全 文 ：土 壤 (Soils), 2014, 46(6): 1109–1114


①基金项目：国家重大基础研究“973”项目(2010CB126500-G)和国家自然科学基金面上项目(31170077)资助。
* 通讯作者(ztzhong@njau.edu.cn)
作者简介：郑会明(1982—)，女，江苏射阳人，博士，讲师，主要从事分子微生物学与生物固氮研究。E-mail: hmzheng@njau.edu.cn



紫云英根瘤菌种内不同菌株群体感应信号分子
差异性和交互性分析①
郑会明，毛怡玲，凌 军，钟增涛*
(南京农业大学生命科学学院，南京 210095)
摘 要：根瘤菌可以和豆科植物共生固氮，在很多根瘤菌中群体感应系统参与了结瘤固氮等相关生理过程的调
节。本研究从野外不同生境紫云英宿主根部瘤体中分离了 26 株根瘤菌，体外定量检测了各菌株产生自体诱导物(AI)
信号分子的能力，以及不同菌株 AI激活中慢生华癸根瘤菌 Mh菌株 AHLs合成酶基因 mrhI表达的情况，发现紫云英
根瘤菌种内不同菌株间存在群体感应交互性。通过导入外源 AttM水解酶观察菌株 AI活性的变化，应用薄层层析法定
性分析不同菌株的 AI结构，初步揭示了不同紫云英根瘤菌产生 AI特性的差异和多样性。
关键词：紫云英根瘤菌；群体感应；自体诱导物；交互性；AttM水解酶
中图分类号：093
在细菌胞外信号分子调节系统中群体感应的调
节尤为重要，群体感应(quorum sensing)是细菌根据细
胞密度变化进行基因表达调控的一种生理行为，具有
群体感应的细菌能产生并释放一种被称为自体诱导
物(autoinducer，AI)[1]的信号分子，它可以被多种生
物群落感知并随着细胞密度增加而同步增加，当自体
诱导物累积到一定程度时会改变细菌特定的基因表
达。通过对体外自体诱导物的检测，革兰氏阳性及阴
性细菌即可以监控其他细菌的存在完成与周围环境
进行信息交流的过程，从而调整细胞内基因的表达并
最终改变细菌的一系列生理活性，这些细菌的生理活
性包括共生、细菌毒性、生物体发光、竞争、接合、
抗生素的产生、运动性、孢子及生物膜的形成等[2]。
该信号传递系统最初只是认为在特定的细菌中调节
特定的生理功能，但现在一致认为大多数细菌中至少
存在一种群体感应调节系统[3]，并且有研究报道群体
感应在与植物相互的假单胞菌中比土壤自由生活假
单胞菌中更加普遍，揭示了群体感应对细菌与真核生
物间相互作用是非常重要的，表明群体感应在调整细
菌种内和种间细胞间的通讯上具有重要意义[4]。
与大多数革兰氏阴性细菌一样，紫云英根瘤菌群
体感应系统产生的信号分子主要是具有两亲性的酰
基高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)。这类化合物的特
点是含有一个疏水性的高丝氨酸内酯环和一个亲水
性的酰胺侧链。不同 AHLs的酰胺链碳原子数目不同
(碳原子数从 4个到 18个，多为偶数个，奇数仅为 7
个碳)，并且在酰胺链上的第 3 位碳原子上具有不同
的取代基团(氢、羟基、羰基)[5]。中华苜蓿根瘤菌
(Sinorhizobium meliloti) Rm1021 菌株中的 sinI可产
生目前碳链最长的 AHLs 分子(C18-HSL)[6]。在根瘤
菌中群体感应系统被认为与根瘤菌的侵入和有效
瘤的形成相关[7]，可以影响结瘤的数量及根瘤的发
育。在 S. meliloti 中 cin 系统与根瘤的正常发育密
切相关，cinI 在侵入线及类菌体中表达，cinI 突变
导致固氮能力下降，同时产生非正常类菌体形态和
生长，而且不能引发结瘤过程。在中慢生华癸根瘤菌
(Mesorhizobium huakuii)和中慢生型天山根瘤菌(M.
tianshanense)中均发现根瘤菌群体感应系统的缺失都
可以直接导致菌株结瘤能力的丧失[8–9]。
目前较多的研究已经对多种不同种属的根瘤菌
群体感应系统的信号类别、基因组成、调控类型进行
了研究，使我们对群体感应在根瘤菌中存在的普遍性
和多样性有了深刻的了解，但大多研究局限于某一单
菌，局限于某一个个体菌株自体诱导物的种类及合成
酶的基因定位；而对于种间尤其是信号分子及其合成
酶基因的水平同源性或差异性研究，及这种信号交流
DOI:10.13758/j.cnki.tr.2014.06.021
1110 土 壤 第 46卷

