全 文 ：第 25卷第 6期
2005年 6月
生 态 学 报
ACTAECOLOGICASINICA
Vol.25,No.6
Jun.,2005
污染土壤中有机磷农药降解菌的分离及其多样性
张瑞福,吴旭平,樊 奔,何 健,蒋建东,李顺鹏*
(南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室,南京 210095)
基金项目:国家"十五"攻关资助项目(2002BA516A01);国家"863"资助项目(2003AA241150);国家自然科学基金资助项目(30400014)
收稿日期:2004-02-07;修订日期:2005-01-10
作者简介:张瑞福(1974～),男,山东人,博士,主要从事土壤与环境微生物研究。E-mail:zhangruifu@263.net
*通讯作者 Authorforcorrespondence.E-mail:lsp@njau.edu.cn
Foundationitem:TheNational"TenthFive-yearPlan"KeyTechnologiesProgramme(No.2002BA516A01);TheNational863Programme(No.
2003AA241150);theNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30400014)
Receiveddate:2004-02-07;Accepteddate:2005-01-10
Biography:ZHANGRui-Fu,Ph.D.,mainlyengagedinsoilandenvironmentalmicrobiology.E-mail:zhangruifu@263.net
摘要:采用添加有机磷农药的选择性培养基,在长期受有机磷农药污染的土壤中分离到 7株有机磷农药降解菌,经生理生化鉴
定和系统发育分析,菌株 mp-1鉴定为 Pseudaminobactersp.,菌株 mp-2为 Alcaligenessp.,菌株 mp-7为 Brucellasp.,其他菌
株为 Ochrobactrumsp.。16SrDNA序列同源性比较、系统发育分析和染色体 ERIC-PCR指纹图谱扩增表明有机磷农药长期污
染的土壤中有机磷农药降解菌具有丰富的多样性。
关键词:有机磷农药;降解菌;系统发育;ERIC-PCR指纹图谱;多样性
文章编号:1000-0933(2005)06-1502-07 中图分类号:Q16,Q93,S154.1,X171 文献标识码:A
Diversityoftheorganophosphatepesticide-degradingbacteriaisolatedfrom
organophosphatepesticidepollutedsoil
ZHANGRui-Fu,WUXu-Ping,FANBen,HEJian,JIANGJian-Dong,LIShun-Peng* (KeyLaboratoryof
MicrobiologicalEngineeringAgriculturalEnvironment,MinistyofAgriculture,NanjingAgric.Univ.,Nanjing210095,China).Acta
EcologicaSinica,2005,25(6):1502～1508.
Abstract:Sevenorganophosphatepesticide-degradingbacteria,namelymp-1tomp-7,wereisolatedfrom along-term
organophosphatepesticide-contaminatedsoilusingselectiveculturemediumwithorganophosphatepesticideasthesolecarbon
andenergysource.Comparativestudieswereperformedontheirmorphological,physiologicalandbiochemicalcharacteristics.
ThegenomicDNAofthesevenbacteriawasextractedbythemethodofhigh-salt-concentrationprecipitationandtheir16S
rDNAwasamplifiedwiththebacterialuniversalprimers.Theamplifiedproductswerepurifiedandthe1.5kbfragmentswere
ligatedintothepMD18-Tplasmidvector.RecombinantplasmidsweretransformedintocompetentE.coliDH5αcels,andthe
insertedfragmentsweresequenced.The16SrDNA sequenceswerecomparedandthesimilaritiesbetweenthem were
calculated,whichrangedfrom76.31% to99.79%,displayingawidediversityoforganophosphatepesticide-degradingbacteria
inthiscontaminatedsoil.16SrDNAsequenceswerealsocomparedwiththosefromGenBankusingBlastsoftwarepackageand
phylogenetictreewasconstructedusingPHYLIP.Basedonthephylogeneticanalysisandphysiologicalandbiochemical
characteristics,strainsmp-1,mp-2andmp-7belongedtothegenusofPseudaminobactersp.,Alcaligenessp.,andBrucella
sp.,respectivelywhilealotherstrainsweremembersofOchrobactrumsp.Noorganophosphatepesticide-degradingbacterium
hasbeenreportedfromthesegenera.
Thebiodiversityofthesevenorganophosphatepesticide-degradingbacteriawerealsorevealedbycomparingtheirgenomic
ERIC-PCR(enterobacterialrepetitiveintergenicconsensus)fingerprints.EachofthemhasdistinctiveERIC-PCRfingerprint.
