全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(6):81-86
收稿日期 ：2014-11-20
作者简介 ：刘毅，男，硕士，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：lewisbeyond@163.com
通讯作者 ：程池，男，教授级高级工程师，博士生导师，研究方向 ：食品工业微生物菌种资源管理与鉴定评估 ；
E-mail ：cheng100027@163.com
嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermop-
hilus）因所产芽孢无致病性、无热原、无毒，且对压
力蒸汽的抵抗力在大多数微生物中最强，已作为国
际质量控制标准菌株，成为验证湿热灭菌程序最常
用的生物指示剂指标菌［1，2］。然而，现在国际上通
用的标准指示菌株为 ATCC 7 953 株［3］，新发现的嗜
热脂肪地芽孢杆菌由于专利权的问题，就必须要与
其区分开。由于分子生物学菌种鉴定应用到的 16S
rDNA 基因鉴定、功能基因鉴定、多位点序列分析
（MLSA）等技术并不能精细到区分同一菌种的不同
菌株，所以，就需要借助 DNA 指纹图谱等细菌菌株
分型的方法。
目前用于细菌菌株分型的技术主要包括肠杆
菌基因间重复共有序列的聚合酶链式反应（ERIC-
PCR）、 细 菌 基 因 组 重 复 序 列 的 聚 合 酶 链 式 反 应
（BOX-PCR）以及随机扩增多态性 DNA（RAPD）等，
这些技术具有操作简便、方便快捷、区分度高、结
果重现性好等优点，被广泛应用于革兰氏阴性细菌
以及芽孢杆菌等菌株分型的研究。ERIC-PCR 技术
是 1991 年 Hulton 等及 Versalovic 等发明的长引物随
三种 DNA 指纹图谱技术在菌株分型中的应用
刘毅  姚粟  李辉  刘洋  刘勇  刘波  程池
（中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015）
摘 要 ： 旨在通过 ERIC-PCR、BOX-PCR、RAPD 等技术对 4 株地芽孢杆菌属菌株进行 DNA 指纹图谱分析，找到一种适合
于地芽孢杆菌属尤其是嗜热脂肪地芽孢杆菌的菌株分型方法。4 株地芽孢杆菌属菌株呈现出 4 种不同的指纹图谱，其中 ERIC-PCR
的方法获得的条带较为清晰，实验方法较为简便快捷，且能相对较好地区分不同株系 ；BOX-PCR 的方法得到的条带相对较少，不
能很好地区分同一种菌的不同株系 ；RAPD 的方法获得的条带相对较多，区分性更高，但同时也增加了一部分工作量和成本。3 种
菌株分型技术均能有效的区分地芽孢杆菌属菌株，其中 ERIC-PCR 是一种最有效最便捷区分嗜热脂肪地芽孢杆菌不同株系的方法。
关键词 ： 菌株分型 ；ERIC-PCR ；BOX-PCR ；RAPD ；嗜热脂肪地芽孢杆菌
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.012
Application of 3 DNA Fingerprinting Techniques in Strain
Identification
Liu Yi Yao Su Li Hui Liu Yang Liu Yong Liu Bo Cheng Chi
（China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，China Center of Industrial Culture Collection，Beijing 100015）
Abstract: Four strains of Geobacillus were analyzed with 3 DNA fingerprinting techniques of ERIC-PCR, BOX-PCR and RAPD
for searching the proper strain identification measure for the genus especially Geobacillus stearothermophilus. Each of 4 strains of G.
stearothermophilus had different fingerprint. The bands by simple and quick ERIC-PCR were quite clear, and the different strains could be
recognized clearly. The bands by BOX-PCR were less, and the strains of the same bacteria could not be recognized clearly. More bands could
be obtained by RAPD with higher identification ；however the workload of identification and cost increased significantly. Three techniques may
effectively identify the strains of Geobacillus, and ERIC-PCR is the most effective and fast method to identify strains of G. stearothermophilus.
