣＣＡＡＴＹＴＷＣＡＴＹＴ⁃３′和下游简并引物 Ｆｃｏｎ ＿５ｒ：
３′⁃ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＧＲＡＴＡＡＡＴＴＣＡＡＴＴＹＫＲＴ
ＣＷＡ⁃３′。 并利用 ＦａｓｔＰＣＲ 软件（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｐｒｉｍｅｒｄｉｇｉ⁃
ｔａｌ􀆰 ｃｏｍ ／ ｆａｓｔｐｃｒ􀆰 ｈｔｍｌ）进行模拟扩增来对引物的扩
增效率进行评估。
３０ μＬ ＰＣＲ 反应体系：２ × ＰＣＲ Ｍｉｘｔｕｒｅ １５ μＬ、
０􀆰 １ μｍｏｌ ／ Ｌ上下游引物各 １ μＬ、ＤＮＡ模板 １ μＬ、超
纯水 １２ μＬ。 ＰＣＲ 反应条件：９４℃预变性 ５ ｍｉｎ；
９４℃变性 １ ｍｉｎ，３８℃变性 ２ ｍｉｎ，７２℃延伸 ２ ｍｉｎ，３０
个循环；７２℃延伸 １０ ｍｉｎ。 ＰＣＲ 产物经 Ｈｉｎｆ Ｉ 酶切
后进行 １％琼脂糖凝胶电泳分析。
１􀆰 ２􀆰 ３ Ｂｔ菌株晶体的观察
根据 １􀆰 ２􀆰 ２ 多样性分析结果，并结合菌株对大
黑鳃金龟甲幼虫的杀虫活性数据，在每种类型的菌
株中选取杀虫活性最高的作为代表菌株进行进一步
鉴定。 将选取的 Ｂｔ 代表菌株的胞晶混合液涂于载
玻片上，烘干固定，石炭酸复红染液染色 ３０ ｓ，清水
冲洗，晾干后 １００ 倍油镜进行观察。 胞晶混合液滴
于盖玻片上，涂抹均匀，干燥，将盖玻片粘在载物台
上，送往中国科学院植物保护研究所标本馆进行离
子溅射喷金，并进行晶体扫描电镜的观察和拍照。
１􀆰 ２􀆰 ４ Ｂｔ菌株杀虫晶体蛋白的分析
选取的上述 Ｂｔ 代表菌株中杀虫晶体蛋白的
ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ分析参照萨姆布鲁克和拉塞尔（２００２）的
方法进行。 １２０ Ｖ 预电泳约 １０ ｍｉｎ，取蛋白样品 ４０
μＬ，加入 １０ μＬ ５ ×加样缓冲液，混匀，再将上清和
沉淀分别梯度稀释，煮沸 ５ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５
ｍｉｎ，取 １０ μＬ 上清点样。 ８０ Ｖ 恒压电泳至样品浓
缩呈直线，１５０ Ｖ 恒压电泳至指示的溴酚蓝到达凝
胶底部。
１􀆰 ２􀆰 ５ Ｂｔ菌株杀虫晶体蛋白基因的鉴定
本研究通过 ｃｒｙ８ 类通用引物对菌株的 ｃｒｙ８ 类
基因进行鉴定， ｃｒｙ８ 类通用引物参照 Ｙｕ ｅｔ ａｌ．
５８４３ 期 王小奇等： 对大黑鳃金龟甲幼虫高效的苏云金芽胞杆菌筛选及 ｃｒｙ基因鉴定
（２００６）的方法设计合成； ｃｒｙ３、 ｃｒｙ２３、 ｃｒｙ１８、 ｃｒｙ３７、
ｃｒｙ４３ 类基因的通用引物根据目前已公布的基因序
列通过聚类分析设计合成（表 １）。
表 １ 本研究中通用引物的设计与 ＰＣＲ扩增片段大小
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｉｚｅｓ ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
基因类型
Ｇｅｎｅ ｔｙｐｅ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＰＣＲ产物大小
ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｉｚｅ （ｂｐ）
ｃｒｙ３ ３Ｆ：ＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＡＡＴＣＣ
３Ｒ：ＧＴＣＴＡＣＡＣＴＴＣＴＡＴＧＴＧＴＣＣＡＡＧＴ
１ ５３０
ｃｒｙ８ Ｓｎ３ｕｎ８：ＧＴＣＣＡＡＡＴＡＡＴＣＡＡＡＡＴＧＡＡＴＡＴＧ
Ｓｎ５ｕｎ８：ＣＧＴＴＴＴＧＣＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＣ
２ １００
ｃｒｙ１８ １８Ｆ：ＣＴＣＣＡＡＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＴ
１８Ｒ：ＡＡＡＴＴＴＴＧＡＡ ＣＣＡＴＴＧＴＣＴ
１ ７５０
ｃｒｙ２３ ２３Ｆ：ＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧ
２３Ｒ：ＧＴＴＡＴＴＧＧＴＧ ＴＣＧＡＧＣＧＡＣＣ
８１０
ｃｒｙ３７ ３７Ｆ：ＡＴＧＡＣＡＧＴＡＴＡＴＡＡＣＧＣＡＡＣ
３７Ｒ：ＴＴＡＴＧＣＴＧＧＡ ＧＴＣＡＡＧＧ
３９０
ｃｒｙ４３ ４３Ｆ：ＣＣＧＣＡＡＣＧＴＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＴＧ
４３Ｒ：ＴＴＧＣＡＴＣＧＡＴＣＡＡＡＴＴＣＡＣＣＧＣ
１ ８００
１􀆰 ２􀆰 ６ 大黑鳃金龟甲幼虫中肠病理切片观察
将选取的上述 Ｂｔ 代表菌株接种于 ＬＢ 平板，在
３０℃恒温培养箱中培养至晶体产生，收集菌体即 Ｂｔ
胞晶混合物悬浮于 １０ ｍＬ 灭菌 ｄｄＨ２Ｏ 中，通过
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法进行总蛋白定量。 在 ６ 孔板中，每个孔
中加入 ２􀆰 ５ ｇ灭菌后的 １􀆰 ５％固体琼脂颗粒及 Ｂｔ胞
晶混合物，终浓度为 １０ μｇ ／ ｇ琼脂，阴性对照组分别
为不含 Ｂｔ 和加入无晶体突变株 ＨＤ７３ －的处理，阳
性对照组为加有对照菌株 ＨＢＦ１８ 胞晶混合物的处
理。 每个处理 １０ 头大黑鳃金龟甲 ２ 龄幼虫，每处理
３ 次重复。 取处理后第 ２ 天和第 ４ 天的大黑鳃金龟
甲幼虫，在解剖镜下解剖虫体，取出中肠，浸入
２􀆰 ５％ 、ｐＨ ７􀆰 ４ 的戊二醛固定液中，室温固定 ２ ～ ４
ｈ。 送武汉谷歌生物科技有限公司进行切片制作，
并于光学显微镜下进行病理学观察。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 对大黑鳃金龟甲幼虫有活性的 Ｂｔ菌株
依据 ５００ 株 Ｂｔ菌株杀虫活性测定结果，接种 １４
ｄ后，共筛选到 ４２ 株菌株对大黑鳃金龟甲幼虫校正
死亡率≥３０％ ，其中校正死亡率达到 １００％的菌株
仅有 １ 株，为 ２６１⁃１ 菌株，校正死亡率达到 ６０％以上
的菌株有 １０ 株，其余菌株的校正死亡率在 ３０％ ～
６０％之间（表 ２）。
表 ２ Ｂｔ菌株对大黑鳃金龟甲幼虫杀虫活性的筛选统计结果
Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｂｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ ｏｂｌｉｔａ ｌａｒｖａｅ ％
菌株
Ｉｓｏｌａｔｅ
