全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(9):79-83
PCR 技术，自 1983 年美国人 Kary Mullis 发明
以来，已经成为分子生物学及其相关领域最基本、
最重要的技术方法。如今，从基因扩增与基因检测
到基因克隆、基因改造、遗传分析等都已离不开
PCR 技术［1，2］。另外，在病原微生物检测、法医鉴定、
考古研究食品安全及品种鉴定等多领域 PCR 技术也
发挥着重要作用［3-7］。
PCR 方法的前提条件是获得 DNA 或 RNA 反转
录的 cDNA 模板。DNA 的提取方法主要有十二烷基
磺 酸 钠（Sodium dodecyl sulfonate，SDS） 提 取 法［8］
和十六烷基三乙基溴化铵（Hexadecyltrimethyl ammo-
nium bromide，CTAB）提取法［9］，或者直接从试剂公
司购买提取试剂盒。这些方法虽能得到较高质量的
DNA，但需样品量较大，且操作步骤较繁琐，效率
收稿日期 ：2015-01-09
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31301618）
作者简介 ：罗中钦，男，博士，研究方向 ：蔬菜病原微生物致病机理 ；E-mail ：lzhqin@163.com
通讯作者 ：陈国华，女，博士，研究方向 ：蔬菜抗病育种 ；E-mail ：chenguohua01@caas.cn
丝状真菌 PCR 模板 DNA 的快速制备方法
罗中钦1  程琳2  张茜3  陈国华1
（1. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081 ；2. 山西师范大学生命科学学院，临汾 041004 ；3. 北京师范大学生命科学学院，
北京 100875）
摘 要 ： 以尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）为材料，旨为建立沸水浴获得 PCR 模板 DNA 的新方法。】取少量真菌菌丝置
于一定体积 50 mmol/L NaOH 溶液中沸水浴 10 min，再加入 1/10 体积 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液，12 000 r/min 离心后，上清
用作 PCR 的 DNA 模板。结果显示，该方法扩增效率高，扩增条带清晰，且 Taq 酶适应性强，适合快速制备丝状真菌的模板 DNA。
该方法经济、简单、快速、安全高效，可用于丝状真菌转化子的高通量筛选和菌株的快速鉴定。
关键词 ： 丝状真菌 ；尖孢镰刀菌 ；PCR 扩增 ；Taq DNA 聚合酶
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.010
A Rapid Method of Preparing DNA Template of Filamentous Fungi for
PCR Amplification
Luo Zhongqin1 Cheng Lin2 Zhang Xi3 Chen Guohua1
（1. Institude of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081 ；2. College of Life Science，Shanxi
Normal University，Linfen 041004 ；3. College of Life Science，Beijing Normal University，Beijing 100875）
Abstract: This work aims to establish a novel method of extracting DNA template of filamentous fungi for PCR amplification with boiling-
water bath and Fusarium oxysporum as raw material. The procedures of this method are as the following ：exposing the fungal mycelia in certain
volume of 50 mmol/L NaOH solution under boiling water bath, adding 1/10 volume of 1mol/L Tris-HCl（pH8.0）buffer, centrifuging it at
12 000 r/min for 10 min, and using the supernatant as the DNA template for PCR amplification. Results demonstrated that the efficiency of PCR
amplification with the DNA template prepared by the method was high, the amplified bands were clear, and adaptability to various Taq DNA
polymerases was strong ；This indicated that the method was suitable for the preparation of DNA template of filamentous fungi. Conclusively, this
method is economic, simple, rapid, safe and high-efficient, and can be utilized for high-throughput screening of filamentous fungal transformants
and rapid identification of isolated strains.