Key words: strain identification ；ERIC-PCR ；BOX-PCR ；RAPD ；Geobacillus stearothermophilus
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.682
机 PCR 技 术（long primer RAPD，LP-RAPD）［4，5］。
由于 ERIC-PCR 引物碱基序列长、退火温度高，所
以相对于普通的 RAPD 技术，具有图谱稳定、重复
性高、对底物的序列差异敏感性高以及产生的图谱
多态性丰富等特点［7，8］。BOX-PCR 指纹图谱分析技
术，是根据 BOX 插入因子设计引物，扩增微生物基
因组 DNA 的重复性片段，补充散布的重复序列，使
不同大小的 DNA 片段与位于这些片段之间的序列
得到扩增，最后经琼脂糖凝胶电泳检测其多态性的
一种微生物鉴定方法［9］。与其它指纹图谱技术相比
较，BOX-PCR 的操作更为简便快捷，容易获得较为
丰富的扩增条带，且不需要菌株的特异性 DNA 探
针［11，12］。随机放大多态性 DNA（random amplified
polymorphic DNA，RAPD） 是 1990 年，Williams 根
据 RFLP 法 研 究 分 子 标 记 时 提 出 的［15］。RAPD 技
术是基于 PCR 的 DNA 多态性分析方法，以非限制
性的随机寡核苷酸链为引物。由于目的基因组序列
DNA 通常都是很长的大分子 DNA，寡核苷酸引物有
足够的机会随机与模板 DNA 同源碱基配对结合，延
伸扩增两个紧邻结合点间的 DNA 片段，扩增的片
段与目的基因组有同源序列［16］。相对于限制性内切
酶片段长度多态性（RFLP）、扩增片段长度多态性
（AFLP）以及核糖体 DNA 扩增片段限制性内切酶分
析（ARDRA）等技术，RAPD 方法更简便、快捷，
借助泳带微机分析，可同时鉴别大批量的同群下的
种内标本，使之更具有可比性［17，18］。本研究拟通过
ERIC-PCR、BOX-PCR、RAPD 等技术对 4 株地芽孢
杆菌属菌株进行 DNA 指纹图谱分析，旨在找到一种
适合于地芽孢杆菌属尤其是嗜热脂肪地芽孢杆菌的
菌株分型方法。
1 材料与方法
1.1 材料
实验使用的菌种为 ATCC 7953 株、ATCC 12980
株、CICC 21091 株、CICC 10853 株。
其 中，ATCC 7953 株、ATCC 12980 株 和 CICC
21091 株均为嗜热脂肪地芽孢杆菌，但其芽孢具有
不同的耐热抗性。CICC 10853 株是热噬地芽孢杆菌。
菌种分别来源于 ATCC 和 CICC。
TSB 成品培养基，购自 OXOID 公司 ；分子生物
学试剂购自 TIANGEN 公司 ；PCR 引物由北京诺赛
生物公司合成。
1.2 方法
1.2.1 菌体富集 将 TSA 斜面保存的菌种用接种环
接种至 TSB 液体培养基中，将 TSB 培养基置于 55℃
摇床中，220 r/min 转速摇瓶培养 24 h 。取 1.5 mL 培
养之后的种子液，加入 1.5 mL 离心管中，用高速离
心机以 8 000 r/min 转速离心，弃上清液收集菌体。
1.2.2 基因组 DNA 提取 用 200 μL 无菌超纯水悬
浮菌体之后，加入 10 μL 溶菌酶处理 40 min 以上。
使用 CTAB 法提取细菌基因组 DNA，具体步骤如
下 ：加入 1.5 mL TE 离心洗涤后，用 567 μL TE 溶解
菌体，混匀。加入 30 μL 10% SDS 和 3 μL 20 mg/mL
的蛋白酶 K（100 μg/mL），混匀，于 37℃温育 1h。
加入 100 μL 5 mol/L NaCl，充分混匀，再加入 80 μL
CTAB/NaCl，混匀，65℃温育 10 min。加入等体积
的氯仿∶异戊醇（24∶1）（0.8 mL），混匀，12 000 r/min
离心 5 min，保留上清。上清中加入等体积的酚∶氯
仿∶异戊醇（25∶24∶1）（0.8 mL），混匀，12 000