Thisworkfurthersourunderstandingofthedegradingabilityofindigenousmicroorganismsinthecontaminatedsoil
environment,andprovidesthefoundationtostudytheecologyoforganophosphatepesticide-degradingbacteriaandthe
disseminatedmechanismoftheorganophosphatehydrolasegene
===================================================================
.
Keywords:organophosphatepesticides;degradingbacteria;phylogeneticanalysis;ERIC-PCRfingerprofiles;diversity
在长期受农药污染的土壤中存在各种能够降解这些化合物的微生物种群。在过去的研究工作中,各国学者已从阿特拉津,
2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)以及芳香族类化合物污染土壤中分离到了许多各种不同来源的降解菌[1～4],说明微生物在长期适应
异生物质(xanobiotics)过程中能够产生种类繁多的降解菌。
有机磷杀虫剂是一类应用十分广泛的农药,它们的环境效应及其修复技术越来越受到关注。生物修复尤其是微生物对有机
污染物的降解具有广泛的应用前景。研究污染环境中污染物原位降解菌的多样性对于评价污染物的环境毒理、生物可降解性
以及污染环境的自净能力和修复潜力具有重要参考价值。
本文选取长期受有机磷农药污染的土壤,研究土壤中有机磷农药降解菌的多样性,丰富了有机磷农药污染土壤修复的微生
物材料。
1 材料与方法
1.1 菌株、培养基与试剂
EscherichiacoliDH5α为本实验室保存;pMD18-TVector购自大连宝生物公司(TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.
Ltd);氨苄青霉素(Amp)购自南京创瑞公司;PCR引物委托大连宝生物公司(TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.Ltd)合成;
DNA回收试剂盒购自 promega公司;培养基配制参照文献[5]。
1.2 降解菌的驯化分离
有机磷农药污染土壤取自山东某有机磷农药生产厂周围农田,取污染土壤 1.0g,置于 100ml富集培养基中,加入 100mg/L
的甲基对硫磷,30℃,120r/min培养一周,取 1ml适当稀释后涂布含有 100mg/L的甲基对硫磷的牛肉蛋白胨平板,降解菌能够
水解甲基对硫磷生成对硝基苯酚在平板上产生黄色的水解圈[6],挑取产生水解圈且形态不同的菌落分别纯化并保存。
1.3 降解菌的培养特征及生理生化鉴定
降解菌的鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》和《Bergeysmanualofdeterminativebacteriology》(ninthedition)进行。
1.4 降解菌的 16SrDNA序列的测定
(1)菌体总 DNA的提取 菌体总 DNA的提取采取 SDS高盐沉淀法[7]。
(2)降解菌 16SrDNA的 PCR扩增 引物:5’端引物为 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3(Escherichiacolibases8to
27)[8],3’端引物为 5-TACCTTGTTACGACTT-3(Escherichiacolibases1507to1492)[9]。扩增反应体系为:10×Taq聚合酶
反应缓冲液 5µl,dNTP(20mmol/L)5µl,5’端引物(25pmol/µl)2µl,3’端引物(25pmol/µl)2µl,Mg2+(25mmol/L)6µl,菌体 DNA
(约 50ng/µl)1µl,TaqDNA聚合酶(5U/µl)0.5µl,H2O28.5µl,总体积 50µl。反应条件为:首轮循环 94℃变性 2min;再接 94℃
30s,50℃30s,72℃1min,30个循环;最后 72℃延伸 20min。
(3)PCR产物的 T/A克隆 纯化回收的 1.5kb16SrDNA扩增片段与 pMD18-TVector(TaKaRaBiotechnology(Dalian)
Co.Ltd)按 2:1的摩尔比混合,在 T4连接酶作用下,16℃过夜。酶连体系为:pMD18-TVector(TaKaRaBiotechnology(Dalian)
Co.Ltd)1µl,PCR产物 4µl,LigationSolution(含 T4DNAligase)5µl,总体积 10µl。
(4)DH5α感受态细胞制备与酶连产物的转化 DH5α感受态细胞制备与酶连产物的转化参照文献[10]进行。
