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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
拟穴青蟹线粒体 COI基因序列克隆及
SNPs位点分析
马群群1，2 马洪雨1 马春艳1 崔海玉1，2 马凌波1
(1中国水产科学研究院东海水产研究所 农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室，上海 200090;
2上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)
摘 要: 根据拟穴青蟹(Scylla paramamosain)线粒体全序列设计引物，采用 PCR产物双向测序法，克隆了线粒体细胞色
素 C氧化酶亚基 I(COI)基因部分序列(761 bp) ，并筛选、分析了拟穴青蟹的 SNPs位点。共分析了采自福建省宁德市的 16 只
拟穴青蟹，另外，从 GenBank 数据库中下载了 31 条前人提交的拟穴青蟹 COI 基因序列(长度在 425 － 522 bp 之间)。利用
MEGA 4. 0 软件对所有序列进行比对分析，结果表明碱基 T、C、A和 G的平均含量分别为 37. 6%、17. 8%、28. 9%和 15. 7%，G
+ C的含量平均为 33. 5%。分析结果表明，在所克隆的 761 bp 的 COI 基因序列中共发现 29 个 SNPs 位点，其出现频率为
3. 8%。在这 29 个 SNPs位点中，13 个为 C /T转换(占 44. 8%) ，12 个为 A/G转换(占 41. 4%) ，2 个为 A/T颠换(占 6. 90%) ，
1 个为 G/C颠换(占 3. 45%) ，另有一个位点(201 bp 处)发生了 A/C 颠换和 C /T 转换两种类型的碱基替换。氨基酸分析表
明，在 29 个 SNPs位点中，有 9 个位点属于非同义突变，引起了氨基酸的变化;其他 20 个位点属于同义突变，未引起氨基酸的
变化。这将为拟穴青蟹遗传背景和群体遗传多样性研究提供新的分子标记。
关键词: 拟穴青蟹 COI基因 SNPs 聚合酶链式反应
Cloning of COI Sequence and Identification of SNPs
Loci in Scylla paramamosain
Ma Qunqun1，2 Ma Hongyu1 Ma Chunyan1 Cui Haiyu1，2 Ma Lingbo1
(1Key Lab of Marine and Estuarine Fisheries Resources and Ecology，Ministry of Agriculture，
East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090;
2College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306)
Abstract: Partial sequence(761 bp)of mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I(COI)gene of Scylla paramamosain was
cloned using PCR method and bi-directional sequencing technique，and then the single nucleotide polymorphisms(SNPs)were screened
and analyzed． A total of 16 individuals of S． paramamosain that collected from Ningde City of Fujian Province were analyzed，and the
other 31 COI gene sequences of S． paramamosain were downloaded from the GenBank． The results showed that the average contents of
T，C，A and G were 37． 6%，17． 8%，28． 9% and 15． 7% respectively，and that of G + C was 33． 5% ． After alignment of all sequences，
