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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第11期
拟 穴 青 蟹（Scylla paramamosain） 隶 属 于 节 肢
动 物 门（Arthropoda）、 甲 壳 纲（Crustacea）、 十 足
目（Decapoda）、短尾亚目（Brachyura）、梭子蟹科
（Portunidae）、青蟹属（Scylla），广泛分布于我国东
收稿日期 ：2013-06-05
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（31001106），上海市科委“科技创新行动计划”基础研究重点科技项目（10JC1418600），中央级科研院
所基本科研业务费项目（2011M05）
作者简介 ：李淑娟，女，硕士研究生，研究方向 ：水生生物学 ；E-mail ：lishujuan0511@163.com
通讯作者 ：马凌波，男，博士，研究方向 ：水产生物技术和遗传育种 ；E-mail ：malingbo@vip.sina.com
AFLP 分子标记在拟穴青蟹子一代家系中的
遗传规律分析
李淑娟1，2  马洪雨1  马春艳1  蒋伟1  冯娜娜1  徐真1   
刘月星1  乔振国1  马凌波1
（1. 中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090 ；2. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）
摘 要： 采用 AFLP 技术对拟穴青蟹（Scylla paramamosain）子一代家系进行遗传学分析，并探讨了 AFLP 分子标记的遗传规
律。32 对 ALFP 选择性引物在拟穴青蟹家系 G1 代中共扩增出 1 128 个位点，其中不分离位点 752 个，多态性位点 376 个，多态
位点比例为 33.3%。在 376 个分离的位点中，符合孟德尔分离规律的位点共 229 个，占分离位点总数的 60.9% ；偏分离位点 147
个，占分离位点总数的 39.1%。分离比为 1∶1 的位点共 259 个，占分离位点数的 68.9%，其中符合孟德尔规律的位点 155 个，占
59.8% ；分离比为 3∶1 的位点共有 117 个，占分离位点数的 31.1%，符合孟德尔分离规律的位点 74 个，占 63.3%。32 对引物组合
检测到的有效等位基因个数在 1.13-1.73 之间 ；Shannon 指数在 0.10-0.56 之间 ；遗传多样性指数在 0.07-0.40 之间。
关键词 ： 拟穴青蟹 AFLP 遗传多样性 孟德尔分离
Segregating Pattern of AFLP Marker in G1 Family of the Mud Crab
（Scylla paramamosain）
Li Shujuan1，2 Ma Hongyu1 Ma Chunyan1 Jiang Wei1 Feng Nana1 Xu Zhen1
Liu Yuexing1 Qiao Zhenguo1 Ma Lingbo 1
（1. East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090 ；2. College of Fisheries and Life
Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）
Abstract:  In this study, the segregating pattern of AFLP（amplified fragment length polymorphism）and the genetic diversity of G1
family of the mud crab（Scylla paramamosain）was investigated using 32 selective primer combinations. A total of 1 128 loci were produced,
of which 376 loci were polymorphic（11.8%）, and 752 loci were monomorphic. Among 376 segregating loci, 229 loci（60.9%）segregated in
Mendelian ratio while 147 loci（39.1%）segregated in distortion estimated by Chi-square test（P=0.05）．There were 259（68.9%）and 117
（31.1%）loci segregating in the ratios of 1∶1 and 3∶1, respectively. The number of loci segregated in Mendelian ratios were 155（59.8%）for
1∶1 and 74（63.3%）for 3∶1, respectively. Effective number of alleles, Shannon genetic diversity index and Nei’s gene diversity index were
between 1.13 to 1.73, between 0.10 to 0.56, and between 0.07 to 0.40, respectively.
