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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
根 瘤 菌（Rhizobia） 因 其 具 有 的 共 生 固 氮 能
力，被视为一大类重要的微生物资源。该类细菌
大多可以和豆科植物的根，少数可以和豆科植物
的茎形成一种具有固氮能力的有效器官——根瘤
（root nodules），在这里还原大气中的 N2 转化为氨
（NH3），供其宿主利用。但是随着人们研究的深入，
发现根瘤菌对人类的益处不仅仅在固氮这一方面，
收稿日期 ：2012-10-10
基金项目 ：北京市教委基金项目（KM200510082008）
作者简介 ：单辉辉，男，硕士研究生，研究方向 ：细菌分类 ；E-mail ：shanhui517@gmail.com
通讯作者 ：韩素贞，女，副教授，研究方向 ：微生物分类 ；E-mail ：hansuzhen99@vip. sina.com
两株藏南地区土壤根瘤菌分类地位的确定
单辉辉  李正  韩素贞
（首都师范大学生命科学学院，北京 100048）
摘 要 ： 通过多相分类技术对分离自藏南地区土壤的两株根瘤菌进行了分类地位的确定。两株菌 CNU8561007 与
CNU85000012 均为革兰氏阴性、好氧的杆状细菌。通过表型特征分析发现二者在多项生理指标上表现一致，由于两菌株来源于
不同的地理位置，二者在表型特征上也存在少许差异。经过比较 16S rDNA 序列发现，两供试菌株的序列相似性为 100%，并且与
Rhizobum yanglingense，R.loessense，R.mongolense，R.gallicum 表现出了极高的相似性，4 种看家基因 atpD，recA，glnII 和 danK 的
系统发育分析与 16S rDNA 序列分析的结果相吻合，一致显示与两供试菌株遗传距离最近的模式种为 Rhizobum yanglingense，通过
DNA 同源性分析和 DNA G+C mol% 测定，最终将这两菌株归入到 Rhizobum yanglingense 中，两菌株在 BOX 指纹图谱上的差异表明
了它们为同种内的不同菌株。
关键词 ： 根瘤菌 16S rDNA 看家基因 DNA 杂交 BOX-PCR
The Determination of the Taxonomic Status of Two Soil Rhizobia from
Southern Tibet
Shan Huihui Li Zheng Han Suzhen
（College of Life Science，Capital Normal University，Beijing 100048）
Abstract:  Polyphasic taxonomy was adopted to determine the taxonomic status of two soil rhizobia from southern Tibet. Two Gram-
negative, aerobic, rod-shaped bacteria, designated strains CNU8561007 and CNU85000012. The morphological studies demonstrated that the two
test strains had similar features. The slight features differences between CNU8561007 and CNU85000012 might be related to the fact that they
were isolated from different geographic regions. According to comparison of 16S rRNA gene sequences, strains CNU8561007 and CNU85000012
were identical and their closest phylogenetic relatives were Rhizobum yanglingense, R.loessense, R.mongolense and R.gallicum. Phylogenetic
analysis based on four housekeeping genes（recA, atpD, glnII, and danK）which were in broad agreement with 16S rRNA gene sequence
similarities indicated that the two isolates were closely related to Rhizobum yanglingense. The DNA G + C mol% and DNA -DNA hybridization
provided supporting evidence that the two test strains belongs to the Rhizobum yanglingense and the BOX-PCR fingerprint profiles demonstrating
that the two isolates were not clones of one strain.
