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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):205-210
收稿日期 ： 2015-03-16
基金项目 ：广东省科技计划项目（2011B070500020），广州市科技计划项目（11A24060559），揭阳市产学研合作项目（201429）
作者简介 ：梁青，女，硕士研究生，研究方向 ：有害微生物防治 ；E-mail ：farewellqing@163.com
通讯作者 ：施庆珊，男，研究员，研究方向 ：工业微生物学 ；E-mail ：shiqingshan@hotmail.com
山苍子油对白假丝酵母抗菌活性研究
梁青1，2，3  李文茹2  施庆珊2  章卫民1，2
（1. 中国科学院南海海洋研究所，广州 510301 ；2. 广东省微生物研究所 省部共建华南应用微生物国家重点实验室 广东省菌种保藏与应用
重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室，广州 510070 ；3. 中国科学院大学，北京 100049）
摘 要 ： 研究山苍子油对白假丝酵母菌的抗菌活性，并阐明其可能的抗菌机制。通过水蒸馏法提取山苍子油，并利用气相
色谱 - 质谱联用仪（GC/MS）分析其成分。通过琼脂平板稀释法测定山苍子油对白假丝酵母的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓
度（MFC），并研究山苍子油对白假丝酵母的抗菌动力学 ；同时利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察山苍
子油对白假丝酵母细胞超微结构的影响。结果表明，自提山苍子油主成分为柠檬烯（26.51%），柠檬醛（11.94%）和马鞭烯醇（11.84%）。
山苍子油对白假丝酵母菌的 MIC 和 MFC 均为 1.25 μL/mL ；其抗菌动力学研究表明浓度低于其 MIC 时，山苍子油仅延长白假丝酵
母的生长适应期，并不能彻底杀死细胞 ；SEM 结果表示，山苍子易破坏正在出芽的细胞 ；TEM 显示出山苍子破坏细胞壁，细胞
膜，使细胞裂解。山苍子油具有优良的抗白假丝酵母活性，且白假丝酵母在芽痕处对山苍子油比较敏感，高浓度的精油（5.0 μL/
mL）对细胞产生不可逆破坏 ；山苍子油杀菌的靶标可能是细胞壁和细胞外膜，使细胞内大分子外泄，细胞器变形，最终导致细胞
死亡。
关键词 ： 山苍子油 ；白假丝酵母 ；抗菌活性 ；抗菌动力学 ；扫描电镜 ；透射电镜
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.031
Antifungal Activity of Litsea cubeba Oil Against Candida albicans
Liang Qing1，2，3 Li Wenru2 Shi Qingshan2 Zhang Weimin1，2
（1. South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301 ；2. Guangdong Institute of Microbiology，
State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China，Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and
Application，Guangzhou 510070 ；3. University of Chinese Academy of Science，Beijing 100049）
Abstract:  The work aims to investigate the antifungal activity of Litsea cubeba oil against Candida albicans, and illustrate its antifungal
mechanism. L. cubeba oil was extracted by distillation and the compounds were identified using gas chromatography/mass spectrometry（GC/
MS）. The minimum inhibitory concentration（MIC）and minimum fungal concentration（MFC）were determined by agar dilution method,
and the antifungal kinetics of L. cubeba oil was studied. Finally, scanning and transmission electron microscopy（SEM and TEM）were used
to observe the cell ultrastructure alteration after treated with L. cubeba oil. The main compounds of L. cubeba oil were D-Limonene（26.51%）,
citral（11.94%）and verbenol（11.84%）. The MIC and MFC were both 1.25 μL/mL. Concerning antifungal kinetics, the oil only prolonged the
lag phase of C. albicans, but not completely killed the cells while the concentration of oil below the MIC. Moreover, results of SEM indicated that
C. albicans was destroyed easily at the neck between the mother cell and daughter bud after treated by L. cubeba oil. The results of TEM showed
that the essential oil damaged the cell wall or the cell membrane, leading to the leakage of macromolecules and lysis. Conclusively, L. cubeba oil
had an excellent antifungal activity against C. albicans, the dividing cells showed much more sensitive to L. cubeba oil, and the high concentration
of the oil（5.0 μL/mL）led to irreversible damages of the cells. The targets of L. cubeba oil to fungi were the cell’s wall and outer membrane,
which caused the large molecules leakage and organelles deformation, and finally led the cells to death.