Key words:  Scylla paramamosain AFLP Genetic diversity Mendelian segregation
南沿海（包括浙江、福建、台湾、广东、广西和海
南沿岸水域），其个体大、生长快、肉味鲜美、营养
丰富、适应性强，具有很高的营养价值和经济价值，
是中国沿岸海域重要的海水养殖蟹类之一［1］。近年
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期124
来，随着拟穴青蟹养殖业的迅速发展，拟穴青蟹基
因组信息分析、遗传多样性研究、分子标记开发以
及分子标记辅助育种已成为重要的科研热点。
随着分子标记技术的发展和应用，分子标记技
术在鉴定优良亲本、筛选优良性状个体以及加快育
种进程等方面起着重要作用［2］。在拟穴青蟹中，应
用线粒体 DNA［3］、RAPD（random amplified polymor-
phism DNA）［4］、SSR（simple sequence repeat）［5］、
SNP（single nucleotide polymorphism）［6］等分子标记
技术进行种群遗传结构和遗传多样性分析等方面的
研究比较多，但利用 AFLP 分子标记技术对拟穴青蟹
进行研究报道尚少。AFLP 指纹技术（amplified frag-
ment length polymorphism）是近年来常用的一种分子
标记技术［7］，具有其它标记不可比拟的优点，它结
合 了 RFLP（restriction fragment length polymorphism）
的准确性和 PCR 的高效性，并且无需预先知道研究
对象的基因组信息，适用范围比较广泛。因为它具
有多态性高、稳定性好、灵敏度高、显性表达、分
辨力高、信息量大等优点，因而被广泛应用于动植
物遗传多样性分析［8-10］、遗传图谱构建、功能基
因筛选［11］及种质鉴定［12］等领域。目前，较多的
水产养殖对象已采用 AFLP 进行图谱构建，包括鱼
类［13-21］、甲壳类［22-28］、贝类［29-36］和棘皮类［37］等。
高密度的遗传连锁图谱能为拟穴青蟹重要经济性状
如体重、体长等 QTL（quantitative trait locus）定位
提供技术保证，也是实现分子标记辅助育种的基本
前提。本研究采用 AFLP 分子标记技术对拟穴青蟹
子一代家系进行遗传分析，探讨该分子标记在家系
的遗传规律及家系的遗传多样性，以期为拟穴青蟹
遗传连锁图谱的构建和分子标记辅助育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验所用的拟穴青蟹家系于 2012 年构建于
东海水产研究所海南琼海研究中心。挑选体格健壮、
肢体齐全且体表无创伤的雌性亲蟹进行暂养并繁育
后代，产生全同胞家系，共构建 10 个子一代家系。
待生长至仔蟹二期时，随机取 95 个全同胞置于 95%
的乙醇中保存备用 ；亲本新鲜肌肉样品置于 -80℃冰
箱中冷冻保存备用。
1.2 方法
1.2.1 DNA 模板的制备 为了确保提取 DNA 的质
量，使用 TIANGEN 公司海洋动物组织基因组 DNA
提取试剂盒进行 DNA 的提取，具体操作步骤参照试
剂盒说明书进行。
将提取的基因组 DNA 用 1% 琼脂糖凝胶进行电
泳和 Biometra 紫外分光光度计检测基因组 DNA 的质
量和浓度，并将 DNA 稀释为 100 ng/μL，-20℃保存。
1.2.2 AFLP 分析 用于 AFLP 分析的试剂为美国
Li-Cor 公 司 的 试 剂 盒（IRDye® Fluoreseeni AFLP® Kit
for Large Plant Genome Analysis）。AFLP 分析步骤参
照参照 Vos 等［3］的方法根据试剂盒说明书进行。
两种内切酶分别为 EcoR I 和 Mse I，预扩增引物
序列分别为 EcoR I+A（5-GACTGCGTACCAATTC+A