29 SNP loci were found，including 13 C /T transitions(44． 8%) ，12 A /G transitions(41． 4%) ，2 A /T transversions(6． 90%) ，and 1
G /C transversion(accounting for 3． 45%) ，meanwhile at one locus(located at 201 bp) ，there were two types of base substitutions inclu-
ding A /C transversion and C /T transition． Amino acid analysis showed that 9 SNPs were non-synonymous mutations that caused amino
acid mutations and the others were synonymous mutations． This will provide a new kind of molecular marker for the study of population
genetic diversity and genetic backgrounds of the crab S． paramamosain．
Key words: Scylla paramamosain COI gene SNPs PCR
收稿日期:2011-03-04
基金项目:国家自然科学基金项目(31001106) ，上海市科委“科技创新行动计划”基础研究重点科技项目(10JC1418600) ，中央级公益性科研院
所基本科研业务费重点项目(2007Z01)
作者简介:马群群，女，硕士研究生，研究方向:水产生物技术;E-mail:maqunqun257@ sohu． com
通讯作者:马凌波，男，研究员，研究方向:水产生物技术;E-mail:malingbo@ vip． sina． com
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
拟穴青蟹(Scylla paramamosain)隶属于节肢动
物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(De-
capoda)、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portuni-
dae)、青蟹属(Scylla) ，广泛分布于我国东南沿海，
包括浙江、福建、台湾、广东、广西和海南沿岸水域，
是我国青蟹的优势种，具有较高的经济价值和营养
价值。近年来，随着拟穴青蟹养殖业的迅速发展，对
其育种工作以及遗传多样性方面的研究也已陆续开
展。因此，开发拟穴青蟹遗传标记便成为一项重要
的课题。
目前，对于青蟹遗传标记方面的研究，已有一些
报道。Klinbungea等［1］采用 RAPD 技术对泰国东部
3 种青蟹的遗传多样性进行了研究，结果表明这 3
种青蟹间存在遗传变异，属于 3 个不同的种，并找到
了种间标记。林琪等［2］用 RAPD和 AFLP技术对中
国拟穴青蟹野生群体和养殖群体进行了遗传多样性
和遗传分化的研究。Cui等［3］用 5锚定 PCR技术开
发了 18 个拟穴青蟹的 SSR标记。
线粒体 DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)为核
外遗传物质，呈母性遗传，其不同区域变异率存在较
大的差异，遗传变异解析能力也不相同，例如，其中
的 COI 以及 D-Loop 等序列，具有较大的变异区域。
迄今，国内对于青蟹 mtDNA 的研究已有不少报道:
马凌波等［4］对青蟹属不同种类 24 个体的线粒体
12S rRNA、16S rRNA和 COI 基因部分序列进行了测
定，分析探讨了青蟹属的系统发育关系;路心平
等［5］对 10 个地理种群的拟穴青蟹线粒体 COI 基因
片段进行分析，研究了我国东南沿海拟穴青蟹的种
群遗传结构;张凤英等［6］以中国东南沿海的青蟹为
研究对象，对青蟹线粒体 COI 假基因的分离和特征
进行分析，结果提示利用线粒体 DNA进行青蟹遗传
结构和系统进化研究时应警惕假基因的干扰;马凌
波等［7］对中国东南沿海青蟹线粒体 COI 基因部分
序列进行分析，结果表明中国东南沿海的青蟹为拟
穴青蟹;林琪等［8］对采自中国东南沿海青蟹属的 4
种青蟹:锯缘青蟹、紫螫青蟹、榄绿青蟹和拟穴青蟹
的线粒体 COI基因片段进行了测定，分析研究了其
种间遗传差异及系统发育关系。结果显示，4 种青
蟹在 COI基因片段上存在差异，种间序列差异远大
