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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
细菌可以合成一种被称为自身诱导物质的信号
分子，根据特定的信号分子的浓度可以监测周围环
境中自身或其它细菌的数量变化，当信号达到一定
的浓度阈值时，能启动菌体中相关基因的表达来适
应环境的变化，这一机制称为群体感应［1］。对该机
制研究得最深入的是海洋发光弧菌（Vibrio fischeri）
的生物荧光发光机理［2］。该细菌共生在一些真核生
收稿日期 ：2013-01-30
基金项目 ： 教育部留学回国人员科研启动基金项目［（2011）1139 号］，河北大学引进人才项目（2010-185），山东省中青年科学家奖励基金
项目（BS2009NY014），国家自然科学基金项目（30800682）
作者简介 ：刘征，男，副教授，研究方向 ：植物分子生理 ；E-mail ：liuzhengxp@yeah.net
一个新型原核诱导表达系统的建立
刘征1  高双成2  杨尚君1  孙宁3  杜蕊1  赵彦宏4
（1. 河北大学生命科学学院，保定 071002 ；2. 河南科技大学农学院，洛阳 471003 ；3. 保定师范附属学校，保定 071000 ；
4. 鲁东大学农学院，烟台 264025）
摘 要 ： 群体感应是细菌依赖于种群密度进行信息交流、协调群体行为并调控基因表达的一种方式。海洋发光弧菌 Vibrio
fischeri 利用该机制合成化学物质 N-酰基-高丝氨酸内酯（AHLs），与 LuxR 蛋白结合，随后驱动下游生物荧光基因的高量表达。基
于植物叶绿体起源于原始古细菌 - 蓝藻的假设以及叶绿体内的转录、翻译机制与原核生物高度近似，构建了 luxR 基因调控下游报
告基因 GFP 表达的叶绿体遗传转化载体。将该载体转入大肠杆菌后，当无外加信号物质 AHLs 时，GFP 不表达 ；而外加 AHLs 后，
GFP 大量表达，证明 luxR 和 GFP 基因的组合在大肠杆菌中是理想的化学诱导基因表达系统，可应用于大肠杆菌基因功能的研究。
关键词 ： 群体感应 LuxR 基因 AHLs 化学诱导基因表达 叶绿体表达载体
Establishment of a Novel Prokaryotic Inducible Expression System
Liu Zheng1 Gao Shuangcheng2 Yang Shangjun1 Sun Ning3 Du Rui1 Zhao Yanhong4
（1. College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002 ；2. College of Agronomy，Henan University of Science and Technology，
Luoyang 471003 ；3. The Affiliated School of Hebei Baoding Normal，Baoding 071000 ；
4. School of Agriculture，Ludong University，Yantai 264025）
Abstract:  Quorum sensing is a term to describe bacterial communications, coordination of population behaviors and regulation of gene
expressions depending on population density. Marine luminous bacterium Vibrio fischeri utilizes this mechanism to synthesize signal molecules
N-Acyl homoserine lactones（AHLs）which serve as co-inducers with a transcriptional activator protein（LuxR）to regulate the expression
of a set of target genes in an extremely high level. Based on the hypothesis that chloroplasts of higher plants were derived from cyanobacteria in
ancient times and that the transcriptional and translational mechanisms of chloroplasts are highly similar to that of prokaryotes, we constructed
that chloroplast transformation vector of the reporter gene GFP under the control of LuxR-dependent activation of the lux operon. The construct
was then transformed into Escherichia coli. When no signal molecule of AHLs was added to the colonies, no GFP expression was detected.
However, when AHLs were added, GFP expression was strong enough to be detected by naked eyes under ultraviolet lamp, demonstrating that
the combination of the GFP gene and the lux operon is an ideal chemical inducible gene expression system which can then be used for studies of
gene function in Escherichia coli.