(5)16SrDNA的序列测定 经质粒提取确证有正确外源插入片段的转化子,以 pMD18-T载体上的通用引物作为测序引
物测序。委托大连宝生物公司(TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.Ltd)测序。
1.5 降解菌系统发育地位的确定与系统发育关系的研究
16SrDNA序列用 blast软件与 GenBank数据库中的 16SrDNA序列进行同源性比较。同源序列或降解菌的 16SrDNA序
列利用 ClustalX软件进行多序列比对并生成 PHYLIP格式文件,利用 PHYLIP软件包中的 Seqboot软件,选择 bootstrap分
析,复制数为 1000,生成一个具有 1000套比对序列的文件,然后运行 Dnadist软件,选择 Kimura双参数模型,"M"项改为多重
数据组分析,数目为 1000,运行后生成包含 1000个距离矩阵的文件,利用 Neighbor软件选择 Neighbor-joining方法获得系统
数,最后运行 consense软件获得严格一致树,Treeview软件查看生成的进化树。
1.6 降解菌 ERIC-PCR指纹图谱的扩增
5’端引物:5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’;3’端引物:5’-AAGTTAGTGACTGGGGTGAGCG-3’[11]。反应体
系:10×Taq聚合酶反应缓冲液 5µl,dNTP(20mmol/L)4µl,5’端引物(25pmol/µl)2µl,3’端引物(25pmol/µl)2µl,Mg2+
(25mmol/L)3µl,菌体 DNA(约 50ng/µl)2µl,TaqDNA聚合酶(5U/µl)0.5µl,H2O31.5µl,总体积 50µl。反应条件为:95℃预变
性 5min;再接 94℃ 10s,92℃ 40s,49℃ 8s51.5℃ 1min,72℃ 5min,35个循环;最后 72℃延伸 10min。
1.7 降解菌 16SrDNA序列 NCBI登录号
30516期 张瑞福 等:污染土壤中有机磷农药降解菌的分离及其多样性
降解菌 16SrDNA序列 NCBI登录号见表 1。
表 1 降解菌 16SrDNA序列 NCBI登录号
Table1 Accessionnumbersofthe16SrDNAsequences
登录号
菌株 Strain
mp-1 mp-2 mp-3 mp-4 mp-5 mp-6 mp-7
Accessionnumber AY331575 AY331576 AY331577 AY331578 AY331579 AY331580 AY331581
2 结果分析
2.1 污染土壤中有机磷农药降解菌的分离
分离到 7株有机磷农药降解细菌,分别编号为 mp-1到 mp-7,它们都能在含有有机磷农药甲基对硫磷的牛肉膏蛋白胨培养
基上产生水解圈(图 1),电子透射显微镜照片见图 2。
图 1 降解菌在含甲基对硫磷平板上的照片
Fig.1 Theplatephotographofthedegradingbacteria
2.2 降解菌的培养形态特征
所分离降解菌的培养形态特征总结于表 2,菌体形状主要为
杆状和短杆状,在相同的丰富培养基长到最大收获量时,其菌体
大小有差异,菌株 mp-1的颜色和菌株 mp-2的鞭毛着生方式与
其他菌株不同。
2.3 生理生化特征
七株降解菌的生理生化特征见表 3,从表中可知,所分离的
七株降解菌都是革兰氏阴性菌,这说明本研究所取的污染土壤
中,革兰氏阴性降解菌是占优势的。它们生理生化等特征存在多
样性。在葡萄糖氧化和发酵实验中,菌株 mp-2既不能氧化葡萄
糖也不能发酵葡萄糖,经进一步实验证明,菌株 mp-2不能利用
葡萄糖做碳源生长。
图 2 降解菌的电镜照片(19000倍)
Fig.2 Theelectronicphotographofthedegradingbacteria
2.4 降解菌的总 DNA提取和 16SrDNA的 PCR扩增
用 SDS高盐法提取了 7株降解菌的总 DNA(图 3),以细菌 16SrDNA通用引物通过 PCR扩增出降解菌 1.5kb的 16S
rDNA片段(图 4)。PCR产物经纯化回收后,连接到 pMD18-T载体上测序。
2.5 降解菌 ERIC-PCR指纹图谱
在肠道细菌中发现的 ERIC序列(EnterobacterialPepetitiveIntergenicConsensus,肠杆菌基因间的重复共有序列)是保守
的反向重复序列,定位于基因组内可转录的非编码区域或与转录有关的区域[11]。后来证明这种序列在许多微生物中存在。以染
色体 DNA为摸板做 ERIC-PCR后凝胶电泳分析结果表明,不同细菌菌株具有非常特征的条带,可以作为一种对细菌基因组进
行指纹鉴定的有力工具并被广泛应用于细菌分类和菌种鉴别上[12,13]。本研究中降解菌ERIC-PCR指纹图谱(图 5)特征明显,重
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复性好,能够应用于细菌分类和菌种鉴别。
表 2 降解菌的培养形态特征
Table2 Theculturecharactersofsevendegradingbacteria