-3） 和 Mse I+C（5-GATGAGTCCTGAGTAA+C-3）。
选择性扩增引物在预扩增引物的 3 末端增加 2 个选
择性碱基，详见表 1。
1.2.3 AFLP 基因分型 PCR 产物经变性后利用 Li-
Cor 4300 DNA 序列分析仪进行电泳分离，所用聚丙
稀酰胺凝胶的浓度为 6%，电泳条件为 ：电压 1 500
V，功率 40 W，电流 40 mA，温度 45℃。预电泳 25
min 后，将变性后的 PCR 物上样 0.6 μL，采用分子
量标准 50-700 bp sizing standard 作为对照，预电泳
25 min，正式电泳 3.5 h。电泳图像被实时记录保存。
1.2.4 数据统计分析 由于 AFLP 分子标记是显性
标记，所以扩增出的条带在电泳图谱上表现为有带
和无带。选取清晰可辨的条带进行统计，在同一位
置有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“-”，
每个 AFLP 标记名称用该引物组合名加扩增片段的
分子量表示。根据亲本的带型及其在子代的分离情
况来推断亲本的基因型（A 表示显性基因，a 表示隐
性基因），如果双亲的带型为多态而在 F1 代发生分
离，则双亲的基因型应为 Aa 和 aa ；如果双亲均有
带而在 F1 代发生分离，则双亲的基因型为 Aa，由
此可以判断出父本分离标记、母本分离标记及双亲
共有分离标记。用卡方（Chi-square）检验来检测这
些 AFLP 标记的遗传和分离是否符合孟德尔 1∶1 或
3∶1 的分离规律（显著性水平 P=0.05）。
利用 POPGENE（version 1.32）软件统计位点总
2013年第11期 125李淑娟等 ：AFLP 分子标记在拟穴青蟹子一代家系中的遗传规律分析
数、多态位点数和每个引物组合的多态位点比例，
计算有效等位基因数、Shannon 多样性指数、Nei 基
因多样性指数。
2 结果
2.1 AFLP扩增结果
32 对选择性引物在 2 个亲本及 95 个子一代个
体中共扩增到 1 128 个位点，其中不分离位点 752 个，
多态位点 376 个，多态位点比例为 33.3%。各对引
物扩增的位点数量和大小有差别，平均每对引物扩
增出 35.3 个位点，多态位点平均为 11.8 个，扩增
片段的大小在 50-700 bp 之间。引物组合 E-AAC/M-
CAC 扩增的多态位点数最多为 26 个，多态性比为
70.3% ；而引物组合 E-ACA/M-CAA 扩增的多态性位
点比例最高为 87.0%，多态位点为 20 个。引物组合
E-AAC/M-CTC 扩增的多态位点最少为 5 个，多态位
点比例为 22.7% ；而引物组合 E-AGC/M-CAT 扩增的
位点多态性比例最低为 14.3%，多态位点为 8 个（表
1）。图 1 是引物 E-ACC/M-CAG 在拟穴青蟹家系的亲
本和部分子一代个体中的扩增电泳图谱。
表 1 32 对引物扩增到的位点数、多态位点数和孟德尔分离位点比例
引物组合 扩增位点 多态位点数 多态位点比例（%） 孟德尔位点数 孟德尔位点比例（%）
E-AAC/M-CAA 38 10 26.3 4 10.5
E-AAC/M-CAC 37 26 70.3 12 32.4
E-AAC/M-CAG 30 14 46.7 9 36.7
E-AAC/M-CAT 39 12 30.8 9 30.0
E-AAC/M-CTC 22 5 22.7 3 13.6
E-AAC/M-CTG 29 12 41.4 6 20.7
E-AAC/M-CTT 45 14 31.1 11 24.4
E-AAC/M-CTA 52 9 17.3 3 5.8
E-AAG/M-CAT 54 10 18.5 7 13.0
E-ACA/M-CAA 23 20 87.0 13 56.5
E-ACA/M-CAC 36 13 36.1 7 19.4