Key words:  Quorum sensing LuxR gene AHLs Chemical inducible gene expression Chloroplast transformation vector
物寄主的特殊发光器官中，并保持相当高的种群密
度，从而为寄主提供光源［3］。对其发光机理的分析
表明，一类 N-酰基-高丝氨酸内酯（AHLs）的信号
物质在调控该细菌发光中起着关键的作用［4］。该细
菌构成群体感应机制的两个关键基因元件是 LuxI 和
LuxR。LuxI 基因表达的蛋白负责 AHLs 信号物质的
合成，当 AHLs 达到一定的临界浓度时，便与 LuxR
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期146
基因表达的蛋白结合，LuxR 蛋白与 AHLs 的复合物
随即结合在 lux 操纵元的启动子部位，激活下游操
纵元 luxICDABE 的 6 个基因表达，结果导致 LuxI 蛋
白大量合成 AHLs，以及 LuxCDABE 5 个基因的高量
表达，最终 LuxCDABE 5 个蛋白组合在一起并发出
生物荧光［3］。LuxR 蛋白是 250 个氨基酸组成的多
肽，它由两个结构域组成［5，6］，其 C 末端结构域与
lux 操纵元的调控 DNA 序列结合，并通过与 σ70RNA
聚合酶作用，激活下游 lux 操纵元基因的表达。当
AHLs 不存在或未达到一定临界浓度时，LuxR 蛋白
的 N 末端结构域阻遏其 C 末端的活性 ；而当 AHLs
与 LuxR 蛋白结合后，N 末端解除 C 末端的阻遏，具
有活性的 C 末端结构域随即与 RNA 聚合酶结合，并
转录下游的基因［5，7］。因此，AHLs 调控依赖 LuxR
的 lux 操纵元基因表达是一个天然、理想的化学诱
导表达系统。
鉴于此，并基于高等植物的叶绿体起源于原始
的古细菌 - 蓝藻的假设［8-10］，转录、翻译机制与原
核生物十分接近［11，12］，本研究构建 LuxR 调控报告
基因 GFP 表达的叶绿体遗传转化载体，通过外加
AHLs 来调控 GFP 在特定时间表达，并在原核生物
大肠杆菌中检验该体系的效果，旨在为今后用于大
肠杆菌基因功能的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
感受态大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 和质
粒 pUMZL 为本室保存，质粒 pZSJH1rrnGFP 由英国
剑桥大学 Christine Newell 博士惠赠 ；引物合成及测
序由北京华大基因完成 ；Phusion 高保真 DNA 聚合
酶购自 NEB 公司（美国）；dNTP 购自上海生工公
司 ；DNA marker、限制性内切酶 EcoR I 和 Not I 购
自 Fermentas 公司（立陶宛）；T4 DNA 连接酶、质粒
小提试剂盒、胶回收试剂盒购自北京庄盟国际生物
基因科技有限公司 ；p-EASY-Blunt 载体购自北京全
式金生物技术有限公司 ；N-Hexanoyl-DL-homoserine
lactone 信号物质购自 Sigma-Aldrich 公司（英国）。
1.2 方法
1.2.1 目的片段克隆与测序 含目的基因 LuxR 的
lux 操纵元构建来自于本室保存的质粒载体 pUMZL。
根据 GenBank 中相应的核苷酸序列（AF170104）设
计上下游引物为 ：5-CTGCGGCCGCTTAATTTTTAA-
AGTATGGGCAA-3 ；5-CGGAATTCACCAACCTCCC-
TTGCGTTTA-3（下划线分别为 Not I 和 EcoR I 酶切
位点）。
预计片段扩增长度为 989 bp。以 15 ng pUMZL
质粒 DNA 为模板，进行 PCR 扩增，反应条件为 ：
95℃预变性 1 min ；95℃变性 20 s，65℃退火 20 s，
72℃延伸 30 s，共 35 个循环 ；72℃延伸 7 min，最
后 -20℃保存。将 PCR 产物在 0.8% 琼脂糖凝胶中电
泳，切取目的片段，胶回收扩增片段（胶回收操作
见北京庄盟国际生物基因科技有限公司胶回收试剂
盒说明书），与 p-EASY-Blunt 载体按摩尔数比 3∶1
连接，于 16℃反应过夜，然后转化 DH5α 感受态细胞，
在含氨苄青霉素 75 μg/mL 的 LB 培养板上，37℃培
养 12-16 h。挑取单菌落，37℃液体 LB 培养基（含
卡那霉素）过夜培养，提取质粒进行限制性酶切分
析鉴定，经鉴定正确的克隆送北京华大基因测序。
1.2.2 含 lux 操纵元的叶绿体遗传转化载体的构建
选 择 测 序 正 确 的 p-EASY-Blunt luxR 载 体， 用 Not
I 和 EcoR I 将 p-EASY-Blunt luxR 和 pZSJH1rrnGFP
载 体 进 行 双 酶 切（pZSJH1rrnGFP 载 体 的 rrn 启 动