形态特征
Morphologicalproperty
菌株 Strain
mp-1 mp-2 mp-3 mp-4 mp-5 mp-6 mp-7
菌体形状
Celfigure
杆状
Rod
杆状
Rod
杆状
Rod
杆状
Rod
杆状
Rod
杆状
Rod
杆状
Shortrod
大小 Size
(长×宽(L×W))
1.39×0.52 1.84×0.89 1.63×0.82 1.58×0.79 1.55×0.87 1.47×0.74 1.39×0.53
菌落颜色
Colonycolor
微黄色
Yelow
乳白
Milk-white
乳白
Milk-white
乳白
Milk-white
乳白
Milk-white
乳白
Milk-white
乳白
Milk-white
菌落形状
Colonyfigue
圆形
Round
圆形
Round
圆形
Round
圆形
Round
圆形
Round
圆形
Round
圆形
Round
菌落边缘
Colonymargin
整齐
Tidiness
整齐
Tidiness
整齐
Tidiness
整齐
Tidiness
整齐
Tidiness
整齐
Tidiness
整齐
Tidiness
鞭毛
Flagelum
周生
Peritrichous
一根端生
Polar
周生
Peritrichous
周生
Peritrichous
周生
Peritrichous
周生
Peritrichous
周生
Peritrichous
运动性
Motility
运动
Move
运动
Move
运动
Move
运动
Move
运动
Move
运动
Move
运动
Move
表 3 降解菌的生化特征
Table3 Thebiochemistrycharactersofsevendegradingbacteria
生化特征
Biochemistrycharacters
菌株 Strain
mp-1 mp-2 mp-3 mp-4 mp-5 mp-6 mp-7
革兰氏染色 Gramstain - - - - - - -
氧化酶 Oxidase ++ +a ++ +a ++ ++ ++
接触酶 Catalase ++ ++ +a +a ++ ++ ++
乙醇氧化 Ethanoloxidation - - + + + + +
淀粉水解 Starch - - - - - - -
葡萄糖氧化 Glucoseoxidation 产酸 Acid - 产酸 Acid 产酸 Acid 产酸 Acid 产酸 Acid 产酸 Acid
葡萄糖发酵 Glucosefermentation - - - - - - -
石蕊牛乳反应 Litmusmilktest Ab Bc Cd C B B B
V.P反应 V.Ptest + + + + + + +
吲哚反应 Indoletest - - - - - - -
a 弱阳性 Littlepositive;b 凝乳酶凝固 Clabber;c 胨化 Peptone;d 酸凝固 Acid
图 3 菌株总 DNA电泳图
Fig.3 AgarosegelelectrophorsisoftotalDNA
A.λDNA/HindⅢ marker;B.strainmp-1;C.strainmp-2;D.strain
mp-3;E.strainmp-4;F.strainmp-5;G.strainmp-6;H.strainmp-7
图 4 菌株 16SrDNA电泳图
Fig.4 Agarosegelelectrophoresisof16SrDNA
A.DL2000marker;B.strainmp-1;C.strainmp-2;D.strainmp-3;
E.strainmp-4;F.strainmp-5;G.strainmp-6;H.strainmp-7
2.6 降解菌系统发育定位
50516期 张瑞福 等:污染土壤中有机磷农药降解菌的分离及其多样性
图 5 菌株 ERIC-PCR电泳图
Fig.5 ERIC-PCRprofilesofthedegradingstrains
A.DL2000marker;B.strainmp-1;C.strainmp-2;D.strainmp-3;
E.strainmp-4;F.strainmp-5;G.strainmp-6;H.strainmp-7
降解菌 16SrDNA序列用 blast软件与 GenBank数据库中
的 16SrDNA序列进行同源性比较。同源序列或降解菌的 16S
rDNA序列利用 PHYLIP软件包中程序生成降解菌及其相近类
群的系统发育进化树(图 6)。从系统发育进化树可以看出,在系
统发育上 mp-1和 mp-2分别来源于相距较远的类群,而 mp-3
到 mp-7这 5株菌发育地位相距很近。
2.7 7株有机磷农药降解菌的 16SrDNA序列同源性矩阵
降解菌 16SrDNA序列用 ClustalX软件进行两两比较序列
同源性,菌株之间的序列同源性列于表 4,从表中可知,菌株之间
的 16SrDNA序列同源性范围从 76.31%到 99.79%,其中 mp-
1,mp-2与其它菌的 16SrDNA序列的相似性小于 97%,而 mp-