校正死亡率 Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ
７ ｄ １４ ｄ
菌株
Ｉｓｏｌａｔｅ
校正死亡率 Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ
７ ｄ １４ ｄ
２６１⁃１ １００􀆰 ００ １００􀆰 ００ Ｂ８Ｄ６ ２３􀆰 ３３ ４０􀆰 ００
１１２６⁃１ ６０􀆰 ００ ８６􀆰 ６７ ７８⁃２ １１􀆰 ９０ ３８􀆰 ０９
Ｐ６５⁃１ ６０􀆰 ００ ８３􀆰 ３３ ＱＤＬ４０⁃２ ３０􀆰 ００ ３６􀆰 ６７
３９７⁃１ ５０􀆰 ００ ７３􀆰 ３３ Ｄ２ １０􀆰 ００ ３６􀆰 ６７
７８⁃３ ３０􀆰 ００ ７３􀆰 ３３ Ｃ９ １０􀆰 ００ ３６􀆰 ６７
Ｓ１２Ｂ４ ３０􀆰 ００ ７０􀆰 ００ ＱＣ６ ３６􀆰 ６７ ３６􀆰 ６７
Ｓ４Ｆ１２ ２０􀆰 ００ ６６􀆰 ６７ ＱＣ１１ ２０􀆰 ００ ３６􀆰 ６７
Ｓ１０Ｃ６ ４３􀆰 ３３ ６０􀆰 ００ ＰＳ８Ｄ１ ２３􀆰 ３３ ３６􀆰 ６７
Ｓ３Ｂ１１ ３６􀆰 ６７ ６０􀆰 ００ Ｂ８Ｅ２ ２６􀆰 ６７ ３６􀆰 ６７
Ｓ６Ｄ４ ４６􀆰 ６７ ６０􀆰 ００ Ｂ８Ｃ９ １３􀆰 ３３ ３６􀆰 ６７
ＦＣＤ３２ ３６􀆰 ６７ ５６􀆰 ６７ ＱＤＬ４７⁃１ １１􀆰 ９０ ３３􀆰 ３３
ＦＢＮ１１２ ２０􀆰 ００ ５６􀆰 ６７ １１９８⁃１ １６􀆰 ６７ ３３􀆰 ３３
６８４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
续表 ２ Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ
菌株
Ｉｓｏｌａｔｅ
校正死亡率 Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ
７ ｄ １４ ｄ
菌株
Ｉｓｏｌａｔｅ
校正死亡率 Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ
７ ｄ １４ ｄ
Ｓ１０Ｆ１０ ２３􀆰 ３３ ５３􀆰 ３３ Ｓ１０Ａ２ １３􀆰 ３３ ３３􀆰 ３３
ＦＣＤ１１４ ４０􀆰 ００ ５３􀆰 ３３ Ｃ２ ２０􀆰 ００ ３３􀆰 ３３
ＦＴＬ８４ ３０􀆰 ００ ５０􀆰 ００ Ｃ８ １６􀆰 ６７ ３３􀆰 ３３
Ｂ８Ｅ１２ １０􀆰 ００ ４６􀆰 ６７ Ｂ８Ｅ１１ １３􀆰 ３３ ３３􀆰 ３３
１１２６⁃３ １６􀆰 ６７ ４３􀆰 ３３ ＱＤＤ１５⁃３ ２３􀆰 ３３ ３０􀆰 ００
ＰＳ８Ｂ１０ ３６􀆰 ６７ ４３􀆰 ３３ ＦＳＤ１４⁃１ ２３􀆰 ３３ ３０􀆰 ００
１２７⁃２ １３􀆰 ３３ ４３􀆰 ３３ ４０５⁃３ １０􀆰 ００ ３０􀆰 ００
Ｂ８Ｆ２ １３􀆰 ３３ ４３􀆰 ３３ Ｄ５ １０􀆰 ００ ３０􀆰 ００
ＦＣＤ１１８ ２３􀆰 ３３ ４０􀆰 ００ Ｅ２ ３０􀆰 ００ ３０􀆰 ００
２􀆰 ２ Ｂｔ菌株的多样性分析
引物模拟扩增结果显示，简并引物对 Ｆｃｏｎ＿１ｆ
和 Ｆｃｏｎ＿５ｒ能够扩增 ｃｒｙ１、ｃｒｙ３、ｃｒｙ４、ｃｒｙ７、ｃｒｙ８、ｃｒｙ９、
ｃｒｙ１７、ｃｒｙ１９、 ｃｒｙ２０、 ｃｒｙ２１、 ｃｒｙ２４、 ｃｒｙ２５、 ｃｒｙ２７、 ｃｒｙ２８、
ｃｒｙ２９、ｃｒｙ３０、 ｃｒｙ３２、 ｃｒｙ３８、 ｃｒｙ４０、 ｃｒｙ４１、 ｃｒｙ４２、 ｃｒｙ４３、
ｃｒｙ４４、ｃｒｙ４７、 ｃｒｙ４８、 ｃｒｙ５０、 ｃｒｙ５２、 ｃｒｙ５３、 ｃｒｙ５４、 ｃｒｙ５７、
ｃｒｙ５９、ｃｒｙ６１、ｃｒｙ６７ 共 ３３ 个基因家族，比较广泛，可
用于菌株杀虫基因多样性的检测。 进一步选取了
１２ 株典型的含有 ｃｒｙ１、 ｃｒｙ３、 ｃｒｙ４、 ｃｒｙ８、 ｃｒｙ９、 ｃｒｙ１０、
ｃｒｙ１１、ｃｒｙ３０、ｃｒｙ４０、ｃｒｙ５０ 等基因的菌株对该兼并引
物进行测试，结果显示均可以检测到预期扩增条带
（图 １），表明该引物对可用于 Ｂｔ菌株的检测。
图 １ 简并引物 Ｆｃｏｎ＿１ｆ ／ Ｆｃｏｎ＿５ｒ的扩增结果
Ｆｉｇ． １ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ
ｐｒｉｍｅｒｓ Ｆｃｏｎ＿１ｆ ／ Ｆｃｏｎ＿５ｒ
Ｍ： ＤＮＡ 分子量标准 ＤＬ２０００； １ ～ １２： 分别为菌株
ＨＤ７３、ＨＤ１２、Ｔ１０Ａ００１、ＨＤ２２４、ＨＤ５１６、ＨＢＦ⁃１、Ｔ０３Ｂ００１、
Ｔ２２００１、Ｙ４１、ＦＢ、ＨＤ１１ 和 Ｂｔｉ。 Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００；
１ － １２： ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＤ７３， ＨＤ１２， Ｔ１０Ａ００１， ＨＤ２２４，
ＨＤ５１６， ＨＢＦ⁃１， Ｔ０３Ｂ００１， Ｔ２２００１， Ｙ４１， ＦＢ， ＨＤ１１，
ａｎｄ Ｂｔｉ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
　
利用设计的引物 Ｆｃｏｎ＿１ｆ和 Ｆｃｏｎ＿５ｒ对 ４２ 株对
大黑鳃金龟甲幼虫有活性的菌株进行扩增，发现有
３３ 个菌株获得预期大小的扩增条带，其余菌株无此
扩增条带。 对这 ３３ 个菌株和 ４ 个对照菌株获得预
期大小的扩增条带进一步酶切、电泳分析显示，除对
照菌株的 ４ 个类型外，待测 ３３ 个菌株共分为 １４ 个
类型（图 ２）；其中，菌株 ３９７⁃１ 和 Ｓ１０Ｃ６ 与对照菌株
ＨＢＦ１８ 带型相同；菌株 Ｃ９ 和 ＱＣ１０ 与对照菌株
Ｂｔ１８５ 带型相同；没有发现与菌株 ＢｔＳＵ４ 和 ＨＢＦ１ 带
型相同的菌株；有 ５ 个类型包含多个菌株；菌株
ＱＤＬ４７⁃１、 ２６１⁃１、 ７８⁃３、 １１９８⁃１、 Ｓ１０Ａ２、 Ｂ８Ｅ１２、
ＱＤＬ４０⁃２、ＦＣＤ１１４、Ｂ８Ｅ１１ 类型各只有 １ 株。 结合对
大黑鳃金龟甲的杀虫活性，在 １４ 种菌株类型中分别
选 １ 株代表性菌株 １１２６⁃１、Ｐ６５⁃１、ＱＤＬ４７⁃１、２６１⁃１、
ＦＴＬ８４、 ７８⁃２、 １２７⁃２、 ７８⁃３、 １１９８⁃１、 Ｓ１０Ａ２、 Ｂ８Ｅ１２、
ＱＤＬ４０⁃２、ＦＣＤ１１４、Ｂ８Ｅ１１ 进行进一步的鉴定。
２􀆰 ３ Ｂｔ菌株的杀虫蛋白晶体形态
对选择的 １４ 株代表菌株首先进行普通光学显
微镜观察， ＱＤＬ４７⁃１、 ＱＤＬ４０⁃２、 Ｂ８Ｅ１１、 Ｂ８Ｅ１２ 和
Ｓ１０Ａ２ 五个菌株没有观察到晶体存在，而其它 ９ 个
菌株有典型的晶体存在。 将这 ９ 个菌株样品进行扫
描电子显微镜观察，７８⁃３、１２７⁃２ 和 １１９８⁃１ 菌株能产
生双锥体型晶体；２６１⁃１、ＦＣＤ１１４、Ｐ６５⁃１、ＦＴＬ８４、７８⁃２
和 １１２６⁃１ 菌株能产生球形晶体（图 ３）。