子两边分别为 Not I 和 EcoR I 酶切位点［13］），胶回
收目的片段和切除叶绿体 rrn 启动子的线性化载体
pZSJH1rrnGFP，用 T4 DNA 连接酶连接过夜，连接
产物转化 DH5α 感受态细胞，在含氨苄青霉素的 LB
培养板，37℃培养 12-16 h，挑取阳性单菌落，增菌。
提取质粒进行限制性酶切分析鉴定，经鉴定正确的
克隆送北京华大基因测序。
1.2.3 重组质粒在大肠杆菌中诱导表达 将测序正
确的重组目的质粒命名为 pZSJH1luxRGFP，经鉴定
阅读框架正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌 DH5α
感受态细胞，涂板、挑取单菌落，在含氨苄青霉素
的平板培养基上，用灭菌牙签接种划线，于 37℃
过夜培养。长出的菌斑在紫外灯下观察 GFP 的表
达。然后在无菌条件下，在菌斑上直接滴加 5 μL
（100 μg/mL）的信号物质 N-Hexanoyl-DL-homoserine
lactone，然后在 37℃培养 2 h，紫外灯下观察 GFP
的表达。
2013年第8期 147刘征等 ：一个新型原核诱导表达系统的建立
2 结果
2.1 包含LuxR基因的lux操纵元的克隆与测序
以本室保存的含 LuxR 基因的 lux 操纵元的质粒
载体为模板，用克隆引物扩增得到该操纵元构建的
DNA 片段，经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳，在预期位置
出现约 1 kb 的强条带（图 1）。
双酶切后，分别经胶回收 lux 操纵元片段和不含 rrn
启动子的 pZSJH1rrnGFP 线性化载体片段，连接并转
化感受态细胞后，对阳性单菌落扩增，并提取质粒，
进行酶切。酶切产物经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳，在约
1 kb 的位置有一条带，与预期结果相符（图 3）。
21226
bp
M 1 2
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4268
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1375
947
831
M ：λ DNA marker ；1，2 ：PCR 产物
图 1 lux 操纵元（包含 LuxR 基因）序列的 PCR 扩增
M ：λ DNA marker ；1 ：p-EASY-Blunt luxR 的 Not I 和 EcoR I 双酶切
图 2 重组质粒 p-EASY-Blunt luxR 的双酶切检测
M ：λ DNA marker ；1，2 ：pZSJH1luxRGFP 的 Not I 和 EcoR I 双酶切
图 3 叶绿体遗传转化载体 pZSJH1luxRGFP 的双酶切检测
PCR 产物经胶上回收后，与 p-EASY-Blunt 载体
连接，转化感受态细胞。挑取阳性单菌落，经增菌、
提取质粒后用限制性内切酶 Not I 和 EcoR I 进行双
酶切。酶切产物经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳，在预期位
置也出现约 1 kb 的条带（图 2），表明 PCR 扩增产
物已成功连接入 p-EASY-Blunt 载体。
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将酶切正确的载体测序，并在 GenBank 中 Blast
搜索、比对，结果显示与海洋发光弧菌（Vibrio fischeri）
的 LuxR 基因及其操纵子调控序列完全匹配，同源性
为 100%，该质粒载体命名为 p-EASY-Blunt luxR。
2.2 叶绿体遗传转化载体的构建与鉴定
pZSJH1rrnGFP 载 体 和 p-EASY-Blunt luxR 载 体
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bp
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将此重组载体测序显示读码框正确，将其命名
为 pZSJH1luxRGFP（图 4）。
AAT GTA
EcoR I Not I
accD LuxR
PLuxR Lux䈳᧗ݳԦ
GFP TrrnB Tpsba aadA
Prrn
rbcL
图 4 高等植物叶绿体遗传转化载体 pZSJH1luxRGFP 结构
2.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
将重组细菌在平板上划线，于 37℃过夜培养，
在紫外灯下未观察到 GFP 的表达，菌斑颜色未发生
变化 ；然后将该菌滴加 5 μL（100 μg/mL）的信号物
质 N-Hexanoyl-DL-homoserine lactone，然后在 37℃培
养 2 h，紫外灯下观察发现菌斑呈绿色，表明在信号