于种内差异，并且证明了我国青蟹属的优势种为拟
穴青蟹;高天翔等［9］分析了我国沿海不同地区青蟹
的线粒体 12S rRNA 基因序列，结果显示分布于中
国沿海的青蟹主要是拟穴青蟹(S. paramamosain)。
随着分子生物学和生物技术的迅速发展，分子
遗传标记技术也日新月异。单核苷酸多态性(single
nucleotide polymorphisms，SNPs)是继 RFLP 和 SSR
之后的第三代分子标记技术，最早于 1994 年报道于
人类分子遗传杂志上，随后 Lander 在 Science杂志上
第一次正式提出 SNPs为新一代分子标记［10］。SNPs
是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的
序列多态性，其所表现的多态性一般是由单个碱基
的转换(transition)或颠换(transversion)所引起。由
于 SNPs具有位点丰富、代表性强、遗传稳定性高、
易实现分析自动化等优点，近年来被广泛应用于水
产动物的遗传育种［11，12］、群体结构与亲缘关系分析
及分类学研究［13，14］等领域。但迄今未见有关拟穴
青蟹 SNPs研究的报道。
本研究拟采用 PCR双向测序法，分析拟穴青蟹
线粒体 COI 基因的 DNA 序列，以筛选拟穴青蟹的
SNPs位点，为拟穴青蟹遗传背景和群体遗传多样性
方面的研究提供新的分子标记。
1 材料与方法
1. 1 材料
试验分析所用的 16 个拟穴青蟹样品均为采自
我国福建宁德的野生个体，采集后活体运回实验室，
分别取其大螯浸泡于 95%的酒精中，换 95%的酒精
2 次后保存，备用。
1. 2 方法
1. 2. 1 基因组 DNA 的提取 基因组 DNA 的提取
采用传统的酚 －氯仿抽提法，参照《分子克隆实验
指南》［15］，并稍作改进。主要过程:取肌肉组织 100
mg 放入 1. 5 mL的离心管中，加入 600 μL的 STE缓
冲液(10 mmol /L Tris-HCl pH8. 0;10 mmol /L NaCl;1
mmol /L EDTA，pH8. 0) ，用灭菌手术剪剪碎，混匀后
加入终浓度为 1%的 SDS 和 100 μg /mL 的蛋白酶
K。将上述混合物置于 55℃消化 3 h 左右至溶液澄
清透明，消化物再经酚 /氯仿抽提，酒精沉淀。最终
提取的 DNA经 70%的乙醇洗涤，室温干燥后，溶于
适量的 ddH2O中，琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA
的纯度，用紫外分光光度计法估计含量，稀释 DNA
211
2011 年第 7 期 马群群等:拟穴青蟹线粒体 COI基因序列克隆及 SNPs位点分析
浓度至 50 ng /μL，于 － 20℃保存备用。
1. 2. 2 引物设计 根据 GenBank 上公布的拟穴青
蟹 COI 基因序列(登录号:FJ827761) ，采用软件
Primer Premier 5. 0 设计上下游引物 COI-s和 COI-a。
上游引物:COI-s，5-TTGACCCTGCTGGCGGTGG-3;
下游引物:COI-a，5-CAATTGAGGAGGGTAAAAAT-
GGAGTAA-3。引物由上海生工生物工程有限公司
合成。
1. 2. 3 PCR 扩增 PCR 反应以基因组 DNA 为模
板，用上述引物进行扩增，PCR 反应体系为 25
μL，包括 2. 6 μL 10 × buffer，2. 0 μL dNTPs(2. 5
mmol /L) ，正反向引物(10 μmol /L)各 1. 0 μL，0. 4
μL Taq DNA 聚合酶(2. 5 U /μL) ，0. 5 μL 模板
DNA，补 ddH2 O 至总体积 25 μL。PCR 扩增程序:
94℃预变性 5 min;94℃变性 30 s，54℃复性 50 s，
72℃延伸 50 s，共进行 38 个循环;最后 72℃延伸 7
min，4℃保存。PCR 扩增产物用 1. 5%琼脂糖凝胶
电泳分离，经 EB染色，复日 FR980 型凝胶成像系统
拍照，记录。
1. 2. 4 测序与数据处理 将 PCR 产物送至上海杰
李生物技术有限公司测序。所得序列，去掉其两端
不确定序列，采用 Lasergene 软件包的 SeqMan 软件
对其拼接，并人工校正。利用 MEGA 4. 0 软件比对
分析，用 Sequin 软件将所有单倍型序列提交 Gen-
Bank数据库。
将本研究所克隆的 16 条拟穴青蟹 COI 基因序
列与从 GenBank 数据库中下载的 31 条拟穴青蟹