E-ACA/M-CAT 43 8 18.6 6 14.0
E-ACA/M-CTG 40 17 42.5 8 20.0
E-ACC/M-CAC 36 9 25.0 6 16.7
E-ACC/M-CTA 32 7 21.9 5 15.6
E-ACC/M-CTC 30 7 23.3 5 16.7
E-ACC/M-CAG 40 10 25.0 5 12.5
E-ACT/M-CAA 38 13 34.2 11 29.0
E-ACG/M-CAC 27 18 66.7 11 40.7
E-ACG/M-CAG 19 13 68.4 4 20.0
E-ACG/M-CTC 35 8 22.9 7 20.0
E-ACG/M-CTG 24 7 30.4 4 16.7
E-ACG/M-CTT 30 22 70.0 11 36.7
E-AGC/M-CAA 34 9 26.5 6 17.6
E-AGC/M-CAC 42 16 38.1 10 23.8
E-AGC/M-CAG 45 12 26.7 9 20.0
E-AGC/M-CAT 56 8 14.3 4 7.1
E-AGC/M-CTA 24 14 58.3 10 41.7
E-AGG/M-CAA 40 7 17.5 5 12.5
E-AGG/M-CAC 32 14 43.8 9 28.1
E-AGG/M-CAG 27 7 25.9 6 22.2
E-AGG/M-CTA 29 5 17.2 3 10.3
总计 1128 376 / 229 /
平均 35.5 11.8 35.8 7.2 22.0
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期126
2.2 孟德尔分离位点及偏分离位点
在 376 个分离的 AFLP 位点中，符合孟德尔分
离规律的位点为 229 个，占分离位点数的 60.9%（表
1）。分离比为 3∶1 的位点共有 117 个，占分离位点
数的 31.1%，其中符合孟德尔分离规律的位点 74 个，
占 63.3%（占分离位点总数的 19.7%）；分离比为 1∶1
的位点共有 259 个，占分离位点数的 68.9%，符合
孟德尔规律的位点 155 个，占 59.8%（占分离位点
总数的 41.2%）（表 2）。
表 2 AFLP 标记在拟穴青蟹子一代家系中的分离方式
分离方式
孟德尔分离
偏孟德尔分离 不分离位点
1∶1 分离 3∶1 分离
位点数 155 74 148
频率（%） 41.2 19.7 39.1 66.7
在 376 个分离的位点中，共有 147 个位点的分
离比例偏离 1∶1 或 3∶1 的孟德尔分离比例，占分
离位点数的 39.1%，其中偏离 1∶1 的标记占总位点
数的 27.7%，偏离 3∶1 的标记占总位点数的 11.4%。
在 229 个符合孟德尔遗传规律的位点中，父本
特有标记 68 个，母本特有标记 87 个，双亲共有标
记 74 个，分别占 29.7%、38% 和 32.3%，母本分离
标记稍多于父本分离标记。147 个偏离孟德尔遗传
规律的位点中，父本特有标记 64 个，母本特有标记
40 个，双亲共有标记 43 个，分别占偏分离位点数
的 43.5%、27.2% 和 29.3%。
2.3 拟穴青蟹家系的遗传多样性
利用 POPGENE（version1.32）软件进行统计分
析，结果表明每个位点的有效等位基因个数在 1.13-
1.73 之间 ；Shannon 指数在 0.10-0.56 之间 ；遗传多
样性指数在 0.07-0.40 之间。引物组合 E-ACA/M-CAA
的有效等位基因个数、Shannon 多样性指数和 Nei’s
基因多样性指数最高，分别为 1.73、0.56 和 0.40 ；
引物组合 E-ACA/M-CAT 的有效等位基因数最少为
1.13 个，其 Shannon 多样性指数和 Nei’s 基因多样性
指数分别为 0.101 和 0.07；而引物组合 E-AGG/M-CAA