Key words: filamentous fungi ；Fusarium oxysporum ；PCR amplification ；Taq DNA polymerase
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.980
低，难以满足对大量样品检测的需求。另外，对于
样品检测实验需要的模板量少，常规 DNA 提取方法
提取的大量 DNA 未被充分利用，造成了浪费。为解
决以上问题，研究人员开发多种简单、快速的获得
DNA 模板的方法，如微量玻璃粉吸附、Chelex-100
法、微波处理、TE 缓冲液沸水煮、NaOH 溶液处理
等，通过处理植物叶片、真菌菌丝等样品获得模板
DNA［10-16］。GE 公司的 Whatman FTA 卡仅用一张卡
片就可以完成室温下 DNA 和 RNA 的采集、运输、
纯化和储存，为血样、口腔细胞、植物 DNA 等样本
的保存和分析提供了简单、可靠的方法［17，18］。但是，
这些方法多为传统方法的改良，程序较复杂或需要
特殊的仪器、试剂或相关配套产品，因此成本较高。
对于丝状真菌而言，遗传转化子筛选和野外样
本菌株鉴定往往需要对大量样本进行 PCR 扩增，且
所需的 DNA 模板量又很少，而丝状真菌细胞壁结构
复杂又无法使用普通的菌落 PCR［19，20］。因此，本
研究以尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）为材料，
结合前人研究成果，建立一种用于丝状真菌 PCR 模
板 DNA 的快速制备方法，即利用 NaOH 溶液对丝
状真菌的菌丝进行简单的沸水浴处理，再加入 Tris-
HCl 中和即可得到适用于 PCR 的 DNA 模板，该方
法经济、简单、快速、高效，旨在为丝状真菌转化
子的高通量筛选和分离菌株的快速鉴定提供技术
支持。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验室保存的尖孢镰刀菌甘蓝专化型 A8 和
其他丝状真菌菌株 18 个。尖孢镰刀菌和其他真菌菌
株接种于含 100 mg/L 氨苄青霉素钠和头孢噻肟钠的
PDA 平板上，28℃培养 4 d，备用。
1.2 方法
1.2.1 菌丝处理 取 4 个 1.5 mL 离心管，分别标记
为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，Ⅰ号离心管加入无菌水 50 μL，
Ⅱ号离心管加入 1×TE 缓冲液 50 μL，Ⅲ号离心管
加 入 100 mmol/L Tris-HCl 缓 冲 液（pH8.0）50 μL，
Ⅳ号离心管加入 50 mmol/L NaOH 溶液 50 μL。用无
菌牙签挑取少量菌丝到各离心管中，涡旋打散菌丝，
沸水浴 10 min。Ⅳ号离心管中再加入 5 μL 1 mol/L
Tris-HCl（pH8.0）缓冲液。12 000 r/min 离心 10 min。
取上清至新离心管中，即为制备的模板 DNA，-20℃
保存备用。
1.2.2 PCR 扩增 以 1.2.1 得到的 DNA 为模板，SDS
提取法得到的 100 ng/μL DNA（CK+）和无菌水（CK-）
分别为阳性和阴性对照，引物选用 2 对真菌检测
的通用引物和 10 对尖孢镰刀菌特异引物（表 1）。
Taq DNA 聚 合 酶 选 自 于 5 家 公 司 ：天 根 Taq DNA
polymerase（ 货 号 ：ET101-01-03）、TaKaRa Ex Taq
（货号 ：RR001A）、全式金 EasyTaq DNA polymerase
（货号 AP111-01）、博迈德 Taq DNA polymerase（货
号 ：PC0101）和康为世纪 Taq DNA polymerase（货
号 ：CW0680）， 编 号 为 T1、T2、T3、T4 和 T5（ 编
号顺序与上述提到的公司顺序无对应关系）。除酶适
应性实验中用到 5 种酶外，其余均使用酶 T1。PCR
反应体系为 20 μL ：模板 2.0 μL（模板用量实验中分
别 用 0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 和 8.0 μL），10×Taq
buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，10 μmol/L 正
反向引物各 0.5 μL，5 U/μL Taq 酶 0.2 μL，加 ddH2O
补足到 20 μL。PCR 反应程序为 ：95℃ 3 min ；95℃
30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，30 个 循 环 ；72℃ 8
min。PCR 反 应 完 成 后， 向 PCR 产 物 中 加 入 4 μL
6×loading buffer，混匀，取 10 μL 进行琼脂糖电泳
检测，Marker 为全式金 trans2K Plus DNA Marker。
2 结果
2.1 不同方法制备的DNA模板PCR扩增效率比较
用 4 种方法制备的模板 DNA 进行 PCR 扩增，
结果如图 1 所示。用 1×TE 缓冲液沸水浴（方法Ⅱ）
制备的模板 DNA 和 50 mmol/L NaOH 溶液沸水浴后
再加 1/10 体积 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液（方