Key words:  Rhizobia 16S rDNA Housekeeping genes DNA-DNA hybridization BOX-PCR
Dakora［1］报道了根瘤菌产生的一些化学物质存留在
土壤中，对后来种植的植物体（包括豆科和非豆科
作物）具有促进生长，提高产量的生物学作用。另
外，根瘤菌在抵御重金属污染［2］，有害化学物质的
降解方面也有重要功效［3］。正因如此，根瘤菌分类
及应用性研究一直是科研领域里的研究热点和重点。
多相分类技术自从被 Colwell［4］提出以来一直是细菌
2013年第4期 159单辉辉等 ：两株藏南地区土壤根瘤菌分类地位的确定
包括根瘤菌在内的主要的分类方法［5，6］，该分类方
法要求提供表型（包括化学分类特征），基因型，系
统发育这 3 方面的综合信息，对细菌恰当的分类地
位给出一个整体而全面的描述。
菌 株 CNU8561007 与 CNU85000012 由 西 藏 地
区土壤中分离得到，经过 16S rDNA PCR-RFLP 分
析发现二者与根瘤菌属（Rhizobium）中的相关参比
菌株聚在一个组群中，而且这两株菌的相似度非常
高。本研究以这两株供试菌株为试验材料，综合运
用了包括表型分析，16S rDNA 序列分析，4 种不同
的看家基因如 ：atpD（ATP 合成酶基因），recA（编
码一种在 DNA 重组修复中起作用的酶基因），glnII
（编码谷氨酸合成酶Ⅱ基因），danK（编码分子伴侣
蛋白 danK 的基因）的系统发育分析，DAN 同源性
分析，DNA G+C mol% 测定，BOX 指纹图谱分析在
内的多种分类方法对供试菌株确切的分类地位进行
确定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 CNU8561007 和 CNU85000012 分
别由取自西藏山南乃东县及拉萨地区的土样中分离
得到，后经 16S rDNA PCR-RFLP 分析得出这两株供
试菌株属于 Rhizobium。
1.1.2 培养基 YMA 培养基［7］：甘露醇 10.0 g，K2-
HPO4 0.25 g，KH2PO4 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，
NaCl 0.10 g，酵母粉 3.0 g，琼脂粉 15.0 g，蒸馏水
1 000 mL，pH6.8 -7.0，15 磅（0.1 MPa）灭菌 30 min。
1.1.3 主 要 试 剂 及 相 关 仪 器 SDS、Tris、 盐 酸、
NaOH、EDT-ANa2、氯仿、异戊醇、异丙醇、NaAc
和无水乙醇、NaCl 等均为国产分析纯，溶菌酶、蛋
白 酶 K、RNase、DNAMarker 和 2×Taq PCR Green Mix
均购自鼎国生物公司。Eppendorf 的 Mastercycler Pe-
rso-nal PCR ；杂 交 仪 ：Lambda35 UV/VIS Spectrome-
ter，PTP-l 温度控制仪，循环水浴等。
1.2 方法
1.2.1 菌落及菌体的形态观察 对供试菌株 CNU-
8561007 和 CNU85000012 进行革兰氏染色，于光学
显微镜下观察菌体形态、大小，在 YMA 平板上观察
72 h 菌龄的菌落形态特征。
1.2.2 生理生化特征的测定 本研究主要对两供
试菌株以及根瘤菌属模式种 R.leguminosarum USDA
2970T 进行了包括 pH、盐浓度和温度耐受性、唯一碳、
氮源的利用、硝酸盐还原、肉汤生长、过氧化氢酶
试验、抗生素抗性以及对染料和化学物质的耐受性
等试验在内的 70 多项表性特征的测定。所用试验的
方法参照文献［8，9］。
1.2.3 16S rDNA 序列分析
1.2.3.1 小量 DAN 模板的制备 菌体的培养及小量
DNA 模板的制备参见文献［10］。
1.2.3.2 基因的扩增测序及同源性分析 16S rDNA
的扩增选用的正向引物为 fD1 ：（5-CCCGGGATCC
AAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3），反向引物是
rD1 ：（5-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCC-
TGGCTCAG-3）［11］，引物由上海生工生物公司合成。
50 μL 的 反 应 体 系 由 下 列 物 质 组 成 ：2×Taq PCR
Green Mix（0.1 u/μL Taq DNA聚合酶，2×反应缓冲液，
3 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTPs）25 μL，DNA
模板 1 μL（约 100 ng），引物 fD1（10 μmol/L）1 μL，
引物 rD1（10 μmol/L）1 μL，去离子水补充到 50 μL。