２􀆰 ４ Ｂｔ菌株杀虫晶体蛋白的 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ分析
１４株代表菌株表达蛋白的 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ 分析结果
显示，Ｐ６５⁃１、１１２６⁃１、１２７⁃２、７８⁃３、２６１⁃１、ＦＣＤ１１４、１１９８⁃
１和 ７８⁃２ 菌株能表达典型的约 １３０ ｋＤ 的 Ｂｔ Ｃｒｙ 蛋
白，ＱＤＬ４７⁃１和 Ｂ８Ｅ１１ 菌株表达了约 ９７ ｋＤ 的蛋白，
其余菌株表达了少量 ６０ ｋＤ的蛋白（图 ４）。
２􀆰 ５ Ｂｔ菌株中杀虫晶体蛋白基因的鉴定
利用 ｃｒｙ３、ｃｒｙ８、ｃｒｙ１８、ｃｒｙ２３、ｃｒｙ３７、ｃｒｙ４３ 的保守
引物对 １４ 株代表菌株的鉴定结果显示，从 Ｐ６５⁃１、
１１２６⁃１、ＦＣＤ１１４ 和 ７８⁃２ 菌株中可以扩增到 ２􀆰 １ ｋｂ
的 ｃｒｙ８ 类基因目的片段；而所有供试菌株中均无
ｃｒｙ３、ｃｒｙ１８、ｃｒｙ２３、ｃｒｙ３７、ｃｒｙ４３ 的目的片段扩增出来。
进一步 ＰＣＲ⁃ＲＦＬＰ 结果显示（图 ５），Ｐ６５⁃１、１１２６⁃１、
ＦＣＤ１１４、７８⁃２ 等菌株酶切带型与已知菌株不同。 分
别对上述扩增片段克隆测序，序列比对分析结果显
７８４３ 期 王小奇等： 对大黑鳃金龟甲幼虫高效的苏云金芽胞杆菌筛选及 ｃｒｙ基因鉴定
图 ２ ３７ 个 Ｂｔ菌株 ＰＣＲ产物经 Ｈｉｎｆ Ｉ消化后的 ＰＣＲ⁃ＲＦＬＰ图谱
Ｆｉｇ． ２ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ⁃ＲＦＬＰ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ３７ Ｂｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｉｎｆ Ｉ
Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００； １ ～ ３７： ＨＢＦ１８、３９７⁃１、Ｓ１０Ｃ６、Ｂｔ１８５、Ｃ９、ＱＣ１０、ＨＢＦ１、ＢｔＳＵ４、１１２６⁃１、１１２６⁃３、Ｂ８Ｃ９、Ｐ６５⁃１、
Ｂ８Ｆ２、ＱＣ６、Ｂ８Ｅ２、ＱＤＬ４７⁃１、２６１⁃１、Ｃ２、Ｃ８、ＦＣＤ１１８、Ｅ２、ＦＴＬ８４、Ｄ５、ＱＣ１１、７８⁃２、Ｄ２、１２７⁃２、４０５⁃３、 ＦＳＤ１４⁃１、Ｃ１３Ｂ１１、７８⁃３、
１１９８⁃１、Ｓ１０Ａ２、Ｂ８Ｅ１２、ＱＤＬ４０⁃２、ＦＣＤ１１４ 和 Ｂ８Ｅ１２； １ ～ ３： 类型 Ｉ； ４ ～ ６： 类型 ＩＩ； ７： 类型 ＩＩＩ； ８： 类型 ＩＶ； ９ ～ １１： 类型 Ｖ；
１２ ～ １５： 类型 ＶＩ； １６： 类型 ＶＩＩ； １７： 类型 ＶＩＩＩ； １８ ～ ２２： 类型 ＩＸ； ２３ ～ ２６： 类型 Ｘ； ２７ ～ ３０： 类型 ＸＩ； ３１： 类型 ＸＩＩ； ３２： 类
型 ＸＩＩＩ； ３３： 类型 ＸＩＶ； ３４： 类型 ＸＶ； ３５： 类型 ＸＶＩ； ３６： 类型 ＸＶＩＩ； ３７： 类型 ＸＶＩＩＩ。 Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００； １ － ３７：
ＨＢＦ１８， ３９７⁃１， Ｓ１０Ｃ６， Ｂｔ１８５， Ｃ９， ＱＣ１０， ＨＢＦ１， ＢｔＳＵ４， １１２６⁃１， １１２６⁃３， Ｂ８Ｃ９， Ｐ６５⁃１， Ｂ８Ｆ２， ＱＣ６， Ｂ８Ｅ２， ＱＤＬ４７⁃１，
２６１⁃１， Ｃ２， Ｃ８， ＦＣＤ１１８， Ｅ２， ＦＴＬ８４， Ｄ５， ＱＣ１１， ７８⁃２， Ｄ２， １２７⁃２， ４０５⁃３， ＦＳＤ１４⁃１， Ｃ１３Ｂ１１， ７８⁃３， １１９８⁃１， Ｓ１０Ａ２， Ｂ８Ｅ１２，
ＱＤＬ４０⁃２， ＦＣＤ１１４， ａｎｄ Ｂ８Ｅ１２， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； １ － ３： ｔｙｐｅ Ｉ； ４ － ６： ｔｙｐｅ ＩＩ； ７： ｔｙｐｅ ＩＩＩ； ８： ｔｙｐｅ ＩＶ； ９ － １１： ｔｙｐｅ Ｖ； １２ － １５：
ｔｙｐｅ ＶＩ； １６： ｔｙｐｅ ＶＩＩ； １７： ｔｙｐｅ ＶＩＩＩ； １８ － ２２： ｔｙｐｅ ＩＸ； ２３ － ２６： ｔｙｐｅ Ｘ； ２７ － ３０： ｔｙｐｅ ＸＩ； ３１： ｔｙｐｅ ＸＩＩ； ３２： ｔｙｐｅ ＸＩＩＩ； ３３：
ｔｙｐｅ ＸＩＶ； ３４： ｔｙｐｅ ＸＶ； ３５： ｔｙｐｅ ＸＶＩ； ３６： ｔｙｐｅ ＸＶＩＩ； ３７： ｔｙｐｅ ＸＶＩＩＩ．
　
图 ３ Ｂｔ菌株芽孢和晶体形态的扫描电镜观察结果
Ｆｉｇ． ３ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｕｎｄｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ
Ｓ： 芽孢； Ｃ： 晶体； Ａ ～ Ｉ： 分别为 ７８⁃１、１１９８⁃１、ＦＴＬ８４、７８⁃３、２６１⁃１、ＦＣＤ１１４、Ｐ６５⁃１、１１２６⁃１ 及 １２７⁃２ 菌株。 Ｓ： Ｓｐｏｒｅｓ； Ｃ：
ｃｒｙｓｔａｌ； Ａ － Ｉ： ７８⁃１， １１９８⁃１， ＦＴＬ８４， ７８⁃３， ２６１⁃１， ＦＣＤ１１４， Ｐ６５⁃１， １１２６⁃１， ａｎｄ １２７⁃２ ｉｓｏｌａｔｅｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
　
示，Ｐ６５⁃１ 菌株扩增出 １ 个基因，与 Ｃｒｙ８Ｍａ１ 相似性 最高，氨基酸序列一致性为 ９４％ ；７８⁃２ 菌株扩增出 ２
８８４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
图 ４ Ｂｔ代表菌株杀虫晶体蛋白表达的 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ分析结果
Ｆｉｇ． ４ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｒｙｓｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｂｔ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ
Ｍ： 蛋白质分子量标准； １ ～ １７： 分别为菌株 ＨＢＦ１８、Ｐ６５⁃１、１１２６⁃１、１２７⁃２、７８⁃３、２６１⁃１、ＱＤ１４７、Ｓ１０Ａ２、Ｂ８Ｅ１２、Ｂｔ１８５、