Key words:  Litsea cubeba oil ；Candida albicans ；antifungal activity ；antifungal kinetics ；SEM ；TEM
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10206
白假丝酵母，俗称白色念珠菌，在人类酵母菌
感染中占重要地位［1］。多种形态的白假丝酵母是人
体正常菌群的成员之一，通常存在于正常人口腔，
上呼吸道，肠道及阴道，属于条件致病菌。在正常
情况下不会致病，但在特殊的环境条件下，白假丝
酵母能够引起皮肤表面感染甚至危及生命的系统性
感染［2］。而随着医学的发展，尤其是进入抗生素时代，
人类对抗念珠菌的能力大大提高。但是，长期依赖
抗生素一方面可能会引起严重的系统性念珠病［3］，
另一方面，念珠菌渐增的耐药性也造成了医院病人
真菌感染的高发生率［4］。传统治疗真菌的化学合成
药物如洗必泰，咪唑衍生物易引起如肝中毒，腹泻，
恶心等副作用而不能用于治疗孕妇及儿童［5］。现今，
天然产物具有诸多化学合成药物的优点，例如，减
少了对环境的污染，解决了难降解药物带给环境的
污染，在合理用量内无副作用，适用人群较化学合
成药物广，相对安全，且简单的熏蒸即可达到室内
防霉抗菌功效，具有宜人的香味等，提取工艺比化
学合成药物简单安全，成本低等。因此，关于寻找
一些可能有效的天然产物来解决化学合成药物带来
的负面效果是目前刻不容缓的工作［6］。
山 苍 子 属 于 樟 科， 拉 丁 学 名 是 Litsea cubebe
（Lour.）Pers，多分布在中国南部，日本及东南亚等
地区。其果实常作为香料用于食品，香精及香烟的
加工，也是工业上生产柠檬醛，维他命 A，E 和 K、
紫罗酮、甲基紫罗酮及香水的原材料［7］。我国山苍
子资源丰富，在世界香料市场占有重要地位。目前
多数是从山苍子果实中提炼山苍子油，由于地理差
异，不同地区的山苍子油成分有所差异，而不同的
提取方法得到的的成分也有所差异［8］。山苍子可作
为中药，用于治疗由着凉或者食物不洁等原因引起
的腹泻及腹痛［9］。在农业上山苍子果实还可作为防
腐剂、抗菌剂和杀虫剂［10］。一些研究证实了山苍子
的生物活性，如抗氧化性［11］，抗炎症反应［12］。国
内学者提取山苍子不同部位的精油并对其成分分析
及抗菌活性研究，证实了山苍子精油具有良好的抗
菌活性［12］。其他的研究还表明山苍子油可以抑制一
些对人类身体健康有严重危害的菌群，如副溶血性
弧菌，李斯特菌和异常汉逊酵母菌等［13］。目前，尚
未有关于山苍子油对白假丝酵母抗菌活性对详细报
道，限制了精油的深入应用［14］。本实验利用水蒸馏
法对山苍子果实进行精油提取，并选用白假丝酵母
菌（Candida albicans）ATCC10231 为实验菌株。主
要对山苍子精油抗白假丝酵母进行抗菌活性及动力
学研究，为开发山苍子精油作为潜在的预防及治疗
真菌感染药物提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 白假丝酵母 ATCC 10231 为本研
究室保藏。山苍子购自安徽省亳州市新源堂中药房。
1.1.2 培养基 沙氏液体培养基（SDB，g/L）：蛋白
胨 10，葡萄糖 40，氯霉素 0.1，pH 为 5.6±0.2 ；沙
氏琼脂培养基（SDA，g/L）：蛋白胨 10，葡萄糖 40，
氯霉素 0.1，pH 为 5.6±0.2 琼脂 2%。
1.1.3 主 要 仪 器 光 学 电 子 显 微 镜（Olympus
BX53）、 扫 描 电 子 显 微 镜（Hitachi H-3000N）、 透
射电子显微镜（Hitachi H-7650）、台式微量离心机
（5415D，Eppendorf）、 紫 外 分 光 光 度 计（Ultrospec
6300）、 恒 温 培 养 箱（SHP-250）、 水 浴 摇 床（OLS
200）、TC-15 套式恒温器（新华医疗器械厂）。
1.2 方法
1.2.1 山苍子精油提取 实验选用简易水蒸馏法提
取山苍子油，用搅碎机把山苍子果实充分搅碎，加
双蒸水一起混合加入圆底蒸馏瓶中，加入几颗防爆
沸玻璃珠，电加热套保持恒温 120℃。收集山苍子油，
用棕色瓶保管。