反应的程序参见文献［12］。PCR 的产物经 1% 的
琼脂糖凝胶电泳检测，扫描电泳图后直接送交上海
生工生物公司进行测序，测序所用的引物与序列扩
增时所用引物相同。将测序所得序列通过 NCBI 进
行 Blast 序列比对分析，并在 GenBank 数据库中下
载相关的模式菌株的基因序列用于系统发育树的构
建。所有这些序列通过 MEGA5.0 中的 ClustalW 进
行多序列比对，系统发育树采用临接法（neighbor
joining method），模型选用 Kimura two-parameter 通过
MEGA5.0 加以构建，通过自展值（Bootstrap）1 000
进行置信度检测。同时序列间的相似性也通过该软
件加以计算，所选模型同样是 Kimura two-parameter。
1.2.4 四种看家基因的序列分析
1.2.4.1 小量 DAN 模板的制备 扩增看家基因所用
的模板与扩增 16S rDNA 所用模板的制备方法相同。
1.2.4.2 基因的扩增测序及同源性分析 本试验选
取了 4 种不同的看家基因 atpD，recA，glnII，danK
来 进 行 序 列 分 析 及 系 统 发 育 研 究。atpD，recA，
glnII 和 danK 4 种基因的正反引物序列分别是 atpD
255F 和 atpD 782R，recA 41F 和 recA 640R，glnII
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期160
12F 和 glnII 689R，引物序列详见文献［13］，以及
dnaK1466F 和 dnaK1777R，引物序列详见文献［14］。
所用引物均由上海生工生物公司合成。扩增看家基
因的 PCR 反应体系与 16S rDAN 扩增时所用体系除
所加引物做相应的改变之外，其他的物质均不变。
atpD 基因扩增时的反应条件是 ：95℃预变性 5 min ；
94℃变性 1 min，56℃复性 1 min，72℃延伸 1 min，
总共进行 30 个循环 ；最后在 72℃条件下保持 5 min
进行最终延伸，该程序是在 Vinuesa 等［13］提出的程
序基础上稍作修改得到的。recA 和 glnII 两基因的退
火温度分别调整为 54℃和 52℃，其他的反应条件
均与 atpD 的扩增条件相同。danK 基因 PCR 的反应
条件见文献［15］。看家基因 PCR 的扩增产物经 1%
的琼脂糖凝胶电泳检测，并扫描电泳图后直接送交
上海生工生物公司进行测序，测序所用的引物与序
列扩增时所用引物相同。对于序列的分析比对，系
统发育树的构建及遗传距离的计算等方法均与处理
16S rDNA 的方法相同。
1.2.5 DNA G+C mol% 测 定 与 DNA 杂 交 DNA 的
大量提取主要参照文献［16，17］中所提供的方法，
采用热变性温度法［18］来测定 G+C mol% 含量。采用
复性速率法［18］来进行 DNA-DNA 杂交。
1.2.6 BOX 指纹图谱分析 BOX-PCR 所用的模板与
扩增 16S rDNA 所用模板相同，以 BoxAIR 为引物进
行选择扩增，引物序列为 ：5-CTACGGCAAGGCGA-
CGCTGACG-3［19］。25 μL 的反应体系由以下物质组
成：DNA 模板 1 μL（约 100 ng），0.5 μL BOXA1R（50
pmol/L），12.5 μL 的 2×Taq PCR Green Mix，加去离
子水补充到 25 μL。反应条件为 95℃预变性 7 min，
94℃变性 1 min，52℃复性 1 min，65℃延伸 8 min，
共进行 30 个循环 ；65℃最终延伸 18 min。BOX-PCR
产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离，70 V，2-3 h，
紫外下扫描得到电泳图像。
2 结果
2.1 菌体及菌落形态
两株菌的菌落形态呈圆形，边缘整齐，呈半透
明的乳白色，表面隆起而光滑，在 YMA 培养基上生
长 3 d 后菌落直径可达 2-3 mm，菌体均为革兰氏阴
性，杆状（1.3 μm×2.5 μm），好氧，不产生芽孢见图 1。
A B
A ：CNU8561007 ；B ：CNU85000012
图 1 菌株的革兰氏染色的显微镜照片
2.2 菌株的表性特征
菌 株 CNU8561007 和 CNU85000012 的 pH 生 长
范 围 是 6.0-10.0， 最 适 的 pH 生 长 范 围 是 6.5-7.0，
盐的耐受性较差，不能在 NaCl 含量为 1% 的培养基
上生长，最适的生长温度为 28℃。两菌株可以利用
多种碳氮源，主要包括 ：葡萄糖、D-棉子糖、蔗糖、
丙酮酸钠、L-阿拉伯糖、D-山梨醇、麦芽糖、D-木
糖、L-苯丙氨酸及 L-胱氨酸等，具有硝酸还原能力
