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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):138-142
拟 穴 青 蟹（Scylla paramamosain） 隶 属 于 节 肢
动 物 门（Arthropoda）、 甲 壳 纲（Crustacea）、 十 足
目（Decapoda）、短尾亚目（Brachyura）、梭子蟹科
（Portunidae）、青蟹属（Scylla），具有很高的经济价
值和营养价值，是中国重要海水养殖品种之一［1］。
由于拟穴青蟹具食性广、适应性强、生长速度快、
养殖周期短、耐干露时间长、易运输和养殖效益高
等优点，深受养殖户喜爱。随着养殖强度增大以及
日益恶化的养殖环境，拟穴青蟹养殖过程不断受到
包括细菌、真菌以及病毒等多种病原体的侵害［2-4］。
抗菌肽具有广谱抗细菌、抗真菌以及独特的作用机
理，在蟹类防御病原微生物入侵方面起着重要作
收稿日期 ：2014-11-03
基金项目 ：广西自然科学基金资助项目（桂科自 2010GXNSFA013079），广西科技攻关资助项目（桂科攻 1114012-11）
作者简介 ：彭银辉，男，硕士，研究方向 ：海水养殖 ；E-mail ：pyinhui@163.com
通讯作者 ：黄国强，男，博士，研究方向 ：海水养殖与生理生态 ；E-mail ：hgqhugq@yahoo.com.cn
拟穴青蟹抗菌肽 hyastatin 基因原核表达条件的优化
彭银辉1，2  蔡小辉1，2，3，4  熊向英1，2  刘旭佳1，2  黄国强1，2
（1. 广西海洋生物技术重点实验室，北海 536000 ；2. 广西海洋研究所，北海 536000 ；3. 广东海洋大学海洋学院，湛江 524088 ；
4. 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088）
摘 要 ： 旨在优化拟穴青蟹抗菌肽 hyastatin 基因原核表达条件。克隆拟穴青蟹抗菌肽 hyastatin 基因成熟肽片段，与 pET-
28a 表达载体连接后，转入到大肠杆菌 BL21（DE3）中，通过优化条件进行诱导表达。结果显示，在异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷
（IPTG）浓度 0.2 mmol/L、37℃条件下培养 4 h 后表达量最大，分子大小与预期值相符。融合蛋白主要以包涵体形式高效表达，通
过 HisTrap HP 柱子使其得到进一步纯化。Western blot 分析表明，该融合蛋白可与鼠抗 His-tag 单克隆抗体发生特异性结合。说明
通过优化表达条件，获得拟穴青蟹抗菌肽 hyastatin 基因原核表达表达产物。
关键词 ： 拟穴青蟹 ；hyastatin 基因 ；原核表达 ；条件优化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.020
Optimization of Prokaryotic Expression of Antibacterial Peptide
hyastatin Gene in Scylla paramamosain
Peng Yinhui1，2 Cai Xiaohui1，2，3，4 Xiong Xiangying1，2 Liu Xujia1，2 Huang Guoqiang1，2
（1. Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology，Beihai 536000 ；2. Guangxi Institute of Oceanology，Beihai 536000 ：3. Marine
College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088 ：4. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and
Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088）
Abstract: This study aims to optimize the prokaryotic expression of hyastatin gene in Scylla paramamosain. The fragment of cloned
mature peptide in S. paramamosain hyastatin was ligated with the expression vector pET-28a. This recombinant was transformed into Escherichia
coli BL21（DE3）, and the gene was expressed by inducing under the optimal conditions. The expression of this protein was the highest under
the 37℃ and in 0.2 mmol/L of IPTG for 4 hours. The molecular weight of the expressed product was identical to that of expected protein by
SDS-PAGE analysis. The fusion protein was efficiently expressed as inclusion bodies, and further purified by HisTrap HP column. The result of
Western blot showed that the fusion protein could be bound specifically with mouse anti-His-tag Mab. In conclusion, the prokaryotic expression
product of hyastatin gene in S. paramamosain may be obtained by optimizing expression conditions.