的 Shannon 多样性指数和 Nei’s 基因多样性指数最
低，分别为 0.10 和 0.07（表 3）。
表 3 拟穴青蟹子一代家系遗传变异的 AFLP 分析结果
引物组合
有效等位
基因数
Shannon 多样性
指数
Nei’s 基因
多样性指数
E-AAC/M-CAA 1.1752 0.1514 0.1025
E-AAC/M-CAC 1.3959 0.3566 0.2370
E-AAC/M-CAG 1.3369 0.2792 0.1916
E-AAC/M-CAT 1.2216 0.1835 0.1259
E-AAC/M-CTC 1.1527 0.1300 0.0881
E-AAC/M-CTG 1.2591 0.2252 0.1513
E-AAC/M-CTT 1.2353 0.1899 0.1313
E-AAC/M-CTA 1.1382 0.1068 0.0746
E-AAG/M-CAT 1.1292 0.1090 0.0744
E-ACA/M-CAA 1.7317 0.5620 0.3952
E-ACA/M-CAC 1.2446 0.2061 0.1400
E-ACA/M-CAT 1.1273 0.1089 0.0741
E-ACA/M-CTG 1.2148 0.2102 0.1361
E-ACC/M-CAC 1.1776 0.1546 0.1049
E-ACC/M-CTA 1.1478 0.1248 0.0847
E-ACC/M-CTC 1.1595 0.1347 0.0916
E-ACC/M-CAG 1.1667 0.1424 0.0964
E-ACT/M-CAA 1.2093 0.1902 0.1274
E-ACG/M-CAC 1.3903 0.3771 0.2481
E-ACG/M-CAG 1.4105 0.3737 0.2487
E-ACG/M-CTG 1.1862 0.1644 0.1105
E-ACG/M-CTC 1.1917 0.1460 0.1025
E-ACG/M-CTT 1.4522 0.4079 0.2730
E-AGC/M-CAA 1.2037 0.1611 0.1116
E-AGC/M-CAC 1.2381 0.2024 0.1372
E-AGC/M-CAG 1.2014 0.1634 0.1130
E-AGC/M-CAT 1.1320 0.1019 0.0714
E-AGC/M-CTA 1.4203 0.3492 0.2395
E-AGG/M-CAA 1.1280 0.1027 0.0708
E-AGG/M-CAC 1.3042 0.2575 0.1756
E-AGG/M-CAG 1.2335 0.1726 0.1226
E-AGG/M-CTA 1.1723 0.1328 0.0932
350
bp
Mǀ
325
300
230
204
200
175
145
120
M ：分子量标准 pBR322 ；♀ ：母本的 PCR 产物的电泳结果
图 1 引物组合 E-ACC/M-CAG 在拟穴青蟹中的扩增图谱
2013年第11期 127李淑娟等 ：AFLP 分子标记在拟穴青蟹子一代家系中的遗传规律分析
3 讨论
3.1 拟穴青蟹家系的遗传多样性
遗传多样性是评估物种资源的一项很重要的指
标。本研究采用 AFLP 分子标记技术，利用 32 对选
择性引物组合对拟穴青蟹子一代家系的遗传多样性
进行了分析，获得了大量的清晰稳定的条带和丰富
的遗传多样性数据。每个位点的有效等位基因个数
在 1.13-1.73 之间，Shannon 指数在 0.10-0.56 之间，
遗传多样性指数在 0.07-0.40 之间，表明拟穴青蟹家
系内个体间存在丰富的遗传变异。
AFLP 指纹技术对于 DNA 多态性有着很高的检
出灵敏度，是进行种质资源鉴别、种群遗传研究和
遗传连锁图谱构建的有效手段。本研究表明，平均
每对选择性引物产生 11.8 个多态标记，多态性位点
的比例为 35.79%。而在栉孔扇贝全同胞家系中平