和过氧化氢酶的活性，并对刚果红和脱氧胆酸钠有
抗性，对青霉素的抗性较强，可以在青霉素含量为
100 μg/mL 的培养基上生长。两测试菌株与标准菌株
R.leguminosarum USDA 2970T 之间的生理生化特征存
在一些差异，并且在两菌株之间也存在表型特征的
不一致现象，详细的表型特征数据参见表 1。
2.3 16S rDNA的系统发育分析
两菌株 16S rDNA 的扩增片段大小约为 1 500
bp（图 2-A）。经过测序分别得到大小为 1 420 bp
（CNU8561007） 和 1 440 bp（CNU85000012） 的 两
条序列，序列的长度接近 16S rDNA 的全长，经过
NCBI 在线比对以后发现，二者与根瘤菌属内的相
关物种亲缘关系较为密切。从 GenBank 中下载相关
模式菌株的 16S rDNA 序列构建系统发育树见图 3，
从系统发育树中可以看出，两供试菌与 Rhizobum
yanglingense，R.loessense，R.mongolense，R.gallicum
的亲缘关系最近，它们共同处在了一个独立的系统
发育分支上（Bootstrap 值为 96%）。两测试菌株的
16S rDNA 序列的相似性高达 100%，而与同群的 4
株模式菌株的序列相似性依次为 99.92%，99.92%，
99.62%，99.62%。
2013年第4期 161单辉辉等 ：两株藏南地区土壤根瘤菌分类地位的确定
表 1 R.leguminosarum USDA 2970T 与菌株 CNU8561007、CNU85000012 主要的生理生化特征
测试指标 1 2 3 测试指标 1 2 3
菊糖 - - - 次黄嘌呤 + + -
海藻糖 + - - L-天冬氨酸 + + -
葡萄糖 + + + D-缬氨酸 - - -
D-棉子糖 + + + L-异亮氨酸 + + -
蔗糖 + + + L-赖氨酸 + - +
L-苏氨酸 - - - 刚果红 + + +
丙酮酸钠 - + + 俾士麦棕 - - -
L-阿拉伯糖 + + + 龙胆紫 - - -
D-果糖 + + + 中性红 - - -
乙酸钠 + - - 澡红 B - - +
L-鼠李糖 + + - 亚甲基蓝 - - -
乙二酸 - - - 溴百里酚蓝 - - -
水杨苷 + + - 脱氧胆酸钠 + + +
D-山梨醇 + + + 亚硝酸钠 - - +
酒石酸钠 - - - 过氧化氢酶 + + +
柠檬酸钠 - - + 肉汤生长 + - +
D-半乳糖 + - + 硝酸盐还原 - + +
乳糖 + + - 盐浓度的耐受 <1% <1% <1%
麦芽糖 + + + 生长 pH 的范围 6-9 6-10 6-10
D-木糖 + + + 生长温度范围 10-40℃ 10-40℃ 10-40℃
淀粉 + - - 红霉素 ≤（5 μg/mL） ≤（5 μg/mL） ≤（5 μg/mL）
D-葡萄糖酸钠 + - - 卡那霉素 - ≤（5 μg/mL） ≤（5 μg/mL）
DL-丙氨酸 - - + 新霉素 - - -
L-苯丙氨酸 + + + 青霉素 ≤（50 μg/mL） ≤（100 μg/mL） ≤（100 μg/mL）
L-胱氨酸 + + + 庆大霉素 - - -
L-精氨酸 + + - 四环素 - - -
1 ：R.leguminosarum USDA 2970T ；2 ：CNU8561007 ；3 ：CNU85000012
3000
bp
M 1 2
1500
1000
A
500
1 2
F
3000
bp
M 1 2
1000
E
500
300
3000
bp
M 1 2
1000
B
500
3000
bp
M 1 2
1000
C
500
3000
bp
M12
1000
750
D
500
M ：DNA Maker ；1 ：菌株 CNU8561007 ；2 ：菌株 CUN86000012
图 2 16S rDNA（A）、recA（B）、atpD（C）、 gln II（D）、danK（E）基因的扩增结果及 BOX-PCR（F）的电泳图谱
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期162
2.4 看家基因的系统发育分析
测试菌株的 atpD、recA 、glnII 和 danK 基因扩
增产物的片段大小依次约为 530、600、680 和 300
bp（图 2）。利用测序所得结果与从 GenBank 数据
库中下载的相关模式菌株的相应看家基因序列分
别构建系统发育树，结果见图 4。从 atpD 和 recA
基因的系统发育树中可以看出，二者具有相似的
拓 扑 结 构， 菌 株 CNU8561007 和 CNU85000012 与
其 近 邻 种 Rhizobum yanglingense，R.loessense，R.m-
ongolense，R.gallicum 处在了一个系统发育分支上
（Bootstrap 值为 99%）。通过计算序列相似值得出，