模式对菌植共生过程中一系列的生理反应研究则
非常少。由此，本研究以在中国广泛作为紫云英
(Astragalus sinicus L.)绿肥菌剂的紫云英华癸根瘤菌
Mh 菌株，以及采集自不同地区的 26 株紫云英根瘤
菌作为研究材料，考察了群体感应信号分子在紫云英
根瘤菌种内分布的特异性和交流性，以充分了解中慢
生紫云英根瘤菌中的群体感应系统。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 菌株和质粒 试验所用菌株和质粒及其特性
如表 1所示。根瘤菌在 TY培养基中于 28℃下培养，
大肠杆菌在 LB培养基中于 37℃下培养。TY培养基：
胰蛋白胨 5 g，酵母粉 3 g，CaCl2⋅6H2O 1.3 g，dH2O 1 L，
pH 7.0。LB培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl
10 g，dH2O 1 L，pH 7.2。
1.1.2 实验试剂和仪器 PCR 试剂为 TaKaRa 产
品，PCR引物由北京华大基因公司合成，邻硝基苯-β-D-
半乳吡喃糖苷(ONPG)采购于 Sigma 公司，生化与分
子生物学试剂购于南京寿德仪器试剂公司。庆大霉素
(Gen)20 µg/ml, KmR 20 µg/ml，SpeR 100 µg/ml，GmR
100 µg/ml，TcR 2 µg/ml。5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳
糖苷(X-gal)50 µg/ml。C18反相薄层层析板购于 Merck
公司。
表 1 供试菌株及质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株和质粒 特征 来源
紫云英根瘤菌 Mh 野生型菌株 本实验室保存
1-26 不同生境紫云英根瘤分离菌 本实验室保存
YQ3 mrhI-lacZ 融合表达菌株，KmR 本实验室保存
JZA1 自体诱导物检测菌株，SpeR，GmR，TcR [10]
质粒 pYC12 携带有 Plac启动子的表达载体，GmR [11]
pYC146 AttM水解酶基因于 pYC12质粒载体中，GmR [11]