ＳＵ４、ＦＣＤ１１、７８⁃２、１１９８⁃１、ＦＴＬ８４、ＱＤＬ４０、Ｂ８Ｅ１１ 的晶体蛋白。 Ｍ： Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ； １ － １７： ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｃｒｙｓｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＨＢＦ１８，
Ｐ６５⁃１， １１２６⁃１， １２７⁃２， ７８⁃３， ２６１⁃１， ＱＤ１４７， Ｓ１０Ａ２， Ｂ８Ｅ１２， Ｂｔ１８５， ＳＵ４， ＦＣＤ１１， ７８⁃２， １１９８⁃１， ＦＴＬ８４， ＱＤＬ４０ ａｎｄ Ｂ８Ｅ１１
ｉｓｏｌａｔｅｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
　
个基因，分别与 Ｃｒｙ８Ｃａ２ 和 Ｃｒｙ８Ａｂ１ 相似性最高，氨
基酸序列一致性分别为 ９９％和 ７９％ ；ＦＣＤ１１４ 菌株
扩增出 ２ 个基因，分别与 Ｃｒｙ８Ｇａ３ 和 Ｃｒｙ８Ｅａ１ 相似
性最高，氨基酸序列一致性分别为 ９９％ 和 ７９％ ；
１１２６⁃１ 菌株扩增出 ２ 个基因，分别与 Ｃｒｙ８Ｇａ３ 和
Ｃｒｙ８Ｅａ１ 相似性最高，氨基酸序列一致性分别为
９７％和 ８９％ 。 表明这 ４ 个菌株中分别含有第 ３ 或
者第 ４ 等级的新的 ｃｒｙ８ 基因。
图 ５ Ｂｔ菌株 ｃｒｙ８ 类基因的 ＰＣＲ⁃ＲＦＬＰ图谱分析
Ｆｉｇ． ５ ＰＣＲ⁃ＲＦＬＰ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｃｒｙ８⁃ｔｙｐｅ ｇｅｎｅｓ
ｆｒｏｍ Ｂｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ
Ｍ： ＤＮＡ分子量标准 ＤＬ２０００； １ ～ ７： 分别表示菌株
ＨＢＦ１８、ＳＵ４、ＢＴ１８５、７８⁃２、ＦＣＤ１１４、Ｐ６５⁃１、１１２６⁃１ 的 ＰＣＲ
产物经 Ｈｉｎｆ Ｉ 酶切后的电泳图谱。 Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ
ＤＬ２０００； １ － ７： ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＨＢＦ１８， ＳＵ４， ＢＴ１８５， ７８⁃
２， ＦＣＤ１１４， Ｐ６５⁃１， ａｎｄ １１２６⁃１ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｉｎｆ Ｉ．
　
２􀆰 ６ 大黑鳃金龟甲幼虫中肠病理切片观察
大黑鳃金龟甲幼虫中肠切片病理学观察结果显
示，未经 Ｂｔ侵染的对照组幼虫中肠肠壁细胞致密、
整齐，分布均匀（图 ６⁃Ａ、Ｂ）。 用对大黑鳃金龟甲幼
虫有活性的 ＨＢＦ１８ 菌株处理的幼虫，２ ｄ 后其中肠
肠壁细胞排列疏松，细胞明显出现空洞化（图 ６⁃Ｃ）；
４ ｄ后肠壁细胞受到严重破坏，并脱离底膜（图 ６⁃
Ｄ）。 无晶体突变株 ＨＤ７３ －处理组，幼虫中肠肠壁细
胞也排列整齐致密（图 ６⁃Ｅ、Ｆ）。 菌株 ２６１（图 ６⁃Ｇ）、
１１９８⁃１（图 ６⁃Ｈ）和 １１２６⁃１（图 ６⁃Ｉ）侵染 ２ ｄ 后，幼虫
中肠肠壁细胞排列较整齐，但细胞明显变形，并出现
少量空洞，而菌株 ＦＣＤ１１４（图 ６⁃Ｊ）和 ＱＤＬ４０⁃２（图
６⁃Ｋ）侵染 ２ ｄ 后，幼虫中肠肠壁细胞就开始排列疏
松，细胞变形严重，并出现较多空洞。 侵染 ４ ｄ 后，
菌株 ２６１（图 ６⁃Ｌ）、１１９８⁃１（图 ６⁃Ｍ）、ＦＣＤ１１４（图 ６⁃
Ｎ）、１１２６⁃１（图 ６⁃Ｏ）和 ＱＤＬ４０⁃２（图 ６⁃Ｐ）均能引起
幼虫中肠肠壁细胞严重变形，出现大量空洞，菌株
２６１（图 ６⁃Ｌ）甚至引起肠壁细胞严重破坏，排列杂
乱，无法辨认细胞形态，并脱离底膜，连同细胞内含
物向肠腔内移动。 而其它菌株 Ｐ６５⁃１、１２７⁃２、７８⁃３、
ＱＤＬ４７⁃１、Ｓ１０Ａ２、Ｂ８Ｅ１２、７８⁃２、ＦＴＬ８４、Ｂ８Ｅ１１ 侵染幼
虫后则未观测到明显的病变。
３ 讨论
蛴螬食性杂、生活环境多样、适应性强，是国内
外公认的难以防治的地下害虫（刘树森等，２００８）。
由于目前对大黑鳃金龟甲幼虫有活性的菌株资源相
对较少，为此，本研究以对大黑鳃金龟甲高效的 Ｂｔ
菌株为主要筛选目标，从实验室分离的 ５００ 株 Ｂｔ菌
株中，筛选到 ４２ 株对大黑鳃金龟甲幼虫有活性的菌
株，其中校正死亡率（１４ ｄ）在 ６０％以上的有 １０ 株。
这些菌株丰富了我国对蛴螬有效的 Ｂｔ菌株资源，为
高效杀虫基因的发掘和利用提供了材料，并为新的
Ｂｔ杀虫剂和转基因抗虫植物研发奠定了基础。
对具有应用价值的杀虫基因发掘并进行专利保
护已经成为目前 Ｂｔ 资源发掘的一个重要目的。 截
止到 ２０１５ 年 １２ 月，世界上已报道的 Ｂｔ 杀虫晶体蛋
白基因已达 ８１６ 个（Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ． ，２０１５）（ｈｔｔｐ： ／ ／
ｗｗｗ． ｌｉｆｅｓｃｉ． ｓｕｓｓｅｘ． ａｃ． ｕｋ ／ ｈｏｍｅ ／ Ｎｅｉｌ ＿ Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ／
Ｂｔ）。 从已公布的杀虫基因克隆分布来看，Ｂｔ 资源
地域性差别不明显，国家间很难利用资源地域性进
行竞争。 因此，Ｂｔ资源竞争的核心就是提高 Ｂｔ资源
９８４３ 期 王小奇等： 对大黑鳃金龟甲幼虫高效的苏云金芽胞杆菌筛选及 ｃｒｙ基因鉴定
图 ６ 大黑鳃金龟甲幼虫感染 Ｂｔ后中肠组织病理变化情况
Ｆｉｇ． ６ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ ｏｆ Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ ｏｂｌｉｔａ ｌａｒｖａｅ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｂｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ
Ａ ～ Ｂ：分别为对照 ｄｄＨ２Ｏ处理 ２、４ ｄ； Ｃ ～ Ｄ： ＨＢＦ１８ 处理 ２、４ ｄ； Ｅ ～ Ｆ： ＨＤ７３ －处理 ２、４ ｄ； Ｇ ～ Ｋ：分别为经菌株 ２６１、
１１９８⁃１、１１２６⁃１、ＦＣＤ１１４、ＱＤＬ４０⁃２ 处理 ２ ｄ； Ｌ ～ Ｐ： 分别为经菌株 ２６１、１１９８⁃１、１１２６⁃１、ＦＣＤ１１４、ＱＤＬ４０⁃２ 处理 ４ ｄ。 Ａ － Ｂ： ２，
４ ｄ ｗｉｔｈ ｄｄＨ２Ｏ； Ｃ － Ｄ： ２， ４ ｄ ｗｉｔｈ ＨＢＦ１８ ｉｓｏｌａｔｅ； Ｅ － Ｆ： ２， ４ ｄ ｗｉｔｈ ＨＤ７３ － ； Ｇ － Ｋ： ２ ｄ ｗｉｔｈ ２６１， １１９８⁃１， １１２６⁃１， ＦＣＤ１１４，