菌 株 CNU8561007 和 CNU85000012 的 相 似 性 高 达
99.77%（atpD） 和 100%（recA）， 与 Rhizobum yan-
glingense 相似性为 97.46%（atpD）和 98.01%（recA），
与 R.loessense 相 似 性 为 96.71%（atpD） 和 95.42%
（recA）， 与 R.mongolense 相 似 性 为 96.95%（atpD）
和 96.21%（recA）， 与 R.gallicum 相 似 性 为 96.95%
（atpD） 和 96.73%（recA）。glnII 基 因 的 系 统 发 育
分析结果显示，测试菌株与 Rhizobum yanglingense，
R.mongolense，R.gallicum 这 3 株模式菌聚在了一个
独立的系统发育分支上，模式菌 R.loessense 的 glnII
基因序列未能获得（GeneBank 数据库没有该基因
序 列 ），CNU8561007 与 CNU85000012 的 相 似 性 为
99.79%， 与 以 上 3 株 菌 的 相 似 性 依 次 为 98.06%，
96.73%，97.18%。从 danK 基因的系统树中可以看
出，两测试菌株与模式菌株 R.mongolense，R.gallicum
处 在 了 一 个 独 立 的 系 统 发 育 分 支 上，R.loessense
和 Rhizobum yanglingense 两 菌 株 的 danK 基 因 序
列未能获得（GenBank 数据库没有该基因序列），
CNU8561007 与 CNU85000012 的 相 似 性 为 100%，
与菌株 R.mongolense 和 R.gallicum 的相似性分别为
96.38%，97.13%。
2.5 DNA G+C mol% 测定与DNA 杂交
菌株 CNU8561007 和 CNU85000012 的 G+C mol%
分别为 58.5% 和 59.1%，处在了根瘤菌属（Rhizob-
um）57-66 mol% 的范围内［20］，两菌株 CNU8561007
和 CNU85000012 之间的 DAN 杂交值为 75.9%，菌
株 CNU8561007 与 Rhizobum yanglingense SH22623T
之间的 DNA 杂交值为 65.2%，两杂交值基本达到了
种内菌株间的相关性水平［21］。
2.6 BOX指纹图谱
通过对两测试菌株 BOX-PCR 指纹图谱（图 2-F）
的比较观察，可以发现两株菌间具有较为明显的
差异。
68
57
Rhizobium sp. CUN8561007
Rhizobium sp. CUN85000012
R. loessense CCBAU 7190BAF364069
R. mongolense USDA 1844U89817
R. yanglingense SH 22623TAF00337
R. gallicum R 602spTU86343
R. indigoferae CCBAU 71042TAF364068
R. sullael S 123TY10170
R. tibeticum CCBAU 85039TEU256404
R. endophyticum CCGE 2052TEU867317
R. alamil GBV 016TAM931436
R. mesosinicum CCBAU 25010TDQ100063
R. huautlense S 02TAF025852
R. galegae ATCC 43677TD11343
B. japonicum USDA 6TX66024
79
88
96
82
93
99
99
99
99
0.01
81
Bootstrap 值大于 57 的标示在分支处 ；方框部分为供试菌株 ；以 Bradyrhizobium japonicum USDA 6T 为外类群菌株
图 3 以 16S rDNA 构建的系统发育树
2013年第4期 163单辉辉等 ：两株藏南地区土壤根瘤菌分类地位的确定
3 讨论
自 Worse［22］提出以 16S rDNA 作为细菌进化的
分子钟以来，16S rDNA 因具有功能保守，大小适中
且进化速率相对稳定等优点，作为一种良好的分子
标记在原核生物分类及系统学研究中得到了广泛的
应用［11，23］，同时，该基因在根瘤菌分类领域的应
用也是相当普遍［24，25］，人们的研究发现 16S rDNA
序列的保守性过高，往往不能用来区分亲缘关系较
近的种［26，27］。在本研究中，试验菌株 CNU8561007
和 CNU85000012 的 16S rDNA 序列与其相近的 4 个
模式种的相似性非常高（都在 99% 以上），几乎看
不出差别，因此难以判断待测菌株准确的分类地位。
Stackebrandt 等［28］提出一个种的 16S rDAN 的同源性