1.2 实验方法
1.2.1 自体诱导物活性检测(β-半乳糖苷酶法) 将
待测菌株于 TY培养基中培养至稳定期，12 000 r/min
离心 2 min，取其上清。按 1︰10的比例将待测上清
加入到含有检测菌株 JZA1 的 AT 培养基中，按照
Miller[12]的方法进行检测。
1.2.2 C18反相薄层层析(TLC) 将待测菌株的稳定
期培养物上清液等体积乙酸乙酯萃取，灰干浓缩 100
倍后，点加在 C18反相薄层层析板(TLC，Merck)上，
以 60% 甲醇为流动相进行层析，经风干后在薄板上
铺一层含有 X-Gal和检测菌株(JZA1)的 AT琼脂培养
基，培养 12 ~ 16 h后观察薄板的颜色变化。
1.2.3 mrhI 基因同源片段的扩增 根据袁全等[8]
克隆鉴定的 mrhI 基因的序列信息，PCR 扩增 mrhI
基因的编码基因。引物序列如下：mrhI-1：GCGGAA
TTCTCGACCAGTTCGACCATGAC；mrhI-2：GCGTCT
AGATGCCGTAGGTGCGCTGATAG。将 PCR产物进
行琼脂糖电泳检测。
1.2.4 AttM水解酶基因的导入 分别在2 ml TY和
LB培养基中培养根瘤菌和大肠杆菌SM10λpir (pYC12)，
SM10λpir (pYC146)至对数生长期，12 000 r/min离心
2 min后，TY培养基和 LB培养基洗涤菌体 2次，悬
浮于 100 µl的 TY培养基中。各取 80 µl根瘤菌和大
肠杆菌菌液混合，滴加到铺在 TY 平板上的孔径为
0.22 µm的灭菌微孔滤膜上。28℃培养 12 h后，用 1
ml TY洗涤滤膜制成菌悬液，取 100 µl涂布于含 Str
100 μg/ml、Gen 20 μg/ml的 TY平板表面，28℃培养
4 天至长出单菌落。剩余的 20 µl根瘤菌和大肠杆菌
菌液滴加到其他滤膜上，进行相同处理后涂布于含
Str、Gen的 TY平板，作为阴性对照。
2 结果与分析
2.1 紫云英根瘤菌自体诱导物活性检测
从野外不同生境紫云英根部瘤体中采集分离了
26 株根瘤菌，其生境分别为：江苏淮安水田，江苏
淮阴棉花庄丛，江苏农科院绿肥资源地，浙江金华傅
村红壤地，浙江金华傅村溪滩地，浙江金华祝村红壤
地，浙江金华鞋塘红壤地，浙江义乌吴店红壤地，浙
江义乌吴店溪滩地，浙江武义水稻田，浙江开化农庄
户池塘边，浙江永康岩坡，浙江黄岩加油站旁，浙江
临安横畈镇镇政府秧田，浙江临安横畈镇绿景村鸭圈
旁，浙江临安高虹村河沟边，浙江临安东郊丁桥村石
桥旁，浙江浦江浦阳镇黄豆地，浙江临安高虹林场，
浙江余杭县瓶窑镇石濑村水田，浙江余杭县瓶窑镇石
濑村苗圃田埂，云南昆明西郊溪滩黑土地，云南玉溪
玉元高速扬武加油站，云南西双版纳勐腊县野象谷观
第 6期 郑会明等：紫云英根瘤菌种内不同菌株群体感应信号分子差异性和交互性分析 1111


景台，云南西双版纳勐养县苗圃园，云南昆明民族村
迎宾楼旁等。将分离纯化后的根瘤菌回接至紫云英宿
主植物根部，均可以观察到结瘤现象，因此这 26 株
根瘤菌被命名为紫云英根瘤菌(1 ~ 26)。将 26株紫云
英根瘤菌于 TY液体培养基中培养至稳定期，离心取
其上清。以根癌土壤杆菌 JZA1为指示菌株检测其中
自体诱导物(AI)产生活性的高低。JZA1 为敲除了 AI
合成酶基因 traI 的根癌土壤杆菌，可超量表达 TraR
蛋白，由于自身不产生 AI，其 PtraI- lacZ 的表达完
全依赖于外源 AI的诱导[10]。
在 10% 上清检测浓度下，不同紫云英根瘤菌菌
株产生 AI分子的活性有较大的差异。如图 1所示，
Mh为已知的阳性对照菌株，其 AI活性达 647 (Miller
Unit)。其余 26株紫云英分离菌株中，13、15、19号
菌株产生自体诱导物物质的能力较强，其对应的 AI
活性分别为 538、592和 416；11、21、24、25号菌
株则基本不产生明显的 AI 分子；其他菌株的 AI 活
性大都集中在 50 ~ 300。