Key words: Scylla paramamosain ：hyastatin gene ：prokaryotic expression ：condition optimization
2015,31(7) 139彭银辉等 ：拟穴青蟹抗菌肽 hyastatin基因原核表达条件的优化
用［5］。
抗菌肽 Hyastatin 是 Sperstad 等［6］从蛛形互爱蟹
（Hyas araneus）血细胞中纯化鉴定的一种对 G+/G-菌、
真菌均有抑制活性的新型抗菌肽，其 C 端结构域与
对虾抗菌肽 Penaeidins 同源，有 6 个保守的 Cys 残
基，形成 3 对分子内二硫键，属于 Penaeidins 家族
抗菌肽。国内还未见有关经济蟹类 hyastatin 基因
的克隆及其蛋白纯化方面的报道。本研究将已克隆
到的拟穴青蟹 hyastatin 基因全长序列成熟肽的编
码序列插入表达载体 pET-28a，转入大肠杆菌 BL21
（DE3），构建并优化原核高效表达条件，对该基因
所表达的蛋白进行纯化，以期为其在拟穴青蟹先天
性免疫中的功能及其应用研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 载体和菌株 大肠杆菌 DH5α、BL21（DE3）、
质粒 pET-28a 购至上海生工试剂，拟穴青蟹抗菌肽
hyastatin 基因是经测序无误，其克隆菌株保存于本
实验室。
1.1.2 主要试剂 PCR 反应试剂 Taq DNA 聚合酶、
dNTP、限制性核酸内切酶 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ、T4 DNA
连接酶、异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨苄
青霉素、DNA Marker、低分子蛋白 Marker 及预染标
准相对分子质量蛋白均为 TaKaRa 公司产品 ；鼠抗
His-tag 单抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 IgG、
DAB 显色试剂盒和 DNA 胶回收试剂盒购自南宁天
地扬生物科技有限公司 ；PVDF 膜购自上海生工生
物技术有限公司 ；PCR 引物均由英潍捷基（上海）
贸易有限公司合成。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器 台式高速低温离心机（Thermo 公司）、
恒温摇床（常州中捷实验仪器制造有限公司）、全温
振荡培养箱（上海博迅实业）、凝胶图象分析仪（GDS.
8000，美国 Gene 公司）、蛋白纯化柱 HisTrap HP 1
mL 预装柱（GE 公司）、小垂直板 Mini Protean III 电
泳槽及 Mini Trans-Blot 转印槽（美国 Bio-Rad）等。
1.2 方法
1.2.1 目的基因表达载体的构建与鉴定 根据拟
穴 青 蟹 hyastatin 基 因 全 长 序 列（GenBank 登 录 号
KC685376.1）设计一对特异引物，上游引物 HYBDf
为 ：5-ccaacatatgtacaacgcgaaggttccgatc-3（ccaa 为
保护碱基，下划线为 Nde Ⅰ酶切位点），下游引物
HYBDr 为 ：5-ccgctcgaggcctttgtagggtactggatag-3（ccg
为保护碱基，下划线为 Xho Ⅰ酶切位点）。以拟穴
青蟹 cDNA 单链为模板，用特异引物扩增该基因的
成熟肽片段。PCR 反应条件为 ：94℃预变性 5 min ；
94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min， 共 34 个 循 环 ；
72℃延伸 10 min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测
后，回收目的片段。PCR 扩增产物和表达载体 pET-
28a 分别经 Nde I 和 Xho I 双酶切，使用 T4 连接酶
16℃连接 4 h 以上。连接产物转化入大肠杆菌 BL21
（DE3）感受态细胞中，挑选阳性菌落抽提质粒，进
一步通过酶切和菌落 PCR 鉴定选择阳性克隆测序，
确定表达框正确。
1.2.2 不同诱导温度对目的蛋白在大肠杆菌中表达
量的影响 将表达正确的阳性克隆菌落，按 1∶50
比例接种到含卡那霉素 LB 培养基中，37℃振荡培
养 至 OD=0.4-0.6， 在 IPTG 浓 度 为 0.4 mmol/L 时，
37℃、28℃和 16℃下诱导 4 h，分别离心收集菌体
并超声破碎，对离心后的沉淀以 SDS-PAGE（浓缩
胶浓度 5%，分离胶浓度 12%）分析目的蛋白表达
的最适条件。
1.2.3 不同浓度 IPTG 对目的蛋白在大肠杆菌中表达