法Ⅳ）制备的模板 DNA 与阳性对照（CK+）扩增结
果一致，2 对通用引物及 5 对特异引物都能得到清
晰的电泳条带，而 100 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH8.0）
沸水浴（方法Ⅲ）制备的模板 DNA 只有通用引物扩
增得到了清晰的条带，特异引物扩增只得到微弱的
条带，无菌水沸水浴（方法Ⅰ）制备的模板 DNA 只
有 18S rDNA 通用引物得到微弱条带，其余引物均没
有条带。所以，方法Ⅱ和Ⅳ所制备的模板 DNA，用
T1 酶进行扩增，能得到理想的结果。
2015,31(9) 81罗中钦等 ：丝状真菌 PCR 模板 DNA 的快速制备方法
2.2 DNA模板对Taq DNA聚合酶的适应性
用实验室常用的 5 个不同公司的 Taq DNA 聚合
酶，以方法Ⅱ和Ⅳ所制备的 DNA 为模板进行 PCR，
结果如图 2 所示。方法Ⅳ得到的模板 DNA 用 5 个公
司的酶扩增都能得到清晰条带，但条带亮度有所不
同，而以方法Ⅱ得到的模板 DNA，只有用 T1 酶才
能扩增出条带。所以，方法Ⅱ所得到的模板 DNA 可
以用来进行 PCR 检测，但需要选择活性较高的酶，
做检测前需要进行预备实验，检验所用酶是否能用
于该方法制备的模板 DNA ；而方法Ⅳ得到的模板
DNA 对酶的适应性较好，5 种酶都可用，比方法Ⅱ
更具优势。
2.3 不同模板用量对PCR结果的影响
由于使用沸水浴制备的模板 DNA 都是微量的，
无法准确测得其浓度，故而使用不同模板 DNA 溶液
体积进行实验。用方法Ⅳ制备的模板 DNA 0.2-8.0
μL 进行 PCR 反应，结果（图 3）显示，模板用量为
2 μL 时，条带最清晰，模板量高于或低于 2 μL 条带
亮度减弱。这是由于该方法制备的模板 DNA 中含有
其他杂质（如 NaOH、Tris-HCl 等），当加入的模板
量高时会抑制 Taq 酶的活性，模板量低，DNA 量少，
表 1 PCR 引物
引物名称 引物序列（5-3） 引物名称 引物序列（5-3）
fung5 GTAAAAGTCCTGGTTCCCC ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG
EF4 GGAAGGGRTGTATTTATTAGav ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
SP1F CAAGCCCTCTACAGCCAACAATC SP6F AAGCAGCGGATTGTGCGAAAG
SP1R CATAGTTCGCCAATGCTCTGTCTG SP6R CCTGACAACGACCAAATCCTCTG
SP2F GACTCCGAAGAAGCCCACAAG SP7F ACCAGCCGTTTCACTGTTTCG
SP2R GGTGAAGGCACTGACGATAGG SP7R GACAGGAATCTCAAGCCAG
SP3F TCTTGGTTTGTTTCACCCTGC SP8F CGCAGCAAAGCCAATGAAGG
SP3R CACCAGAGGCATACACCTAATCC SP8R AACGCAGCAACGCAGAGCAC
SP4F CTTTGCCCAATAAGAAACCACATC SP9F TCTTGGTTTGTTTCACCCTGC
SP4R TCGCTCAGACATCTCCTCAACAAC SP9R CACCAGAGGCATACACCTAATCC
SP5F CAAAATGCCCCGTGAAGAGTAC SP10F GGTCCTGTCTGGGTTGAGTTCC
SP5R TCAATCACGCAGACTGTAACTCG SP10R ACCAGCCGTTTCACTGTTTCG
注 ：引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PAGE 纯化。Fung5 和 EF4 为 18S rDNA 通用引物 ；ITS1 和 ITS4 为 ITS 通用引物
1 2 3 4 CK+ CK-
18S
ITS
SP1
SP2
SP3
SP4
SP5
1-4 ：分别为 I、II、III、IV 方法 ；CK+ ：阳性对照 ；CK- ：阴性对照
图 1 不同方法制备的尖孢镰刀菌 DNA 模板 PCR 扩增结果
T1 T2 T3 T4 T5
18S
ITS
SP2
SP3
SP5
T1 T2 T3 T4 T5
18S
ITS
SP2
SP3
SP5
A
B
A ：方法 II ；B ：方法 IV
图 2 不同方法制备的尖孢镰刀菌模板 DNA 用不同 Taq
DNA 聚合酶的 PCR 扩增结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.982
条带也较弱。因此，使用方法Ⅳ制备的模板 DNA 时，
用量控制在 1-4 μL 为佳。
2.4 不同大小片段的PCR扩增
以方法Ⅳ制备的 DNA 为模板，重新选用 5 对扩
增片段大小不同的引物，进行 PCR 扩增，结果（图 4）
显示，扩增大小从 396-1978 bp 均得到单一清晰条带，
片段范围已能满足真菌检测的需要。
2.5 方法Ⅳ在其他丝状真菌菌株鉴定中的应用
选用本实验室保存的丝状真菌菌株 18 个，挑取
菌丝用方法Ⅳ制备模板 DNA，扩增其 18S rDNA 和