图 1 紫云英分离菌株 AI 活性检测
Fig. 1 Autoinducer production of rhizobia isolates

2.2 紫云英根瘤菌与 Mh 菌株群体感应系统的交
互性
中慢生华癸根瘤菌(M. huakuii) Mh 基因组中含
有一对 luxR/I型的群体感应系统 mrhR/I，其 AI合成
酶基因 mrhI受其自身产物 AHLs分子的诱导[8]。在
根瘤菌中，luxI 基因还可以被其他的非自身产生的
AHLs分子诱导表达，表现出 luxI基因产物之间的交
互性[14]。本研究即以 Mh的 mrhI基因作为指示基因，
检测了 26 株紫云英根瘤菌分离菌株产生 AI 激活
mrhI 基因表达的情况，以研究紫云英根瘤菌菌株间
群体感应交互性的情况。
以 Mh菌株 mrhI基因和 lacZ指示基因的融合表
达菌株 YQ3作为检测菌株，添加 10% 外源紫云英根
瘤菌菌株的 AI培养上清，结果如图 2所示。从图中
可以看出，有 17株菌株产生的 AI可以有效激活 Mh
菌株中 mrhI基因的表达，而且 mrhI基因的表达强度
较高，活性单位大多在 400 (Miller Unit)以上；另外 9
株根瘤菌菌株则未表现出激活 Mh 中 mrhI 基因表达
的能力。
根据 26 株紫云英根瘤菌产生 AI 活性的能
力，进而交互性激活 Mh 菌株中 mrhI 基因表达的
情况，将 26 株菌株所产生 AI 进行了如表 2 所示

图 2 紫云英分离菌株与 Mh 群体感应交互性检测
Fig. 2 Cross-activation between rhizobia isolates and Mh
1112 土 壤 第 46卷

表 2 紫云英根瘤菌产生 AI 分型
Table 2 Characters of autoinducers produced by different M. huakuii strains
菌株 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
交互性 + + + – + + + + + + – + + + + + + – – – + +

的分类。可以发现，在图 1 中未表现出 AI 产生能
力的 11、21、24、25 号菌株，在图 2 中也未表现
出激活 mrhI 基因的能力；而在能够产生 AI 的菌株
中，大多数表现出了显著激活 AI 的特性，但也有 5
株菌株例外，如 4、12、19、20、22 号菌株，虽然
具备 AI 产生活性，但其 AI 并不具有能有效激活
mrhI 的能力。由此，不同紫云英菌株产生群体感应
AI 分子特性是有差异性的。
2.3 紫云英根瘤菌 mrhI基因同源片段的检测
菌株间群体感应系统的交互性可以在一定程度
上反映其系统同源性的差异。在 22 株具有 AI 产
生能力的菌株间，一些菌株表现出了与 Mh 中 mrhI
基因的交互性，另一些则无此交互性。为了研究交互
性的存在是否与群体感应的同源性有关，对几株紫云
英根瘤菌中可能存在的 AI 合成酶基因进行了检测。
在中慢生紫云英根瘤菌 Mh 中，其 AI 分子类
别为 AHLs，由 mrhI 基因编码产生。为了了解与 Mh
菌株的群体感应系统可以产生交互性的 17 株菌
中 AI 分子特性的情况，以 Mh 中 mrhI 基因中间片
段设计引物，对这 17 株菌中可能存在的 luxI 基因
进行了同源性检测。在这 17 株菌中，均可以扩增出
相近大小的 mrhI 基因的同源片段，这提示 17 株紫
云英根瘤菌之所以能够激活 mrhI 基因的表达，可能
是产生 AI 分子的合成酶基因的高度同源所致。而在
另 5 株未表现出与 Mh 群体感应交互性的菌株中
则未扩增出 mrhI 基因的同源性片段，进一步验证了
以上推测存在的可能性。
2.4 紫云英根瘤菌产生 AI特性的研究
在根癌农杆菌、铜绿假单胞菌、红球菌等细菌中
发现了 AttM类内酯酶基因，该类基因编码的内酯酶
可通过水解 AHLs的内酯环从而降解 AHLs类 AI信
号分子[11]，因此AttM水解酶可以特异性的检测AHLs
类 AI。在 4、19、1 号菌株中分别导入含有 attM 水
解酶基因的质粒 pYC146，检测培养上清中 AI 活性
的变化。如图 3A所示，在 4号菌株中，attM水解酶
基因的导入使其培养上清中的 AHLs活性稍有降低，
但在统计学分析上差异未达显著性。在 19号菌株中，
attM基因的导入则完全未造成菌株 AI活性的降低。
但在 Mh和 1号菌株中，attM水解酶基因的导入则使
菌株完全失去了产生 AI的能力。Mh菌株产生的 AI
分子类型为 AHLs型，因此 AttM水解酶可以专一性
地降解其中的 AI。在图 2中，1号菌株产生的 AI可
以有效激活 Mh 中 mhrI 基因的表达，并且能够扩增
出 mrhI 基因的同源片段。这些结果均表明，1 号菌
株可能是产生了 AHLs性的 AI分子，而 4、19号菌
株则可能是产生了非 AHLs型的 AI。