1.2.2 精油成分分析（GC/MS） 采用美国 Thermo
Finnigan 公司的 Trace GC/DSQ 气质联用分析仪。色
谱 柱 为 DB-5ms（ 长 30 mm， 直 径 0.25 mm， 色 谱
填充粒子直径为 0.25 mm）。条件设置 ：初始温度
为 60℃， 保 持 2 min， 然 后 以 10℃/min 的 速 度 迅
速升温至 220℃，保持 15 min 载气为 He，流速 1.0
mL/min。程序升温进样模式（PTV）分流进样，分
流比为 1∶50。进样口温度从 70℃升温至 250℃。
电离方式为 EI，离子源温度为 200℃，四级杆扫描
范围 30-450 m/z，传输温度 250℃。所得样品图在
NIST 质谱库中进行比对。
1.2.3 琼脂稀释法 将白假丝酵母菌接种到沙氏琼
脂斜面上，置 28℃恒温培养箱中培养 2 d。再从斜
2015,31(10) 207梁青等：山苍子油对白假丝酵母抗菌活性研究
面取一环接种到沙氏液体培养基中，培养 8-10 h，
用紫外分光光度计测得 OD600 数值达到 1.0-1.8，即
处于生长对数期。用已灭菌的 PBS 稀释至浓度为
106 CFU/mL 备用。分别向 6 瓶已备好的 SDA 培养基
中加入不同体积的山苍子精油，使其终浓度分别为
0 μL/mL（ 对 照 组 ），0.625 μL/mL，1.25 μL/mL，2.5
μL/mL，5 μL/mL 和 10 μL/mL。充分混匀后倒平板，
每个浓度分别做 3 个平行。待平板凝固后，每个平
板分别加 100 mL 配好的酵母菌液并涂布均匀。最后
用封口膜将平板边缘包裹住，于恒温培养箱 28℃培
养 14 d，观察并记录生长结果。
1.2.4 白假丝酵母生长动力学研究 准备 5 瓶已
灭菌的 SDB 培养基，分别加入不同体积的山苍子
油，使其终浓度分别为 0 μL/mL（对照组），0.625
μL/mL，1.25 μL/mL，2.5 μL/mL 和 5 μL/mL。然后分
别加入一定体积的酵母菌液，使其起始浓度均为 106
CFU/mL。置于 28℃水浴摇床中培养 7 d，转速为
100 r/min。每天定时取样测 OD600。
1.2.5 扫描电镜观察白假丝酵母 准备 3 瓶已灭菌
的 SDB 培养基，加入对数期的酵母菌液使初始菌液
浓度均为 106 CFU/mL。然后分别加入不同体积的山
苍子精油，使其浓度分别为 0 μL/mL，1.25 μL/mL 和
5 μL/mL。继续培养 5 h 后，12 000 r/min 离心 3 min，
用 PBS 洗去培养基。然后按如下步骤处理 ：（1）3%
戊二醛固定 5 h 以上 ；（2）PBS 浸泡洗涤 6 次，每
次 20 min ；（3）30% 乙醇脱水 2 次，每次 10 min ；
（4）50% 乙醇脱水 2 次，每次 10 min ；（5）70% 乙
醇脱水 1 次，每次 15 min，4℃过夜放置（乙醇不需
倒掉）；（6）90% 乙醇脱水 1 次，每次 15 min ；（7）
95% 乙醇脱水 1 次，每次 15 min ；（8）无水丙酮或
者无水乙醇（加无水 CaCl2）3 次，每次 15 min ；（9）
叔丁醇置换 2 次，每次 20 min；（10）冷冻干燥；（11）
样品贴台，溅射喷金，样品制作完成。上述溶液都
需 4℃放置。
1.2.6 透射电镜观察白假丝酵母 准备 3 瓶已灭菌
的 SDB 培养基，加入相同体积的酵母菌液，初始菌
液浓度均了 106 CFU/mL。28℃水浴摇床 100 r/min 培
养 8-10 h，分别加入不同体积的山苍子，山苍子精
油浓度分别为 0 μL/mL，1.25 μL/mL 和 5 μL/mL。处
理 5 h 后，12 000 r/min 离心 3 min，用 PBS 洗去培养基。
戊二醛固定后，经石蜡包埋制成切片，透射电镜观
察精油对酵母细胞超微结构的影响。
2 结果
2.1 精油成分分析
本实验采用水蒸气蒸馏提取得到的山苍子油经
气质联用仪器分析，共得到 24 种化合物（表 1）。
精油主要成分有柠檬烯，柠檬醛，马鞭烯醇，占总
成分的 50.29%。根据沸点不同可分离到不同馏分，
一般来说，低沸点（≤70℃）馏分可分离出 α-蒎烯、b-