均每对引物产生 7.9 个多态标记，多态标记比例占
21.3%［32］。在栉孔扇贝种内杂交系中平均每对引物
产生 20.8 个多态标记，多态标记比例为 31.1%［33］。
在塔里木裂腹鱼中，平均每对引物扩增到 23.5 个多
态位点，多态位点比例为 66.5%［38］。在三疣梭子
蟹 F2 代家系中，平均每对引物产生 11.9 个多态标
记，多态位点的比例为 23.9%［39］。太平洋牡蛎的
每对引物产生 25.4 个多态标记，多态位点比例为
34.7%［30］。条石鲷野生和放流群体中平均每对引物
产生 27 条多态标记，多态标记比例为 51.67%［40］。
合浦珠母贝印度家系 F1 代中平均每对引物产生 30.9
个多态标记位点，多态性位点比例高达 82.4%［41］。
以上这些多态性差异的原因可能与不同的地域环境、
物种差别、育种杂交方式及所使用的标记不同等因
素有关。
3.2 AFLP标记的孟德尔分离规律
只有符合孟德尔遗传分离规律的 AFLP 标记才
适用于遗传连锁图谱构建，即符合 1∶1 分离，则亲
本的基因型为 Aa×aa ；或符合 3∶1 分离，则亲本
的基因型为 Aa×Aa。本研究采用 32 对 AFLP 选择
性引物组合共扩增到 229 个符合孟德尔分离比的分
离位点，平均每对引物产生 7.2 个位点。扩增效率
比牙鲆的平均每对引物产生 5.5 个位点［17］略高，而
与中国对虾平均每对引物产生 8.5 个位点［42］接近。
此外，在罗非鱼中平均每对引物产生 9.3 个位点［18］，
合浦珠母贝平均每对引物产生 9.5 个位点［41］，三疣
梭子蟹平均每对引物产生 10.1 个位点［39］，而栉孔
扇贝平均每对引物产生 17.0 个位点［32］。
一般认为，构建中等密度遗传连锁图谱的标记
数应在 400-1 000［43］。若标记数目过少，遗传连锁
图谱的密度太低，图谱的覆盖率和分辨率则不能满
足 QTL 定位和分子标记辅助育种的基本要求。因此，
为了构建高密度的拟穴青蟹遗传连锁图谱，需要在
本试验的基础上增加 AFLP 选择性扩增引物组合的
数量，并采用微卫星等其它共显性分子标记用于构
建图谱。
3.3 AFLP标记的偏分离现象
在遗传过程中，等位基因的偏分离现象普遍存
在于生物界，是生物进化的动力之一［44］。AFLP 标
记经常会出现某些位点的基因频率偏离正常孟德尔
分离规律的情况，例如，在栉孔扇贝全同胞家系
中，其偏离比例为 6.2%［32］；在栉孔扇贝种内杂交
家系中为 14.7%［33］；在凡纳滨对虾中为 11.5%［27］；
在斑点叉尾鮰中为 16%［16］，而在太平洋牡蛎中为
26.9%［30］。在植物中也存在偏分离现象，如在桃中，
其偏分离比例为 19.8%［45］，在西瓜重组自交系中为
30%［46］，而在芒果中为 42.7%［47］。偏分离比例较
高物种包括 ：家蚕（50%）［48］、罗非鱼（80%）［18］。
本研究中得到的偏分离标记比例也相对较高，为
42.0%。造成位点偏分离现象的原因较多，一般认为
染色体缺失、遗传分离机制、隐性致死基因等一些
生物因素是引起偏分离现象的产生的主要原因 ；试
验误差、酶切不彻底、DNA 本身存在大量的断裂片
段、试验过程中的污染等操作的失误也会导致偏分
离现象 ；此外，研究群体样本较小、不同个体间标
记清晰度差异、不同人读数标准不一致等统计误差
均会导致偏分离现象的产生。
4 结论
拟学青蟹子一代家系具有较高的遗传多态性水
平，个体间存在丰富的遗传变异 ；在发生分离的位
点中，接近 60% 的位点符合孟德尔分离规律，且约 2/3
的位点符合 1∶1 分离规律，约 1/3 的位点符合 3∶1
分离规律。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期128
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）