图 3 紫云英分离菌株 AI 内酯酶水解特性(A)及薄层
层析分析(B)
Fig. 3 AttM lactonase (A) and TLC (B)analysis for AIs from
rhizobia isolates

为了进一步了解与 Mh 群体感应系统无交互性
的 4 种菌株中 AI 分子的特性，对其培养液上清中
的 AI 分子进行了 C18 反相薄层层析(TLC)，结果如
图 3B 所示。C18 反相薄层层析被广泛用于检测和鉴
定 AHLs 物质的结构和特征，根据其迁移率的变化
可以推测 AI 分子碳链的长度，以及酰基链第三位 C
原子被修饰的特性情况[13]。从图中可以看出，在对
照菌株 Mh 中，可以明显检测出 3 种不同迁移率的
AHL 分子。在 AHLs 型产生菌株 1 号中也检测到了
两种 AI 分子结构。4 株与 Mh 中 AHLs 型群体感应
系统无交互性的菌株，在 TLC 层析板下呈现出不一
样的结构特征，其中 4 号菌株和 Mh 的结构非常类
似，但 12 号和 20 号菌株间 AI 结构差异则较大，表
第 6期 郑会明等：紫云英根瘤菌种内不同菌株群体感应信号分子差异性和交互性分析 1113


明这 4 株紫云英根瘤菌中 AI 结构的差异性。根据
图 3A 的结果推测其 AI 结构可能是非 AHLs 型，
其具体的分子结构，可以进一步用质谱等方法分析
鉴定。
3 讨论
本文从不同生境紫云英植株分离到了 26 株根瘤
菌，通过植株回接实验，确定该 26 株菌可以与紫云
英植株共生结瘤。群体感应系统在根瘤菌中普遍存
在，其类型大多为 luxR/luxI型，产生的 AI分子也多
为 AHLs型，碳链长度为 C4 ~ C16。朱军等人[10]构
建了一株超敏感 AI检测菌株，首次对中慢生紫云英
根瘤菌 Mh3产生 AI进行了检测。袁全等人[8]还鉴定
了中慢生紫云英根瘤菌Mh菌株中AHLs合成酶基因
mrhI及其调控蛋白基因 mrhR。
本研究首先检测了 26株根瘤菌产生 AI的能力，
发现紫云英根瘤菌菌株间存在差异性，22 株菌具有
AI分子产生活性，4株菌则无明显的 AI活性。为了
了解具有 AI 活性的 22 株菌中其群体感应系统的特
征，本研究以中慢生紫云英根瘤菌 Mh 的 mrhI-lacZ
融合菌株作为报告菌株，该 mrhI 基因可以被其自身
基因合成产物 AHLs激活，探讨外源 AI异源性激活
mrhI基因表达的情况。如图 2、3可以看出，22株具
有 AI产生活性的菌株间表现出了群体感应交互性的
差异，其中 12株菌可以有效激活 Mh菌株中 mrhI基
因的表达，而其他 5株菌则未表现出相关的交互性。
在细菌的 luxR/I 型群体感应系统中，LuxR是一类重
要的调节蛋白，该蛋白可以与 AHLs 信号分子结合
使自身转录活性增强，进而激活下游特异的靶基因启
动子。LuxR 类蛋白通常包括两个结构域，其氨基端
含有一特定区域负责结合 AHLs 分子并调节蛋白的
寡聚化，而羧基端含有一高度保守的螺旋-转角-螺旋
结构，负责与 DNA 结合从而调控基因的转录[14]。在
R. leguminosarum 中，存在 4 种群体感应系统，并
且不同系统间表现出了交互性，如 raiI基因可以被其
自身合成 AHLs分子 3-OH-C8-OH强烈诱导，也可以
被另一套群体感应系统 cinI基因产物：3-OH-C14：
1-AHLs诱导，但该诱导过程都需要同源性 RaiR调控
蛋白的存在[15]。
细菌间这种群体感应系统的交互性暗示了细菌
之间信号交流的的存在，这种信号交流可能是通过异
源性的 AI、其他的环境因子或者生理功能的介导，
而且主要是通过影响 LuxR蛋白进行作用的。目前对
这种信号交流存在的生理意义尚不明确，但推测可能
与细菌对环境的适应性有关，尤其是一些共生菌或病
原菌，其侵入宿主过程中可能会遇到复杂的生态环境