ａｎｄ ＱＤＬ４０⁃２ ｉｓｏｌａｔｅｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； Ｌ － Ｐ： ４ ｄ ｗｉｔｈ ２６１， １１９８⁃１， １１２６⁃１， ＦＣＤ１１４ ａｎｄ ＱＤＬ４０⁃２ ｉｓｏｌａｔｅｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
　
的发掘效率。 目前报道的基于 ｇｙｒＢ 基因序列扩增、
鞭毛抗原基因序列扩增、回文序列扩增图谱等 Ｂｔ多
样性分析方法达不到分析菌株之间差异的要求（Ｙｕ
ｅｔ ａｌ． ， ２００２； Ｘｕ ＆ Ｃôｔé， ２００８； Ｓｏｕｆｉａｎｅ ＆ Ｃôｔé，
２００９），Ｂｔ质粒图谱分析难以准确定量分析（Ｒｅｙｅｓ⁃
Ｒａｍíｒｅｚ ＆ Ｉｂａｒｒａ，２００８）。 鉴于此，本研究根据杀虫
基因序列的特性，利用可以扩增多种杀虫基因的简
并引物对菌株含有的基因片段进行扩增，进一步利
用菌株间杀虫基因种类和数量的差异产生的 ＲＦＬＰ
图谱多样性对菌株进行比较，结果表明筛选到的 ４２
株对大黑鳃金龟甲幼虫有活性的菌株属于 １４ 个不
同的菌株类型。 该方法操作简便，有利于去除冗余
菌株，节约成本与时间，有助于提高 Ｂｔ 杀虫基因的
发掘效率。
本研究通过进一步的菌株鉴定和序列测定，发
现 ４ 个菌株含有新的 ｃｒｙ８ 类基因，包括 ｃｒｙ８Ｍａ、
ｃｒｙ８Ｃａ、ｃｒｙ８Ａｂ、ｃｒｙ８Ｇａ、ｃｒｙ８Ｅａ 共 ５ 类，推测它们属
于第 ３ 或者第 ４ 等级的新基因，有待今后进一步克
隆验证。 而毒力最高、中肠也能产生病理变化却检
测不到任何 ｃｒｙ 基因的 ２６１⁃１ 菌株以及其它类似的
菌株 １１９８⁃１ 和 ＱＤＬ４０⁃２，可能含有其它全新的杀虫
蛋白，但利用常规的 ＰＣＲ等技术尚无法鉴定。 下一
步将尝试利用高通量全基因组测序等新的手段，来
发现和克隆这些菌株中可能含有的全新的杀虫蛋白
基因。
Ｂｔ杀虫晶体蛋白对敏感昆虫中肠引起的病理
学变化主要表现有：中肠细胞的液泡增加，细胞膨胀
变形，肠壁细胞出现明显的空泡化，最终细胞内含物
与细胞一起脱落于肠腔中 （ Ｅｎｄｏ ＆ Ｎｉｓｈｉｉｔｓｕｔｓｕｊｉ⁃
Ｕｗｏ，１９８０）。 宋健等（２００８）报道，感染 Ｂｔ后铜绿丽
金龟甲和黄褐丽金龟甲 Ａｎｏｍａｌａ ｅｘｏｌｅｔａ幼虫中肠肠
壁细胞内含物随着细胞最终脱落游离至肠腔。 本研
究也观察到，在感染 Ｂｔ后供试昆虫幼虫中肠肠壁细
胞排列疏松，细胞明显出现空洞化，细胞最终脱离底
０９４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
模等相似的病理学变化。 王志英等（１９９６）研究发
现，落叶松毛虫 Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｓｕｐｅｒａｎｓ 幼虫经 Ｂｔ 处理
后，在发病后期还感染除中肠外的其它许多组织；王
忠华等（２００２）也研究发现，转 Ｂｔ 基因水稻 ＫＭＤ２
的生米粉处理家蚕 Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ 后，其中肠内壁的
微绒毛明显稀疏而短小，柱状细胞和杯状细胞的线
粒体和粗面内质网数量也明显减少。 但本研究只进
行了光学切片的病理观察，存在一定不足，无法观测
到细胞内的超微结构以及其它器官的变化，今后将
利用透射电子显微镜来进一步观察。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
Ｂｉ Ｙ， Ｚｈａｎｇ ＹＲ， Ｓｈｕ ＣＬ， Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ Ｎ， Ｗａｎｇ ＱＬ， Ｄｕ ＬＸ， Ｓｏｎｇ
ＦＰ， Ｚｈａｎｇ Ｊ． ２０１５． Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｉｌ⁃
ｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｖｉｐ１ ／ Ｖｉｐ２ ｂｉｎａｒｙ ａｎｄ Ｃｒｙ８ ｔｏｘｉｎｓ ｔｈａｔ ｈａｖｅ
ｈｉｇｈ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｏ Ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａ ｌａｒｖａｅ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９９（２）： ７５３ － ７６０
Ｂｒａｖｏ Ａ， Ｌｉｋｉｔｖｉｖａｔａｎａｖｏｎｇ Ｓ， Ｇｉｌｌ ＳＳ， Ｓｏｂｅｒóｎ Ｍ． ２０１１． Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ： ａ ｓｔｏｒｙ ｏｆ ａ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｂｉｏｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ． Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏ⁃
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４１（７）： ４２３ － ４３１
Ｃｈｅｎ ＪＭ， Ｙｕ ＸＰ， Ｃｈｅｎ ＬＺ， Ｌü ＺＸ， Ｚｈｅｎｇ ＸＳ， Ｘｕ ＨＸ， Ｚｈａｎｇ ＪＦ．
２００４． Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ， ｄａｍａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｉｌ⁃ｄｗｅｌｌｉｎｇ ｐｅｓｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ
ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ Ｃｈｉｎａ． Ａｃｔａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ Ｚｈｅｊｉａｎｇｅｎ⁃
ｓｉｓ， １６（６）： ３８９ － ３９４ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［陈建明， 俞晓平， 陈列
忠， 吕仲贤， 郑许松， 徐红星， 张珏锋． ２００４． 我国地下害
虫的发生为害和治理策略． 浙江农业学报， １６（６）： ３８９ －
３９４］