量的影响 按 1.2.1 培养细菌，取 1 mL 做未诱导对
照组，分别加入不同体积的 IPTG，使其终浓度分别
为 0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol/L，37℃ 振 荡 4 h
后各取 1 mL 菌液，以 SDS-PAGE 分析目的蛋白的表
达量。
1.2.4 不同诱导时间对目的蛋白在大肠杆菌中表达
量的影响 按 1.2.1 培养细菌，加入 IPTG 至终浓度
为 0.4 mmol/L， 分 别 诱 导 0、1、2、3、4、5 和 6 h
后收集菌液 1 mL，以 SDS-PAGE 分析目的蛋白表
达量。
1.2.5 目的蛋白的纯化 将含重组质粒的 BL21 菌接
种于 1 000 mL 含氨苄青霉素的 LB 培养基，经优化
的条件诱导后，离心收集菌体提取重组蛋白，用咪
唑洗脱通过 HisTrap HP 柱纯化重组蛋白。
1.2.6 免疫印迹分析 将诱导前后的含空载体和
Hyastatin 基因的表达菌蛋白经 SDS-PAGE 电泳后，
使用 Mini Trans-Blot 配合 Mini Protean III 电泳槽，将
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7140
已用电转液浸泡 30 min 的胶块转移至硝酸纤维素膜
上（200 mA，80 min），用鼠抗 His-tag 单抗与之反应，
二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 IgG，各步
骤之间用含体积分数 0.1% Tween20 的磷酸缓冲液
（TBS）洗膜 4 次，每次 10 min，最后用二氨基联苯
胺（DAB）显色至有清晰的目标蛋白带出现，用无
菌水终止反应，并冲洗 10 min 以终止显色，将膜置
于滤纸上自然干燥。
2 结果
2.1 hyastatin基因原核表达载体的构建与鉴定
PCR 扩增到约 390 bp 的基因片段，将回收纯化
的目的片段连接到表达载体 pET-28a，连接产物转
化入大肠感染 BL21（DE3）感受态细胞中，挑选阳
性菌落抽提质粒，通过菌落 PCR 和酶切鉴定，均得
到 390 bp 的片段，说明 hyastatin 基因原核表达载体
构建成功（图 1，图 2）。
2.2 拟穴青蟹Hyastatin重组融合蛋白在大肠杆菌
中的表达分析
2.2.1 最佳诱导温度 在其他条件一致的情况下，
37℃、28℃和 16℃不同诱导温度下重组融合蛋白的
表达量表明，37℃条件下 Hyastatin 全菌蛋白表达量
明显高于 28℃和 16℃下的表达量（图 3）。
390
bp
654321 M
2000
1000
750
500
250
100
bp
M ：DL2000 DNA Marker ；1-6 ：阳性克隆
图 1 重组质粒 pET28a-Hyastatin 菌液 PCR 鉴定
390
bp
1M
2000
1000
750
500
250
100
bp
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：ppET28a-Hyastatin/Nde Ⅰ + Xho Ⅰ
图 2 重组质粒 pET28a-Hyastatin 双酶切鉴定
1 2 3M
94.0
kD
66.2
45.0
33.0
26.0
20.0
14.4
M ：低分子蛋白 Marker ；1-3 ：分别为 37℃、28℃和 16℃诱导的全菌蛋白
图 3 不同温度诱导表达的 SDS-PAGE 分析
2.2.2 最佳诱导物浓度 浓度为 0 和 0.2 mmol/L 的
IPTG 诱导的重组融合蛋白表达量最少，0.1 mmol/L
的 IPTG 诱导的重组融合蛋白表达量最大。浓度为
0.4、0.7 和 1.0 mmol/L IPTG 诱导的表达量较少且变
化较小，这是因为诱导剂 IPTG 对细胞有毒性，高浓
度 IPTG 不利于细菌生长，所以该融合蛋白的 IPTG
最佳诱导浓度是 0.1 mmol/L（图 4）。
1 2 3 4 5 6M
94.0
kD
66.2
45.0
33.0
26.0
20.0
14.4
M ：低分子蛋白 Marker ；1-6 ：分别为 0、0.1、0.2、0.4、0.7 和 1.0 mmol/L
IPTG 诱导的全菌蛋白
图 4 不同 IPTG 浓度诱导表达的 SDS-PAGE 分析
2.2.3 最佳诱导时间 在其他条件一致的情况下，
经 0-12 h 诱导后，诱导时间在 4 h，重组融合蛋白
2015,31(7) 141彭银辉等 ：拟穴青蟹抗菌肽 hyastatin基因原核表达条件的优化
的表达量最高。6-10 h 重组融合蛋白表达量变化不
明显，诱导时间过短（2 h）或过长（12 h），重组融