的变化。如在中费氏弧菌(Vibrio fischeri)与其宿主夏
威夷墨鱼(Euprymna scolopes) 共生的过程中，费氏弧
菌通过AHLs型群体感应系统调节 luxCDABE基因的
表达以产生光亮，而墨鱼本身又通过组织中光亮的强
度调节共生组织中费氏弧菌细胞密度的大小，以达到
两种生物共生的生态平衡[16]。
应用 AttM 水解酶处理及 TLC 检测分析后，发
现有 4 株紫云英根瘤菌所产生的 AI 可能是非 AHLs
型的信号分子。在根瘤菌中，AHLs是最主要存在的
一类信号分子，在慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium
sp.)中还发现了一类非 AHLs 型的信号分子，为
Bradyoxetin[17]。在紫云英根瘤菌中存在的非 AHLs
型信号分子的结构目前尚不清楚，但在同一属种不同
根瘤菌内，AI分子类型的差异性可能是在其与环境
和其他生物的互作过程中发展起来的，为了更好地
适应环境条件，也可能对低等生物的进化有重要的
作用。
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Diversity and Cross-activation about Quorum Sensing
System in Mesorhizobium huakuii
ZHENG Hui-ming, MAO Yi-ling, LING Jun, ZHONG Zeng-tao*
(College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract: Rhizobia can symbiotically fix nitrogen from the atmosphere in which quorum sensing system is involved. The
quorum sensing system in rhizobia is the typical LuxI/R-type regulatory system in the Gram-negative bacteria. Twenty-six
rhizobia were isolated from the nodules of Astragalus sinicus from different areas. Examination of AIs production activity and the
ability to cross-activation with luxI/R quorum sensing system of M. huakuii revealed that the quorum sensing patterns in M.
huakuii species were different. AttM hydrolytic enzyme reaction and TLC analysis indicated that the AIs production of M. huakuii
were divided into two groups, one was AHLs family and the other one was non-AHLs family. These data suggested that the
quorum sensing autoinducer production in M. huakuii may be different from each other.
Key words: Mesorhizobium huakuii, Quorum-sensing, Autoinducer, Cross talk, AttM hydrolytic enzyme