物质诱导下，GFP 表达（图 5），说明 GFP 的表达受
信号物质调控。
3 讨论
含 LuxR 基因的 lux 操纵元结构是海洋发光弧菌
Vibrio fischeri 群体感应系统的重要构件，该操纵元包
含两个启动子元件，一个启动子驱动 LuxR 基因的转
录，第二个启动子可结合 LuxR 蛋白与信号物质的
复合物，从而促使 RNA 聚合酶转录下游的基因。在
V. fischeri 中，若无信号物质，则 LuxR 蛋白无法与
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期148
第二个启动子结合，下游基因不能转录。因而可以
将该操纵元改造成一种可应用于原核生物及高等植
物叶绿体的化学诱导基因表达系统。
pZSJH1rrnGFP 是早期应用于高等植物叶绿体遗
传转化的质粒载体。在该载体中叶绿体 rRNA 操纵
元的启动子 rrn 驱动下游报告基因 GFP 组成型表达，
从 pZSJH1rrnGFP 物理图谱可知，rrn 启动子两端含
有 Not I 和 EcoR I 酶切位点［13］，说明该启动子能被
Not I 和 EcoR I 切割掉，并可在该质粒的原启动子部
位连入目的操纵元构建，以驱动下游 GFP 报告基因
的表达。lux 操纵元的酶切位点分析表明，该构建不
含限制性酶切位点 Not I 和 EcoR I，因此用 PCR 的
方法在 lux 操纵元两端分别加上 Not I 和 EcoR I 位点，
酶切后形成黏性末端，能成功地取代 pZSJH1rrnGFP
中原先的启动子 rrn。由于 Not I 和 EcoR I 酶切所形
成的黏性末端不同，这样 lux 操纵元被定向插入到
GFP 基因原先启动子的位置，可以正确驱动 GFP 基
因的表达。
Lux 操纵元包含 LuxR 基因及其启动子以及下游
调控 RNA 聚合酶转录的 DNA 调控元件。LuxR 蛋白
表达后，如果此时外加 AHLs 信号物质，则 AHLs
与 LuxR 蛋白形成复合体，结合于 LuxR 基因下游调
控原件，可以启动下游基因的表达［5，7］。正是基于
此，我们构建了 lux 操纵元调控报告基因 GFP 表达
的叶绿体遗传转化质粒载体，并通过外加 AHLs 信
号物质，在特定时间诱导 GFP 基因表达。经在大肠
杆菌中检测，当没有 AHLs 加入菌落中时，细菌在
紫外灯下没有放射绿色荧光，表明没有 GFP 的表达；
而当施加 AHLs 信号物质后，经 37℃培养细菌仅 2 h，
就发现在紫外灯下有强烈的绿色荧光发射，说明该
体系经改造，在细菌中可以作为一种化学诱导表达
系统加以利用。比如，若将 GFP 基因换做别的蛋白
合成基因（单顺反子或多顺反子），就能够通过施加
信号物质，在特定的时间收集、提取所需要的蛋白，
而且可以避免该蛋白由于组成型表达，其代谢产物
可能在细菌生长特定阶段对其造成某种不可预知的
伤害。同时还观察到，在 GFP 诱导表达的菌斑边缘，
绿色荧光很明亮 ；而整个菌斑则绿色较暗。很明显，
菌斑边缘的细菌密度要低于菌斑中间的密度，暗示
着较高的细菌密度可能对 LuxR 蛋白诱导下游 GFP
的表达有一定的抑制作用。
总之，该试验通过构建叶绿体遗传转化载体，
并在大肠杆菌中进行表达试验，证明在大肠杆菌中
lux 操纵元驱动 GFP 基因表达的构建是一种理想的
化学诱导表达系统，可通过外加信号物质 AHLs 控
制 lux 操纵元下游的基因表达，为研究大肠杆菌特
定基因的功能提供了一种工具，并可将外源重要基
因置于该操纵元件调控之下，在特定时间大量收集
所需要的外源蛋白。另外，比较基因组学和种系遗
传学的研究表明高等植物的叶绿体起源于原始的
古细菌蓝藻［8-10］，转录、翻译机制与原核生物类
似［11， 12］，因此该载体可尝试高等植物叶绿体遗传转
化，进而探讨该体系在高等植物中诱导表达的效率，
验证一种新型的高等植物叶绿体中的化学诱导表达
系统的可行性，并为进一步研究叶绿体基因功能提
供一种新的选择。本研究同时也证明叶绿体遗传转
化载体可用于原核生物基因表达的研究。
4 结论
本研究将 lux 操纵元下游连接报告基因 GFP，
构建了信号物质 N-酰基-高丝氨酸内酯（AHLs）化
学诱导表达系统的叶绿体遗传转化载体，并在大肠
杆菌进行表达测试，证明该系统是一种新型、高效
的原核诱导表达系统，可在大肠杆菌中进行基因功
能的研究，并可利用此系统在特定时间从大肠杆菌
中高效收集外源蛋白。
参 考 文 献
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A B
A：未加信号物质时，菌斑没有 GFP 的表达，在紫外灯下菌斑颜色未呈绿色；
B: 当滴加信号物质后，紫外灯下菌斑即有强烈的绿色荧光发射
图 5 细菌中 AHLs 信号物质诱导 lux 操纵元驱动 GFP 表达
2013年第8期 149刘征等 ：一个新型原核诱导表达系统的建立
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（责任编辑 马鑫）