蒎烯等萜烯化合物，中沸点（105℃）馏分主要分离
柠檬醛。本实验山苍子油中柠檬醛和 α-蒎烯的含量
分别为 11.94% 和 1.71%。分离到的烯类及醇类化合
物含量分别占了 45.08% 和 21.36%。这些物质可能
对柠檬醛的抗菌活性具有协同作用。
2.2 山苍子油抗白假丝酵母活性实验
采用琼脂平板稀释法测定山苍子油对白假丝酵
母的最低抑菌浓度（MIC）及最低杀菌浓度（MFC），
如图 1 所示。为 28℃培养 14 d 后，对照组在第 1
天已经有明显的白假丝酵母生长（图 1-A），低浓
度精油（0.313 μL/mL）处理后，可以明显看出酵
母菌的生长数量的减少（图 1-B,C）。而浓度增加到
1.25 μL/mL（图 1-D）时，培养 14 d 后没有任何菌落
出现，故山苍子油对白假丝酵母菌的最低抑菌浓度
和最低杀菌浓度均为 1.25 μL/mL。而高浓度处理（2.5
μL/mL 和 5.0 μL/mL）连续培养 30 d 没有任何菌落的
出现。
2.3 山苍子油抗白假丝酵母动力学研究
山苍子油抗白假丝酵母动力学研究，结果如图
2 所示，对照组由于没有精油的影响，接种后迅速
进入对数期，并于 24 h 后进入稳定期。而精油处理
后的实验组都有不同程度的生长延滞现象，精油浓
度为 0.3125 μL/mL 的实验组在培养 60 h 后 OD600 开
始有上升。在 0.625 μL/mL 的处理中，白假丝酵母的
抑制时间延长到 148 h，随后开始逐渐生长。当精油
浓度到达 1.25 μL/mL 和 2.5 μL/mL 时，由于精油浓
度过高，白假丝酵母被严重抑制并死亡，且加速了
细胞的裂解，试管浑浊度降低，OD600 值有下降趋势。
且从试管中取样涂在 SDA 平板上 28℃培养 2 d 没有
任何菌落出现。白假丝酵母生长具有精油剂量依赖
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10208
性现象，低浓度精油抑制其生长，但并不能完全杀
死白假丝酵母，在生长曲线上表现为适应期较对照
表 1 山苍子精油成分分析
序号 RI/min 化合物名称 百分比 /%
1 3.79 香叶烯 0.02
2 4.09 蒈烯 0.74
3 4.32 萜品烯 5.75
4 4.94 2- 莰烯 1.35
5 5.58 皮蝇磷 4.03
6 5.73 3- 亚甲基 -6-（1- 甲基乙基）环已烯 2.47
7 6.28 b- 蒎烯 2.35
8 7.11 右旋柠檬烯 26.51
9 7.19 桉叶油醇 2.12
10 8.01 邻异丙基甲苯 1.27
11 8.94 6- 甲基 -5- 庚烯 -2- 酮 2.80
12 9.78 3- 甲基 -5- 异丙基苯基 -N- 甲基氨基甲
酸酯
0.72
13 11.21 α- 蒎烯 1.71
14 11.62 芳樟醇 5.55
15 12.54 4- 萜烯醇 1.85
16 12.7 长叶烯 4.17
17 13.65 马鞭烯醇 11.84
18 14.26 柠檬醛 11.94
19 15.22 顺式香芹醇 1.15
20 17.2 2，2，7，7- 四甲基 -5，6- 环氧三
环［2.2.1.01，6］十一烷
3.47
21 18.39 桉油烯醇 0.76
22 19.83 癸酸 2.38
23 20.86 （E）-3，7- 二甲基 -2，6- 辛二烯酸乙酯 1.34
24 23.51 月桂酸 3.64
25 其他 0.07
A B C
D E F
A-F ：山苍子精油浓度从分别为 ：0、0.3125、0.625、1.25、2.5 及 5.0 μL/mL
图 1 琼脂平板稀释法测定山苍子对白假丝酵母抗真菌活性
0
0 24 48 72 96
Treatment Time/h
120
0 μL/mL
0.313 μL/mL
0.625 μL/mL
144 168 192
1
2
O
D
60
0
3
1.25 μL/mL
2.5 μL/mL
图 2 山苍子油抗白假丝生长动力学曲线
组明显延长。
2.4 扫描电子显微镜及透射电子显微镜观察白假
丝酵母细胞
扫描和透射电镜结果如图 3 所示，对照组（图
3-A，图 3-D）酵母细胞大小均一，表面光滑，细胞
内部比较均质，细胞壁及细胞膜比较完整。加入 1.25