COI基因序列(GenBank 登录号分别为 AB114219，
AB114220， AY750926-750937， EU664319-664321，
EU664325-664339)进 行 比 对。用 生 物 学 软 件
MEGA 4. 0 计算 SNP 位点出现频率(频率 = SNP
位点数 /序列长度) ，T、C、A、G 四种碱基含量并
分析碱基突变类型及其对相应氨基酸的影响。
2 结果与讨论
2. 1 拟穴青蟹 COI基因序列的扩增结果
分别以 16 个拟穴青蟹个体的基因组 DNA为模
板进行 mtDNA COI基因部分序列的扩增，产物用含
EB的 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。结果(图 1)显
示，16 个拟穴青蟹 COI基因片段均扩增出 800 bp左
右的清晰单一条带。
M. 分子量标准 D1000;1 － 16. 16 个拟穴青蟹 COI基因序列的 PCR产物
图 1 16 个拟穴青蟹 COI基因序列琼脂糖凝胶电泳检测结果
2. 2 拟穴青蟹 COI基因序列克隆与分析
本研究采用 PCR 产物双向测序法，克隆了 16
个拟穴青蟹 COI基因部分序列，对其序列进行拼接
并结合人工校对，最终得到的基因序列大小为 761
bp。同时，从 GenBank中下载了 31 条拟穴青蟹 COI
基因序列，其长度在 425 － 522 bp 之间。采用
MEGA 4. 0 软件将 47 条序列一起分析，结果(表 1)
发现，T、C、A 和 G 的平均含量分别为 37. 6%、
17. 8%、28. 9% 和 15. 7%，G + C 的含量平均为
33. 5%，T、C、A、G四种碱基的含量在个体间存在一
定的差异。从表 1 可以看出，A + T 含量明显高于
G + C含量。杨建敏等［16］认为较高的 A + T含量，是
目前已检测的无脊椎动物线粒体 DNA 序列中较为
普遍的现象。
311
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
表 1 拟穴青蟹 COI序列碱基含量及长度
T含量(%) C含量(%) A含量(%) G含量(%) G + C含量(bp)
变化范围 36. 4 － 38. 9 17. 2 － 18. 6 28. 0 － 29. 7 14. 7 － 17. 0 32. 8 － 34. 6
平均值 37. 6 17. 8 28. 9 15. 7 33. 5
变化幅度(%) 6. 65 7. 87 5. 88 14. 7 5. 37
2. 3 拟穴青蟹 COI序列中的 SNPs位点
序列分析结果表明，在 47 条序列中共存在 29
个 SNPs 位点，其出现频率为 3. 8%。在这 29 个
SNPs位点中，13 个为 C /T 转换(占 44. 8%) ，12 个
为 A /G 转换(占 41. 4%) ，2 个为 A /T 颠换(占
6. 09%) ，1 个为 G /C颠换(占 3. 45%) ，另有一个位
点(201 bp处) ，发生 A /C 颠换和 C /T 转换两种类
型的碱基替换。29 个 SNPs 位点的发生位置、变异
模式及突变频率见表 2。由于 GenBank中的 COI 序
列比本研究所获得的序列短，因此，在 29 个 SNPs位
点中，有 25 个位点出现在所有序列中，而另外 4 个
位点仅出现在本研究所获得的序列中。
通过表 2 可以发现，29 个 SNPs位点中，25 个碱
基替换为转换，3 个为颠换，另外 1 个既有转换也有
颠换。其中，转换所占比例远高于颠换所占比例。
如果构成核苷酸序列的 4 种碱基随机突变，那么
SNPs中的颠换应该是转换的两倍，但是 4 种碱基突
变的机会并不均等，实际上 SNPs 中转换所占比例
更高［17］。本研究也证实了这一点，转换所占比例达
到了 86. 2%。此外，在本研究发现的 29 个 SNPs 位
点中，C /T转换(占 44. 8%)所占的比例最高，也与
以往的研究一致:嘧啶之间的碱基转换要高于嘌呤
之间碱基的转换［18，19］。对于这种现象的解释，Hol-
liday等［20］认为甲基化 CG 序列是一个突变热点，其
中甲基化的 C 可自发的通过脱氨基作用而转变成
T，从而使 CG为 TG 所取代，可能与 mtDNA 的碱基
组成有一定的关系。
线粒体 DNA 为核外 DNA，具有结构简单、母系
遗传、进化速率快、几乎不发生重组等方面的优点，
而单核苷酸多态性又具有数量多、分布广、富有代表
性、遗传稳定、检测易于实现自动化的优势。将两种
方法综合起来使用不失为一种研究群体遗传结构的