应大于 97%。但是，也有人研究发现不同种的菌株
之间 16S rDNA 的序列相似性甚至高达 100%［29， 30］。
为了解决上述问题，人们开始积极寻找其他可用于
系统学研究的分子标记，编码蛋白的看家基因由于
具有一定的保守性，分布于染色体的不同位点，进
化速率较快于 16S rDAN，因此多个功能保守的基因
序列开始作为选择性的系统发育标记应用在根瘤菌
Bootstrap 值大于 50 的均标示在树的分支处 ；分别以 Bradyrhizobium japonicum USDA 6T 为外类群菌株
图 4 四种看家基因所构建的系统发育树
recA atpD
glnII danK
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期164
的分类当中［15，31，32］。本研究发现，看家基因 atpD、
recA 、glnII 和 danK 构 建 的 系 统 发 育 树 比 以 16S
rDNA 所建系统发育树有更好的分辨率，可以把菌株
CNU8561007、CNU85000012 与其近邻的 4 种做较好
地区分，保守基因序列构建的系统发育树与以 16S
rDNA 构建的系统发育树基本一致，仅个别种之间的
亲缘关系在各树中略有不同，通过上述 5 种保守基
因（包括 16S rDAN 在内）的系统发育分析一致得出
Rhizobum yanglingense 是与两测试菌株亲缘关系最近
的已知种。
DAN-DAN 同源性分析存在着诸多的缺点，包
括操作耗时长，工作量大，重复性差，试验手法各异，
杂交结果难以建立统一的数据库等［33］。虽然 DNA
同源性分析具有上述缺点，但是到目前为止 DNA-
DNA 杂交在细菌种属鉴定上的重要定位依然稳固，
该技术仍然是建立新属种必做的试验指标。国际细
菌学委员会规定，细菌种内的 DNA-DNA 的杂交值
在 70% 或 70% 以上 ［21］，该指标对于细菌种的确定
起着决定性的作用。本研究通过 DAN 杂交证实了菌
株 CUN8561007 和 CNU85000012（杂交值为 75.9%）
为同种，菌株 CUN8561007 与 Rhizobum yanglingense
SH22623T 的 杂 交 值 高 达 65.2%， 加 之 两 者 的 16S
rDNA 以及各看家基因的序列相似性均在 97% 以上，
于 是 将 菌 株 CUN8561007 和 CNU85000012 鉴 定 为
Rhizobum yanglingense。本研究为了排除两菌株为同
一克隆的可能性，进行了 BOX-PCR 指纹图谱分析，
BOX 指纹图谱分析是区分种下菌株间差异的有效方
法［34，35］，试验结果显示两株菌间存在着较为明显的
差异。生理生化性状的测定对于菌种的描述有着重
要意义，同时对于大量表型特征的测定可以将亲缘
关系较近的物种区分开，在本研究中发现测试菌株
CUN8561007 和 CNU85000012 之间存在着一些明显
的表型差异，其差异的产生可能源于两菌株的地理
来源不同，表型上的差异更加证明了两待测菌株非
单一克隆。
当今人们已经步入了基因组时代，从第一株细
菌 Haemophilus influenzae［36］全基因组成功测序以来，
随着测序技术的改进及测序成本的逐渐降低，越来
越多的原核生物全基因组被测序完成。用于原核
生物分类的遗传信息全部包含在其基因组内［21， 32］，
Konstantinidis 和 Tiedje［37］将一种新的依赖基因组信
息 的 重 要 参 数 ANI（average nucleotide identity） 引
入到了原核生物分类领域。人们通过大量试验研究
发现，两基因组间的 ANI 值约为 95%-96% 时可以
与 70% 的 DNA-DNA 杂交值形成较好的对应关系，
因此人们预言 ANI ≈ 95%-96% 这一标准将会取代
DNA-DNA 杂交值成为界定细菌种的标准［38，39］。全
基因组测序克服了 DNA 杂交的诸多缺点，但是还不
能在短期内取代 DAN-DAN 杂交技术在细菌分类中
的地位，不过随着全基因组测序技术在细菌分类领
域的全面应用，原核生物基因组数据库的进一步完
善，不久的将来 DAN-DAN 杂交极可能会被测序技
术所取代。
4 结论
本研究利用多相分类技术对两株藏南地区土壤
根瘤菌 CUN8561007 和 CNU85000012 的分类地位进
行了确定 ：两供试菌株 CUN8561007 和 CNU850000-
12 为已知模式种 Rhizobum yanglingense 内的两个不
同 菌 株， 定 名 为 Rhizobum yanglingenseCNU8561007
和 Rhizobum yanglingenseCNU85000012。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）