r/min 离心 5 min，保留上清。加入 0.6 倍的异丙醇
（0.48 mL），轻轻混合直到 DNA 沉淀下来（0.5 h），
12 000 r/min 离心 15 min，收集 DNA 沉淀，用 75%
乙醇（1 mL）1 2000 r/min 离心 5 min 洗涤 DNA 沉淀，
真空干燥 0.5 h。用 50 μL 双蒸水溶解 DNA，加入终
浓度为 20 μg/mL RNaseA，4℃保存。用 0.6% 琼脂
糖凝胶电泳鉴定提取的 DNA ，每孔点样 6 μL（4 μL
样品 + 2 μL loading buffer），80 V，电泳 1.5 h。
1.2.3 引物与 PCR 扩增体系 3 种 DNA 指纹图谱的
方法均采用通用引物，引物序列见表 1。
其 中 ERIC-PCR 使 用 的 PCR 体 系 为 ：10× 扩
增缓冲液 2.5 μL ；25 mmol/μL MgCl2 溶液 2 μL ；2.5
表 1 引物序列
DNA 指纹图谱方法 引物（5-3）
ERIC-PCR ERIC1 ：ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC
ERIC2 ：AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG
BOX-PCR BoxA1R ：CTACGGCAAGGCGACGCTGACG
RAPD OPA-02 ：TGCCGAGCTG
OPA-18 ：AGGTGACCGT
OPL-07 ：AGGCGGGAAC
OPL-16 ：AGGTTGCAGG
OPM-05 ：GGGAACGTGT
2015,31(6) 83刘毅等：三种 DNA指纹图谱技术在菌株分型中的应用
mmol/L dNTP 混合液 2 μL ；20 pmol/L ERIC1 引物 0.5
μL ；20 pmol/L ERIC2 引 物 0.5 μL ；模 板 DNA 40-
80 ng ；加 水 至 25 μL。BOX-PCR 使 用 的 PCR 体 系
为 ：10× 扩 增 缓 冲 液 2.5 μL ；25 mmol/μL MgCl2 溶
液 2 μL ；2.5 mmol/L dNTP 混 合 液 2 μL ；20 pmol/L
BoxA1R 引物 1 μL ；模板 DNA 40-80 ng ；加水至 25
μL。RAPD 使用的 PCR 体系为：10× 扩增缓冲液 2.5
μL ；25 mmol/μL MgCl2 溶 液 2 μL ；2.5 mmol/L dNTP
混合液 2 μL ；20 pmol/L RAPD 引物 1 μL ；模板 DNA
25 ng ；加水至 25 μL。
1.2.4 DNA 指纹图谱 PCR 程序 ERIC-PCR 的 PCR
反 应 程 序 ：95 ℃ 预 变 性 7 min ；94 ℃ 变 性 1 min，
52℃退火 1 min，65℃延伸 8 min，30 个循环 ；65℃
再次延伸 16 min。
BOX-PCR 的 PCR 反 应 程 序 ：95 ℃ 预 变 性 7
min ；94℃变性 1 min，40℃退火 1 min，65℃延伸 8
min，30 个循环 ；65℃再次延伸 16 min。
RAPD 的 PCR 反 应 程 序 ：95 ℃ 预 变 性 5 min ；
94℃变性 1 min，30℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，
45 个循环 ；72℃再次延伸 10 min。
1.2.5 琼脂糖凝胶电泳 以 3 μL 缓冲液为负载，将
10 μL PCR 扩增混合物于 2% 琼脂糖凝胶（含 0.2%
的 gold view 染料）进行电泳（300 V/h），使用 1×TAE
作为电泳缓冲液。
1.2.6 核酸条带的观察 电泳结束后，用凝胶成像
仪观察凝胶的核酸条带，比对不同泳道的条带分布，
分析实验结果。
2 结果
2.1 基因组DNA提取的电泳结果
4 株菌的基因组 DNA 提取结果（图 1）显示，
所提取的 DNA 片段均约为 23 kb，表明 4 株菌的基