μL/mL 山苍子油处理 6 h 后，细胞表面开始出现不同
程度的变形，正在进行出芽生殖的细胞受到严重破
坏（图 3-B），TEM 进一步观察显示细胞内部某些细
胞器受到破坏，细胞膜有内陷的趋势（图 3-E，图
3-F）。高浓度山苍子油（5.0 μL/mL）处理后，细胞
严重破坏，整个细胞几乎完全变形直接导致细胞死
亡。透射电镜图可以明显看到细胞质壁分离，细胞
壁边缘模糊，部分细胞膜已经溶解，内部细胞器出
A B C
D
5 μm
E F
5 μm 10 μm
1 μm1 μm1 μm
A，D ：山苍子精油浓度为 0 μL/mL ；B，E ：山苍子精油浓度为 1.25 μL/mL ：
C，F ：山苍子精油浓度为 5.0 μL/mL
图 3 不同浓度精油处理白假丝酵母 SEM 和 TEM 图
2015,31(10) 209梁青等：山苍子油对白假丝酵母抗菌活性研究
（图 3-F）。一般来说，影响细胞壁合成的药物往往能
引起细胞形态明显的变化［26］，而细胞壁膜的破坏使
细胞内大分子泄漏导致细胞死亡［27，28］。
综上所述，本文着重讨论了山苍子油对白假丝
酵母的抗菌活性，其可能的抗菌机制不仅能破坏细
胞壁和细胞膜，同时导致其细胞内部大分子泄漏，
使白假丝酵母无法进行出芽生殖而被彻底杀死细胞。
4 结论
本研究提取到的山苍子油经 GC/MS 分析得到
主成分柠檬醛、柠檬烯和马鞭烯醇，占总成分的
50.29%。经琼脂平板稀释法测定的 MIC 和 MFC 均
为 1.25 μL/mL，生长动力学研究表明白假丝酵母对
山苍子有具有明显的剂量依赖性。利用 SEM 发现山
苍子易破坏正在出芽的细胞，而利用 TEM 发现山苍
子油通过破坏细胞壁和细胞质膜，然后渗入细胞内，
最终导致细胞裂解死亡。
参 考 文 献
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现不同程度的破坏变形（图 3-F）。
3 讨论
精油的提取方法多种多样，而提取部位也有不
同选择，这就导致了同一方法或者同一植物提取的
成分不尽相同［15］。研究报道山苍子精油的抗菌组分
主要是柠檬醛［16］，α-蒎烯［17］等。实验提取的山苍
子油中柠檬醛含量只占 11.94%，而分离到的烯类及
醇类化合物含量分别为 45.08% 和 21.36%，总体比
柠檬醛高出很多。初步抗菌活性实验发现其对白假
丝酵母有较好的抗性，相关报道指出精油的抗菌活
性与其化学组成密切，而多数精油的主成分决定了
其生物活性［18-19］。本实验室利用用商业化成品山苍
子油对大肠杆菌进行实验发现，其对细菌有中等抗
菌功效［20，21］，但商品化山苍子油与实验室自提山
苍子油在成分及含量上有一定的区别。目前，很少
有相关文献报道自提精油和商品化精油在抑菌活性
之间的差异，因为提取方法和提取工艺的差别都会
导致其提取到成分的不同，而且果实的采摘时间、
产地、季节等也会影响最终精油的成分及含量，且
其提取后存储条件及时间等也会影响其抑菌效果的
好坏，国内目前尚无统一的标准。但总体上说，山
苍子油精油具有抗菌活性是不容置疑的。而其表现
出的生物活性可能是基于其多种化学成分的协同
作用［22，23］。
利用琼脂平板法得到的山苍子油对白假丝酵母
的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度与抗菌动力学实验
具有一致性，在精油浓度达到 1.25 μL/mL 时，对白
假丝酵母菌的抑制达到临界点，低于此浓度时，白
假丝酵母的生长有明显的精油剂量依赖性，精油浓
度越大，抑制其生长的时间越长，但延长了其生长
适应期，并不能完全杀死酵母菌 ；高于此浓度时，
山苍子油对白假丝酵母的破坏具有明显的致命性。
SEM 和 TEM 能充分的表明此变化。且 SEM 白假丝
酵母在芽痕处破坏比较严重（图 3-B），这种现象可
能是因为酵母细胞在芽痕处比较敏感，从而使精油
容易渗入造成破坏［24，25］。高浓度的精油处理后 6 h 后，
SEM 表现出细胞的完全变形（图 3-C），TEM 显示白
假丝酵母的细胞壁，细胞膜均遭受不同程度的破坏，
整个细胞内部稳态已经被严重破坏，细胞无法存活
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（责任编辑 李楠）