ITS 片段，结果如图 5 所示。18 个菌株与阳性对照
一样都能得到清晰单一的条带，说明方法Ⅳ除可以
制备尖孢镰刀菌模板 DNA 外，对其他丝状真菌也可
以制备适合 PCR 的模板。
3 讨论
本研究结果表明，方法Ⅳ可以制备优质的 PCR
模板 DNA。实际应用中可以根据需要减少或加大
NaOH 溶液体积，再用 1/10 体积的 1 mol/L Tris-HCl
（pH8.0）缓冲液中和即可，根据体积变化适当增加
或减少菌丝量。
用 NaOH 溶液直接处理粗样品的方法在水稻、
小麦和海洋浮游生物等研究中都有应用，如汪秀峰
等［16］ 用 250 mmol/L 的 NaOH 溶液处理水稻叶片，
处理过后用 HCl 和 Tris-HCl 中和，而后取出处理过
的水稻叶片作为 PCR 模板，但该法每次 PCR 得用 1
小块叶片，加大了样品的使用量，同时也给 PCR 增
加了额外的步骤 ；刘鹏等［13］用 100 mmol/L 的 NaOH
溶液处理小麦幼叶，但还需经酚氯仿抽提，异丙醇
沉淀，比传统方法只是省去了液氮速冻和样品研磨，
还不够简化 ；刘泳等［14］用 125 mmol/L 的 NaOH 处
理海洋浮游生物，25℃处理 8 h 以上，然后 99℃加
热 10 min， 再 加 入 HCl、Tris-HCl 和 TritonX-100 混
合，再次 99℃加热 10 min，此法虽简化了步骤，但
是耗时过长。以上的方法与本研究建立的方法相似，
但都不够简化，这可能与样品的复杂性相关，有些
步骤不可或缺，否则无法达到 PCR 模板的要求。对
于丝状真菌，陈吉良等［12］建立了一种用 10%（W/V）
的无菌 Chelex-100 树脂溶液经沸水浴制备 PCR 模板
DNA 的方法，但样品在处理前需要液氮适当研磨。
此法步骤简单，但需要特殊试剂，成本相对较高 ；
潘力等［15］也建立了一种微波处理置于 10 × TE 缓
冲液中的菌丝获得 DNA 的方法，但未对该方法获
0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 μL
18S
ITS
SP2
SP4
SP5
1-6 ：DNA 模板用量分别为 0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 和 8.0 μL
图 3 方法 IV 制备的尖孢镰刀菌不同模板 DNA 用量 PCR
扩增结果
1 2 3 4 5 6
2000
bp
1000
750
500
250
图 4 方法 IV 制备的尖孢镰刀菌模板 DNA 不同大小 DNA
片段的 PCR 扩增结果
18S
CK+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 CK-
ITS
1. Epicoccum sorghinum ；2.Paraphaeosphaeria angularis ；3.Sclerotinia sclerotiorum ；4.Fusarium equiseti 5.Glomerella acutata ；6.Colletotrichum simmondsii ；
7.Nigrospora sphaerica ；8.Botryotinia fuckeliana ；9.Gibberella zeae ；10.Engyodontium album ；11.Colletotrichum capsici ；12.Sarocladium attenuatum ；
13.Curvularia lunata ；14.Nectria cinnabarina ；15.Fusarium sacchari ；16.Setosphaeria rostrata ；17.Gibberella avenacea ；18.Bipolaris panicimiliacei
图 5 其他丝状真菌菌株 18S rDNA 及 ITS 扩增结果
2015,31(9) 83罗中钦等 ：丝状真菌 PCR 模板 DNA 的快速制备方法
得的模板 DNA 进行 Taq DNA 聚合酶适应性的研究，
而本研究发现 TE 处理（方法Ⅱ）的样品具有 Taq
酶选择性，只适用于少数 Taq DNA 聚合酶。
相对于上述方法，本研究建立的方法具有以下
优点 ：（1）直接从菌落挑取菌丝，不需要液体培养，
不需要磨样，减化了实验步骤，大大减少了实验时
间，同时也减少了被污染的几率 ；（2）不需使用液
氮，只需普通的 NaOH 和 Tris-HCl 试剂，且用量少，
仪器需要普通离心机、水浴锅或者电磁炉即可，成
本低廉 ；（3）实验人员可避免接触酚、氯仿等毒性
有机试剂，安全可靠。
4 结论
本研究以尖孢镰刀菌为材料，通过对 4 种方法
的比较筛选，建立了一种快速制备丝状真菌 PCR 模
板 DNA 的方法。该方法制备模板 DNA，无需液氮
和研磨，只需少量 50 mmol/L NaOH 溶液及 1 mol/L
Tris-HCl，沸水浴 10 min 及离心 10 min 即可，可采
用实验室常用的各种 Taq DNA 聚合酶扩增出 18S
rDNA 和 ITS 片段及 400 bp-2 000 bp 大小范围的特
异片段。另外，本法也适用于其他丝状真菌，可为
实验室大量丝状真菌的转化子及菌株的鉴定提供经
济、 简单、 快速、 安全和高效的方法。。
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（责任编辑 狄艳红）