因组 DNA 提取效果好，且 4 株菌基因组 DNA 大小
基本一致。
2.2 ERIC-PCR扩增产物的电泳结果
如图 2 所示，ERIC-PCR 扩增产物的电泳条带
明亮清晰，每条泳带代表一株细菌的 ERIC-PCR 指
纹图谱，不同位置的条带代表该株细菌基因组 DNA
被扩增出来的不同片段，条带的多少代表了不同菌
株被该种引物扩增出来的片段多少，条带的带型代
表了不同菌株之间的相似程度，即两条泳带之间越
是相似，两株菌的亲缘关系就越近。结果（图 2）
表明，ATCC 7953 株的泳带与 ATCC 12980 的泳带
之间，在 2 000 bp 以上的位置有一个条带的明显差
异，因而该种方法可以作为同种不同株菌株的区分；
ATCC 7953 株的泳带与 CICC 21091 株的泳带基本一
致，无肉眼可见的差异，推测两株菌为同一菌株的
传代 ；ATCC 7953 株与 CICC 10853 株泳带差异十分
明显，说明两株菌的进化地位差异较大，因而，该
种方法应用于地芽孢杆菌属不同种菌株的区分也是
可行的。
bp
M 1 2 3 4
23130
9416
6557
6361
2322
M ：DNA Marker ；1 ：ATCC 7953 ；2 ：ATCC 12980 ；
3 ：CICC 21091 ；4 ：CICC 10853
图 1 基因组 DNA 电泳图谱
bp
M C 1 2 3 4
2000
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker ；C ：control（空白）；1 ：ATCC 7953 ；2 ：ATCC 12980 ；
3 ：CICC 21091 ；4 ：CICC 10853
图 2 ERIC-PCR 产物电泳图谱
2.3 BOX-PCR扩增产物的电泳结果
如图 3 所示，BOX-PCR 扩增产物的电泳条带明
亮清晰，条带大都集中在 500 bp 和 1 000 bp 附近，
因为条带显色后的荧光强度比较大，所以在这个区
间内扩增产物的量比较大。由于条带均比较集中，
所以展开效果和区分度并不高。结果（图 3）表明，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.684
CICC 10853 株与其它 3 株菌的条带差异明显，因而，
该方法适用于地芽孢杆菌属不同种之间的区分，同
时，ATCC 7953 株、ATCC 12980 株 和 CICC 21091
株这 3 株菌的条带基本一致，所以，该方法在区分
同一菌种的不同株型方面存在一定的局限性。
法使用了 5 种不同的短引物来进行随机扩增，所以
条带更多，因而区分度就更好。结果（图 4）表明，
CICC 10853 株在 5 种引物的扩增产物中，均与其它
3 株菌条带差异较大，因而该方法同样适用于地芽
孢杆菌属不同种的区分 ；在 OPA-02 引物扩增的图
谱中，ATCC 7953 株与 ATCC 12980 株在 1 800 bp 附
近有一个条带的明显差异，在 OPA-18 引物扩增的
图 谱 中，ATCC 7953 株 与 ATCC 12980 株 在 600 bp
附近有一个条带的明显差异，在 OPL-16 引物扩增
的图谱中，ATCC 7953 株与 ATCC 12980 株在 750 bp
附近有一个条带的明显差异，在 OPM-05 引物扩增
的图谱中，ATCC 7953 株与 ATCC 12980 株在 1 000
bp 附近有一个条带的明显差异，所以这些引物都可
以很好地区分这两株菌，但在 OPL-07 引物扩增的图
谱中，ATCC 7953 株与 ATCC 12980 株条带基本一致，
无 肉 眼 可 见 差 异 ；同 时，CICC 21091 株 与 ATCC
7953 株在 5 中引物扩增图谱中的条带基本一致，因
而，仍然无法区分这两株菌。
通 过 以 上 实 验 结 果 可 以 看 到，ERIC-PCR 和
RAPD 两种方法均能有效用于地芽孢杆菌属菌株的
bp
M C 1 2 3 4
2000