有效方法。Sato等［21］采用线粒体 SNPs对日本虾夷
扇贝(Patinopecten yessoensis)进行研究，结果表明其
种内存在遗传多样性。Elfstrom 等［22］对阿拉斯加州
北美扇贝(Patinopecten caurinus)线粒体基因的 SNPs
进行了研究，结果表明其线粒体 COI 基因存在单核
苷酸多态性。
表 2 拟穴青蟹 COI序列中 29 个 SNPs位点位置、
变异模式及突变频率
碱基位置 变异模式 突变个体数 突变频率
29
33
60
69
76
85
96
144
195
201
207
210
276
303
317
321
334
366
369
378
445
481
502
507
523
531
532
542
582
663
G /A
T /C
A /G
T /C
A /T
A /G
G /A
T /C
T /C
C /T;C /A
G /A
T /C
T /C
T /C
A /G
G /A
T /C
T /C
G /A
A /G
T /C
A /G
T /C
T /C
T /C
A /T
A /G
G /C
T /C
A /G
4
2
1
1
1
1
3
2
2
1;2
1
8
1
1
1
1
1
3
3
1
1
1
1
4
1
4
1
1
1
1
0. 2500
0. 1250
0. 0625
0. 0370
0. 0370
0. 0345
0. 1111
0. 0741
0. 0741
0. 1035
0. 0345
0. 2759
0. 0345
0. 0345
0. 0345
0. 0345
0. 0345
0. 1035
0. 1035
0. 0345
0. 0345
0. 0345
0. 0345
0. 1379
0. 0345
0. 1379
0. 0345
0. 0345
0. 0588
0. 0625
411
2011 年第 7 期 马群群等:拟穴青蟹线粒体 COI基因序列克隆及 SNPs位点分析
2. 4 拟穴青蟹 COI序列的氨基酸分析
根据 GenBank 中拟穴青蟹 COI 基因全序列得
知，COI基因编码序列全长 1 534 bp。采用 MEGA
4. 0 软件，将本研究所克隆的 1 号样本 COI 序列与
COI基因全序列进行比对，发现 1 号样本的第一位
碱基对应于 COI基因全序列的第 679 位碱基。对其
进行氨基酸分析，结果显示，1 号样本的前三位碱基
对应于 COI基因的第 227 位氨基酸的密码子，而研
究所得 761 bp 的拟穴青蟹 COI 序列共编码 253 个
氨基酸。将 1 号样本的 COI 序列作为标准序列，对
47 条序列所推测的氨基酸进行分析。结果表明，在
29 个 SNPs位点中，有 9 个位点属于非同义突变，引
起了氨基酸的变化，另外 20 个属同义突变，未引起
氨基酸的变化。其中 20 个同义突变的碱基变异位
点均处在密码子的第三位，另外 9 个非同义突变中，
有 8 个为密码子第一位碱基，1 个为密码子第二位
碱基，说明突变位点多发生在密码子第三位碱基。
这与蔡立哲等［23］对节织纹螺(Nassarius hepaticus)
COI基因变异位点的研究结果一致。一些研究者认
为，这种核苷酸发生变化但所编码氨基酸序列没有
改变的同义突变，是线粒体系统在其较快的进化速
度下维持蛋白质结构和功能稳定的方式之一［24］。
表 3 列出了 9 个非同义突变位点的位置，氨基酸变
化的类型以及突变碱基在密码子中的位置。
表 3 非同义突变位点的位置和氨基酸变化的类型及
突变碱基在密码子中的位置
非同义突变的
密码子位置
氨基酸变
异模式
突变碱基在密
码子中的位置
76，77，78
85，86，87
316，317，318
334，335，336
445，446，447
481，482，483
502，503，504
532，533，534
541，542，543
Ile / Phe
Ile / Val
Tyr / Cys
Trp / Arg
Phe / Leu
Ile / Val
Trp / Arg
Asn / Asp
Trp / Ser
1
1
2
1
1
1
1
1
1
3 结论
本研究采用 PCR产物双向测序法，克隆了拟穴
青蟹 COI基因部分序列，通过比对分析鉴定出 29 个
SNPs位点，并进一步分析了其变异特征。本研究将
为拟穴青蟹遗传背景和群体多样性研究提供一种新
的分子标记。
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(责任编辑 李楠)
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