合蛋白的表达量均较少（图 5）。
且易鉴定等优点。一个高效的原核表达体系的构
建，不仅涉及宿主、载体和外源基因三者之间的关
系，还受诱导条件的影响［7，8］。本实验选用常用抗
原蛋白表达载体 pET-28a（+）作为表达载体，其 N、
C 端带有 His-Tag，有利于表达蛋白纯化。将编码拟
穴青蟹抗菌肽 hyastati 蛋白活性核心区的碱基序列
插人 pET-28a 载体，成功获得重组融合蛋白。通过
HisTrapHP 亲和层析柱，可从包涵体中分离得到纯
度较高的重组融合蛋白，为抗菌肽 hyastatin 基因在
拟穴青蟹获得性免疫中的作用及应用研究奠定基础。
研究表明，原核表达体系中，诱导温度、IPTG
浓度及表达时间对诱导蛋白影响较大［9-11］。本实验
通过固定其它条件，对单个因子如时间、浓度 IPTG
和温度的诱导表达后，获得整体的优化。温度在诱
导过程中除影响氧的溶解度外，还会加速或延缓酶
的反应速率，影响蛋白的性质。本研究中，最佳诱
导温度 37℃时蛋白表达量最高，28℃和 16℃下的
表达量依次减少。0.1-1 mmol/L 范围内的 IPTG 均可
诱导重组蛋白表达，在降低 IPTG 对细菌代谢的毒
性作用和减少费用前提下，确定其最低有效浓度为
0.2 mmol/L。诱导时间在 0 和 2 h 表达量较少，诱导
4-10 h 表达量变化不明显，诱导 12 h 表达量出现减
少，可能与细菌生长到平台期或死亡期后菌体自溶
释放蛋白酶降解一部分蛋白有关。本研究通过优化
原核表达条件，得出 IPTG 浓度 0.2 mmol/L、37℃条
件下培养 4 h 后表达量最大，分子大小与预期值相
符。这些结果为重组蛋白的大量纯化提供可靠实验
依据。
本研究中重组蛋白主要以包涵体形式存在于表
达产物中。包涵体的存在会影响目的蛋白的纯化，
但包涵体形式可以保护蛋白质免受蛋白酶水解，而
且利用包涵体的不溶性和致密性，通过离心即相对
容易地对之进行提取［12］。包涵体在纯化过程中是否
得到复性，是否需溶解复性才能回收正确折叠的重
组蛋白还有待于进一步研究。Western blot 结果显示，
纯化的 hyastatin 基因表达融合蛋白可与鼠抗 His-
tag 单抗发生特异性结合，说明获得了融合蛋白的表
达产物，为该蛋白在获得性免疫中的功能研究奠定
基础。
养殖过程中因细菌、病毒和其它致病因子经常
1 2 3 4 5 6 7M
94.0
kD
66.2
45.0
33.0
26.0
20.0
14.4
M ：低分子蛋白 Marker ；1-7 ：分别为诱导 0、2、4、6、8、10 和 12 h 后的
全菌蛋白
图 5 不同时间诱导表达的 SDS-PAGE 分析
1M
95.0
kD
72.0
55.0
43.0
34.0
26.0
17.0
10.0
M ：预染蛋白 Marker ；1 ：纯化后的融合蛋白
图 6 用 His-Tag 单克隆抗体进行 Western blot 分析
2.2.4 重组融合蛋白的纯化和鉴定 最佳诱导条件
下，即 IPTG 浓度 0.2 mmol/L、37℃条件下培养 4 h
后，将超声破碎后提取的包涵体上样到 HisTrap HP
柱上。用咪唑缓冲液洗脱后进行 Western blot 分析，
结果（图 6）表明，纯化后的重组融合蛋白可与
His-Tag 单克隆抗体结合，表现出与融合蛋白大小一
致的条带，大小与 SDS-PAGE 中诱导后出现的条带
吻合，结合测序结果可推断，已成功表达拟穴青蟹
Hyastatin 多肽。
3 讨论
原核表达是与外源基因表达系统的常见方法，
它具有操作简单、成本低、表达效率高、产物稳定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7142
给拟穴青蟹育苗和养殖造成极大的经济损失［13-15］。
在病原感染早期，拟穴青蟹只能依赖先天性非特异
免疫，识别和清除入侵微生物，维持机体健康。因
此，抗菌肽类产品有望在促进免疫应答，提高机体
自身的抗病能力方面大显身手。目前，研究人员对
青蟹抗菌肽 hepcidin、scygonadin 以及 CrusSp 等基因
进行了克隆表达及抑菌活性分析［16-18］，而拟穴青蟹
抗菌肽 hyastatin 基因原核表达未见报道。本研究成
功获得了拟穴青蟹抗菌肽 hyastatin 基因的重组蛋白，
这为后续工作如纯化蛋白、批量获取纯化蛋白、抗
体制备等提供前期条件，为进一步更深入地研究其
功能、免疫机理奠定基础。
4 结论
本研究通过克隆拟穴青蟹抗菌肽 hyastatin 基因
成熟肽片段，构建原核表达系统后进行优化表达，
在 IPTG 浓度 0.2 mmol/L、37℃条件下培养 4 h 后表
达量最大，成功获得目的表达产物。
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（责任编辑 马鑫）