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker ；C ：control（空白）；1 ：ATCC 7953 ；2 ：ATCC 12980 ；
3 ：CICC 21091 ；4 ：CICC 10853
图 3 BOX-PCR 产物电泳图谱
2.4 RAPD扩增产物的电泳结果
如图 4 所示，RAPD 扩增产物的电泳条带均清
晰明亮，条带丰富且分子量范围较广。由于该种方
bp
MA B
D E
CC1 2 3 4
2000
1000
750
500
250
100
bp
M C 1 2 3 4
2000
1000
750
500
250
100
bp
M C1 2 3 4
2000
1000
750
500
250
100
bp
M C 1 2 3 4
2000
1000
750
500
250
100
bp
M C 1 2 3 4
2000
1000
750
500
250
100
引物分别为 ：A ：OPA-02 ；B ：OPA-18 ；C ：OPL-07 ；D ：OPL-16 ；E ：OPM-05。M ：DNA Marker ；
C ：control（空白）；1 ：ATCC 7953 ；2 ：ATCC 12980 ；3 ：CICC 21091 ；4 ：CICC 10853
图 4 RAPD 产物电泳图谱
2015,31(6) 85刘毅等：三种 DNA指纹图谱技术在菌株分型中的应用
分型，两种方法综合印证了 ATCC 7953 株与 ATCC
12980 株 不 是 同 一 株 菌， 而 ATCC 7953 株 与 CICC
21091 株 属 于 同 一 株 菌。ERIC-PCR、BOX-PCR 和
RAPD 3 种方法均能有效区分 ATCC 7953 株和 CICC
10853 株这两株不同种的菌株。
3 讨论
ERIC-PCR、BOX-PCR 和 RAPD 3 种 DNA 指 纹
图谱方法均是基于 PCR 扩增技术的菌株分型方法，
具有方便快捷、检测限低、区分度高、可重复性强
等优点。而地芽孢杆菌属的菌株均是从温泉、火山
等高温环境中生存的菌株，属于革兰氏阳性菌，细
胞壁非常厚，因而，使用传统的脉冲场凝胶电泳
（PFGE）等方法就会有一定的局限性。DNA 指纹图
谱的方法就能很好的解决这个问题，不但时间短，
而且容易得到较好结果，在地芽孢杆菌属菌株的分
型中具有重要意义。
通过 3 种 DNA 指纹图谱方法的对比发现，在比
较地芽孢杆菌属菌株不同株系的过程中，ERIC-PCR
的方法获得的条带明亮清晰，试验方法简便快捷，
且能较好的区分不同株系，容易得到结果，是一种
有效区分地芽孢杆菌属菌株不同株系的方法 ；BOX-
PCR 的方法得到的条带相对较少，不能很好的区分
同一种菌的不同株系，因而不适合于地芽孢杆菌属
菌株的株系分析 ；RAPD 的方法获得的条带相对较
多，区分性更高，但同时也增加了一部分工作量和
成本，即便如此，也没有将 CICC 21091 株和 ATCC
7953 株这两株菌区分开。
地芽孢杆菌属菌株在压力蒸汽灭菌的效果监测
方面具有十分重要的地位，为了保证该种菌在株水
平上的多样性，同种不同株菌的开发尤为重要。这
就需要借助分子生物学手段对不同菌株进行区分，
尤其是 DNA 指纹图谱技术，应用于地芽孢杆菌属菌
株的分型，效果良好，对于地芽孢杆菌属菌株的分
型有极为重要的作用。
由于地芽孢杆菌属菌株命名的历史比较短，所
以，有关于属内菌种的分子生物学研究较少，从而
DNA 指纹图谱的引物只能使用通用引物或者常用引
物，这可能会影响到试验的准确性。在以后的研究中，
应当在对地芽孢杆菌属菌种基因组全面了解的基础
上，进一步开发专用于地芽孢杆菌属菌株株系分析
的引物。
4 结论
ERIC-PCR、BOX-PCR 和 RAPD 3 种 DNA 指 纹
图谱方法均可以应用于地芽孢杆菌属不同种的区分；
在同一菌种不同株系的区分方面，通过 3 种方法的
比较发现，ERIC-PCR 是一种简便快捷有效区分地芽
孢杆菌属菌株不同株系的方法。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）