Ｄｏｎｏｖａｎ ＷＰ， Ｄｏｎｏｖａｎ ＪＣ， Ｓｌａｎｅｙ ＡＣ． ２０００． Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
ｃｒｙＥＴ３３ ａｎｄ ｃｒｙＥＴ３４ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ： ＵＳ
６０６３７５６． ２０００ － ０５ － １６
Ｅｎｄｏ Ｙ， Ｎｉｓｈｉｉｔｓｕｔｓｕｊｉ⁃Ｕｗｏ Ｊ． １９８０． Ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ δ⁃ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ： ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｌｋ⁃
ｗｏｒｍ ｍｉｄｇｕｔ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ３６ （ １ ）：
９０ － １０３
Ｆｅｎｇ ＳＬ， Ｗａｎｇ ＲＹ， Ｆａｎ ＸＨ， Ｈｕ ＭＪ． ２０００． Ａ ｎｅｗ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｌａｒｖａｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃａｒａｂａｅｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ．
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ， １６（２）： ７４ － ７７ （ｉｎ Ｃｈｉ⁃
ｎｅｓｅ） ［冯书亮， 王容燕， 范秀华， 胡明峻． ２０００． 一株对金
龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株． 中国生
物防治， １６（２）： ７４ － ７７］
Ｉｂｒａｈｉｍ ＭＡ， Ｇｒｉｋｏ Ｎ， Ｊｕｎｋｅｒ Ｍ， Ｂｕｌｌａ ＬＡ． ２０１０． Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ： ａ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ． Ｂｉｏｅｎｇｉ⁃
ｎｅｅｒｅｄ Ｂｕｇｓ， １（１）： ３１ － ５０
Ｋｕｒｔ Ａ， Öｚｋａｎ Ｍ， Ｓｅｚｅｎ ＫＩ， Ｄｅｍｉｒｂａ ｇˇ Ｚ， Öｚｃｅｎｇｉｚ Ｇ． ２００５．
Ｃｒｙ３Ａａ１１： ａ ｎｅｗ Ｃｒｙ３Ａａ ｄｅｌｔａ⁃ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ ａ ｌｏｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２７ （ １５ ）：
１１１７ － １１２１
Ｌｉｕ ＳＳ， Ｌｉ ＫＢ， Ｙｉｎ Ｊ， Ｃａｏ ＹＺ． ２００８． Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｏｎ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｒｕｂｓ． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎ⁃
ｔｒｏｌ， ２４（２）： １６８ － １７３ （ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［刘树森， 李克斌， 尹
姣， 曹雅忠． ２００８． 蛴螬生物防治研究进展． 中国生物防
治， ２４（２）： １６８ － １７３］
Ｍａｏ ＪＹ， Ｓｈｕ ＣＬ， Ｌｉ ＫＢ， Ｌｉｕ ＣＱ， Ｌｉｎ Ｙ， Ｓｏｎｇ ＦＰ， Ｚｈａｎｇ Ｊ．
２０１１． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｔｈｅ ｌａｒｖａｅ ｏｆ ｃｏｃｋｃｈａｆｅｒｓ． Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ， ２７（２）： １７６ － １８１（ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［茅洁瑜， 束长龙， 李克斌， 刘春琴， 林毅， 宋福平， 张杰．
２０１１． 对蛴螬有活性的苏云金芽胞杆菌菌株的筛选与基因
鉴定． 中国生物防治学报， ２７（２）： １７６ － １８１］
Ｒｅｙｅｓ⁃Ｒａｍíｒｅｚ Ａ， Ｉｂａｒｒａ ＪＥ． ２００８． Ｐｌａｓｍｉｄ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎｓ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉ⁃
ｏｌｏｇｙ， ７４（１）： １２５ － １２９
Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ． Ｈｕａｎｇ ＰＴ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ． ２００２． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）． Ｂｅｉｊｉｎｇ： Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｐｒｅｓｓ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［萨姆布鲁克 Ｊ， 拉塞尔 ＤＷ． 黄培堂译．
２００２． 分子克隆实验指南（第 ３ 版）． 北京： 科学出版社］
Ｓｃｈｎｅｐｆ Ｅ， Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ Ｎ， ｖａｎ Ｒｉｅ Ｊ， Ｌｅｒｅｃｌｕｓ Ｄ， Ｂａｕｍ Ｊ， Ｆｅｉｔｅｌｓｏｎ
Ｊ， Ｚｅｉｇｌｅｒ ＤＲ， Ｄｅａｎ ＤＨ． １９９８． Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ
ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ ｃｒｙｓｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｒｅｖｉｅｗｓ， ６２（３）： ７７５ － ８０６
Ｓｈｕ ＣＬ． ２０１３． Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ
ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｇｅｎｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｐｈ． Ｄ Ｔｈｅｓｉｓ． Ｈａｒｂｉｎ： Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［束长龙． ２０１３． 苏云金
芽胞杆菌资源多样性分析与杀虫基因发掘． 博士学位论文．
哈尔滨： 东北农业大学］
Ｓｈｕ ＣＬ， Ｌｉｕ ＤＭ， Ｚｈｏｕ ＺＳ， Ｃａｉ ＪＬ， Ｐｅｎｇ Ｑ， Ｇａｏ ＪＧ， Ｓｏｎｇ ＦＰ，
Ｚｈａｎｇ Ｊ． ２０１３． Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＣＲ⁃ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ （ＲＦＬＰ） ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙ１⁃ｔｙｐｅ
ｇｅｎｅｓ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ７９ （ ２１ ）：
６７０６ － ６７１１
Ｓｈｕ ＣＬ， Ｌｉｕ Ｒ， Ｗａｎｇ Ｒ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ｆｅｎｇ Ｓ， Ｈｕａｎｇ Ｄ， Ｓｏｎｇ Ｆ．
２００７． Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｔｒａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｓ
ｔｈｅ ｃｒｙ８Ｃａ ｇｅｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ Ａｎｏｍａｌａ ｃｏｒｐｕｌｅｎｔａ ｌａｒｖａｅ． Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ５５（６）： ４９２ － ４９６
Ｓｈｕ ＣＬ， Ｙａｎ Ｇ， Ｗａｎｇ Ｒ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ｆｅｎｇ Ｓ， Ｈｕａｎｇ Ｄ， Ｓｏｎｇ Ｆ．
２００９ａ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｒｙ８ ｇｅｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ Ｍｅｌｏｌ⁃
ｏｎｔｈｉｄａｅ ｐｅｓｔｓ： Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ ｏｂｌｉｔａ ａｎｄ Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ ｐａｒａｌｌｅｌａ． Ａｐ⁃
ｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８４（４）： ７０１ － ７０７
Ｓｈｕ ＣＬ， Ｙｕ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｒ， Ｆｅｎ Ｓ， Ｓｕ Ｘ， Ｈｕａｎｇ Ｄ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ｓｏｎｇ
Ｆ． ２００９ｂ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｃｒｙ８ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌ⁃
ｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＢＴ１８５． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ５８（４）：
３８９ － ３９２
Ｓｏｎｇ Ｊ， Ｗａｎｇ ＲＹ， Ｄｕ ＬＸ， Ｃａｏ ＷＰ， Ｚｈａｎｇ ＨＪ， Ｗａｎｇ ＪＹ， Ｆｅｎｇ
ＳＬ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ｓｏｎｇ ＦＰ． ２００８． Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ Ａｎｏｍａｌａ ｃｏｒｐｕｌｅｎｔａ
ａｎｄ Ａ． ｅｘｏｌｅｔａ （Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ： Ｒｕｔｅｌｉｄａｅ） ｌａｒｖａｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｂｔ
ＨＢＦ⁃１ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｍｉｄｇｕｔｓ．
Ａｃｔａ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， ５１（１０）： １０８３ － １０８８ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［宋健， 王容燕， 杜立新， 曹伟平， 张海剑， 王金耀， 冯书
亮， 张杰， 宋福平． ２００８． 铜绿丽金龟和黄褐丽金龟幼虫感
１９４３ 期 王小奇等： 对大黑鳃金龟甲幼虫高效的苏云金芽胞杆菌筛选及 ｃｒｙ基因鉴定
染 Ｂｔ ＨＢＦ⁃１菌株后的病症及中肠组织病理变化． 昆虫学
报， ５１（１０）： １０８３ － １０８８］
Ｓｏｕｆｉａｎｅ Ｂ， Ｃôｔé ＪＣ． ２００９． Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇ⁃
ｉｅｎｓｉｓ Ｈ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ， ｓｅｒｏｖａｒｓ ａｎｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ １６Ｓ ｒＲＮＡ，
ｇｙｒＢ ａｎｄ ａｒｏＥ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｅｓ． Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ⁃
ｈｏｅｋ， ９５（１）： ３３ － ４５
Ｗａｎｇ ＺＨ， Ｓｈｕ ＱＲ， Ｃｕｉ ＨＲ， Ｘｕ ＭＫ， Ｘｉｅ ＸＢ， Ｘｉａ ＹＷ． ２００２．
Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｂｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｆｌｏｕｒ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｉｌｋ⁃
ｗｏｒｍ ｌａｒｖａｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｂ⁃ｍｉｃｒｏ⁃ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｉｔｓ ｍｉｄｇｕｔ． Ｓｃｉｅｎｔｉａ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ， ３５（６）： ７１４ － ７１８ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［王忠华，
舒庆尧， 崔海瑞， 徐孟奎， 谢小波， 夏英武． ２００２． Ｂｔ转基
因水稻米粉对家蚕生长发育及中肠亚显微结构的影响． 中
国农业科学， ３５（６）： ７１４ － ７１８］
Ｗａｎｇ ＺＹ， Ｙｕｅ ＳＫ， Ｊｉａ ＣＳ， Ｚｈａｎｇ ＹＬ， Ｗａｎｇ ＹＳ． １９９６． Ｈｉｓｔｏｐａ⁃
ｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｓｕｐｅｒａｎｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ⁃
ｓｉｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ２４（４）： ２２ － ２５
（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［王志英， 岳书奎， 贾春生， 张玉楼， 王延生．
１９９６． 苏云金杆菌感染落叶松毛虫的组织病理． 东北林业
大学学报， ２４（４）： ２２ － ２５］
Ｗｅｉ ＨＪ， Ｚｈａｎｇ ＺＬ， Ｗａｎｇ ＹＣ． １９８９． Ｃｈｉｎｅｓｅ ｓｏｉｌ ｐｅｓｔｓ． Ｓｈａｎｇｈａｉ：
Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ （ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［魏鸿
钧， 张治良， 王荫长． １９８９． 中国地下害虫． 上海： 上海科
学技术出版社］
Ｘｕ Ｄ， Ｃôｔé ＪＣ． ２００８． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
ｆｌａｇｅｌｌｉｎ （Ｈ ａｎｔｉｇｅｎ） ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｔｒａ⁃Ｈ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｌｅｖｅｌ． Ａｐ⁃
ｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ７４（１７）： ５５２４ － ５５３２
Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｔ， Ｔａｎａｋａ Ｍ， Ｈａｓｅｇａｗａ Ｍ． ２００４． Ｎｏｖｅｌ ｃｒｙ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ ｓｔｒａｉｎ Ｓｅｍａｄａｒａ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ⁃
ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ａｎｏｍａｌａ ｃｕｐｒｅａ ｌａｒｖａｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ８５（１）： ２５ － ３２
Ｙｕ Ｈ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ｈｕａｎｇ ＤＦ， Ｇａｏ ＪＧ， Ｓｏｎｇ ＦＰ． ２００６． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ⁃
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｔｒａｉｎ Ｂｔ１８５ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｔｈｅ Ａｓｉａｎ
ｃｏｃｋｃｈａｆｅｒ： Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ ｐａｒａｌｌｅｌａ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ５３
（１）： １３ － １７
Ｙｕ ＪＸ， Ｔａｎ Ｌ， Ｌｉｕ ＹＳ， Ｐａｎｇ Ｙ． ２００２． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂａ⁃
ｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｐｏｌｙｍｏｒ⁃
ｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ｆｌａｇｅｌｌｉｎ ｇｅｎｅｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４５（２）： １３９ －
１４３
Ｚｈａｎｇ Ｙ， Ｚｈｅｎｇ ＧＬ， Ｔａｎ ＪＸ， Ｌｉ ＣＹ， Ｃｈｅｎｇ ＬＹ． ２０１３． Ｃｌｏｎｉｎｇ
ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｒｙ８Ａｂ１ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｔｒａｉｎ Ｂ⁃ＪＪＸ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｏ ｓｃａｒａｂａｅｉｄ
（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ： Ｓｃａｒａｂａｅｉｄａｅ） ｌａｒｖａｅ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
１６８（８）： ５１２ － ５１７
（责任编辑：李美娟）
２９４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