3,mp-4,mp-5,mp-6和 mp-7之间的 16SrDNA序列的相似性
均大于 97%,推测 mp-1和 mp-2分别属于不同的属而 mp-3到
mp-7这 5株菌可能属于相近或相同的属[14],但这 5株菌的
ERIC-PCR指纹图谱之间有明显的区别,说明它们之间存在一
定的差异[12,13],显示了在本研究的污染土壤中,为适应污染环境而产生降解能力的菌株在系统发育基因型上具有较为广泛的
多样性。
表 4 降解菌 16SrDNA序列的相似性距阵
Table4 Thesimilaritymatrixof16SrDNA
菌株 Strain mp-1 mp-2 mp-3 mp-4 mp-5 mp-6 mp-7
mp-1 100
mp-2 77.36 100
mp-3 93.48 76.54 100
mp-4 93.39 76.40 99.58 100
mp-5 93.41 77.35 98.02 98.24 100
mp-6 93.33 77.15 97.95 98.17 99.79 100
mp-7 93.48 76.31 98.52 98.67 97.45 97.37 100
表左下角是相似性值(%)Thefigueintablearesimilarityvalue
2.8 降解菌的鉴定结果
根据降解菌的生理生化鉴定和 16SrDNA系统发育定位,将分离到的 7株有机磷农药降解菌在属水平上的分类地位确定
为表中所示(表 5)。其中 mp-3,mp-4,mp-5和 mp-6鉴定为 Ochrobactrumspp.,mp-1,mp-2和 mp-7属于不同的属,这与它们
之间的 16SrDNA序列相似性及发育型相吻合。虽然 mp-7与 mp-3,mp-4,mp-5和 mp-6之间的 16SrDNA序列相似性大于
97%,但从系统发育进化树上发现 Ochrobactrum和 Brucella是在发育地位上非常相近的两个属,只有再结合菌的形态特征和
生理生化特征,才能将 mp-7鉴定为 Brucellasp.。
表 5 降解菌的分类地位
Table5 Taxaofthesevendegradingbacteria
菌株 Strain
属 mp-1 mp-2 mp-3 mp-4 mp-5 mp-6 mp-7
Genera Pseudaminobacter Alcaligenes Ochrobactrum Ochrobactrum Ochrobactrum Ochrobactrum Brucella
3 讨论
有机污染物释放到环境中,必定会对环境中的微生物群落产生影响,持续的污染使得有的微生物种群数量减少以至被淘
汰,有的则适应污染环境而成为优势群。环境微生物群落在长期适应污染的过程中必定会产生种类繁多的污染物降解菌。
2001年,Rousseaux等[15]从 10个土样中,采用富集的方法分离到 25株可以降解阿特拉津的菌株。被归为 5种ARDRA型。
通过 16SrDNA测序和系统发育分析。这些分离株分别属于革兰氏阴性的 Helatobacterheintzi、Aminobacteraminovorans、
Strenotrophomonasmaltophilia和革兰氏阳性的 Arthrobactercrystallopoietes。Ka等[16,17]研究了施用过 2,4-D的土壤中 2,4-D
降解菌的遗传和表型多样性,他们分离到 47株降解 2,4-D的优势菌株,采用 FAME谱图分析、染色体 REP-PCR分析等,研究
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了降解菌的多样性。迄今为止,从 Chromobacter、Alcaligenes、Arthrobacter、Corneybacterium、Flavobacterium、Pseudomonas和
Streptomyces等属中分离到了降解 2,4-D的菌株。结合本研究的结果,证明许多化学农药污染的土壤中存在着种类丰富的降解
性微生物,这是环境中污染物去除的重要因素之一。
图 6 降解菌的系统发育地位
Fig.6 Thephylogeneticpositionofthedegradingbacteria
CuiZhongli[6]等曾分离到 1株Plesiomonas属的甲基对硫磷降解菌,刘智[18]和陈亚丽[19]分别分离到 1株Pseudomonas属的
甲基对硫磷降解菌,Serdar[20]等分离了对硫磷降解菌 Pseudomonas.diminuta,Mulbry[21]等分离了 1株对硫磷降解菌
Flavobacterium.spATCC27551。本研究首次报道了从 Pseudaminobacter属、Alcaligenes属、Brucella属和 Ochrobactrum属分离
到有机磷农药降解菌,从而大大丰富了有机磷农药降解菌的多样性。
本研究所分离到的降解菌为研究有机磷农药的环境毒理、生物可降解性提供了材料同时丰富了可应用于有机磷农药污染
土壤修复的微生物资源。
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8051 生 态 学 报 25卷