全 文 ：书钙磷对酸铝胁迫后紫花苜蓿－根瘤菌体系
结瘤固氮的修复效应
王晓锋，罗珍，刘晓燕，朱丹，夏志强，周建华，张磊
（西南大学资源环境学院，重庆 北碚４００７１５）
摘要：本试验采用水培法，以三得利紫花苜蓿和耐酸苜蓿根瘤菌９１５２２为材料，探讨了酸铝胁迫处理苜蓿幼苗１周
后，施加Ｃａ２＋、Ｐ对紫花苜蓿－根瘤菌结瘤固氮性能和群体感应的修复／恢复作用。结果表明，酸铝毒害后，Ｃａ２＋对
紫花苜蓿－根瘤菌结瘤过程有显著的修复效应，根瘤菌群体感应、根瘤固氮酶活性显著提高；４μｍｏｌ／ＬＰ素营养与
Ｃａ２＋存在交互效应，导致苜蓿现瘤时间较未经修复的处理提前１４ｄ，苜蓿结瘤总数提高了２４７．０９％，结瘤率达到
９０％，根毛变形率由３．３３％提高到２８．８９％。Ｃａ２＋对结瘤动力学曲线的修复作用主要表现为从开始结瘤起同期结
瘤数显著提高。Ｐ素对结瘤数影响在Ｃａ２＋ ５ｍｍｏｌ／Ｌ条件下较显著；Ｃａ２＋对固氮酶活性有显著提高作用，而且５
ｍｍｏｌ／Ｌ效果优于１０ｍｍｏｌ／Ｌ，４μｍｏｌ／ＬＰ素可以进一步提高固氮酶活性。初步认为，补充Ｃａ
２＋和４μｍｏｌ／ＬＰ可
以促进根瘤菌在酸铝胁迫条件下群体感应物的分泌、改善苜蓿根毛对结瘤信号的感知和变形，修复酸铝对苜蓿和
根瘤菌的毒害，恢复和提高固氮性能。
关键词：紫花苜蓿；群体感应；固氮性能；修复；钙磷交互
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４１＋．１０３．４；Ｓ１８２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０６０１０８０９
全世界约３９．５亿ｈｍ２ 土壤属于酸性土壤，占耕地和潜在可耕地的５０％以上［１］。２０００年初，我国酸性土壤
总面积为２．０３×１０７ｈｍ２，占全国土地总面积的２１％［２］。由于气候和长期施用化肥等原因，酸性土壤及其酸度存
在扩大和恶化的趋势。同时，我国酸雨分布区与酸性土壤分布区重叠，也加剧了我国南方土壤的酸化进度，严重
影响南方种植业及其相关产业的发展。在酸性土壤中，铝离子从硅酸盐或氧化物中释放出来，溶解到土壤溶液中
而对植物产生的毒害作用［３］，已经成为一个世界性的限制酸性土壤上作物产量的主要因子。紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪
犵狅狊犪狋犻狏犪，俗称ａｌｆａｌｆａ）是一种营养丰富的优良牧草，具共生固氮能力，根系非常发达，能有效防止雨水的冲刷，是
理想的水土保持植物［４］，扩大其种植已被列入国家重大规划项目。但是，紫花苜蓿是对酸性土壤条件最为敏感的
植物之一［５］，酸性土壤的铝毒胁迫更加限制了苜蓿的北草南引。因此，有必要建立高效耐酸铝的豆科植物－根瘤
菌共生体系，并结合物理化学手段，提高苜蓿耐受酸性土壤及其铝毒胁迫的能力。
铝毒（ａｌｕｍｉｎｕｍｔｏｘｉｃｉｔｙ）对植物的毒性及其作用机理已有过许多报道［６９］。对豆科植物而言，酸铝胁迫不仅
影响根瘤菌与宿主植物的接触，而且限制根瘤菌结瘤因子（ｎｏｄｆａｃｔｏｒ）的产生、宿主根毛去极化以及结瘤基因的
表达［１０，１１］。进一步地，铝离子交换量占土壤中阳离子交换总量的２０％～８０％，土壤溶液中过剩的铝离子容易导
致土壤阳离子流失，造成磷、钙、钼等营养元素缺乏［１２］。研究表明，施钙［１３，１４］和磷矿粉［１５］能够有效地缓解铝毒。
目前大部分相关研究都只对单独施用钙或磷以缓解铝毒的效应进行探讨，对同时补充钙和磷的缓解效应鲜有报
道。酸铝胁迫主要对幼苗根系作用，而且毒害效应很快，研究钙、磷对酸铝胁迫之后豆科作物及其共生固氮性能
的修复效应具有一定实践意义。
许多细菌能够通过小的可扩散的信号分子感知细胞密度和调控其各生理功能，该过程即“群体感应”（ｑｕｏ
ｒｕｍｓｅｎｓｉｎｇ，简称ＱＳ）［１６］。豆科根瘤菌（犚犺犻狕狅犫犻狌犿）的群体感应调控系统被证明会影响其生长和共生固氮［１７］。
根瘤菌与豆科宿主植物间共生关系的形成是宿主和根瘤菌间复杂的信号释放和识别的结果［１８，１９］，该识别过程首
１０８－１１６
２０１２年１２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２１卷 第６期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
收稿日期：２０１２０７２４；改回日期：２０１２０９２１
基金项目：国家自然科学基金（３０８７１５９７）资助。
作者简介：王晓锋（１９８７），男，河南三门峡人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｘｉａｏｆｅｎｇ６５４０＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｅｃｈｏｚｈａｎｇｌｅｉ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
先引起大量根瘤菌在植物根系聚集，而细胞密度的增加受群体感应调控，是一种重要的信号感应过程［２０］。据报
导，苜蓿根瘤菌（犛犻狀狅狉犺犻狕狅犫犻狌犿犿犲犾犻犾狅狋犻）的群体感应系统可能会影响结瘤数目和共生过程［２１］；苜蓿中华根瘤菌
的群体感应系统控制胞外多糖ＥＰＳⅡ的产生，该多糖与根瘤的形成过程有关［２２］。关于酸铝胁迫对紫花苜蓿共生
结瘤的影响已有一些研究报道［２３，２４］。在此基础上，本研究从固氮酶活性、根毛变形、结瘤动力学等角度，探索钙、
磷恢复酸铝胁迫后紫花苜蓿－根瘤菌共生固氮能力的效应，并从群体感应这一化学行为入手，初步探讨修复机
理。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
紫花苜蓿为三得利紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｃｖ．Ｓａｎｄｉｔｉ），购自江苏省连云港草业中心。苜蓿根瘤菌
９１５２２为本研究室分离获得，能在ｐＨ４．８的ＹＭＡ固体培养基上正常生长并能使紫花苜蓿植株结瘤，是一株耐
酸根瘤菌［２５２７］。根瘤菌培养基采用改进的ＹＭＡ培养基：甘露醇１０ｇ，酵母浸出粉５ｇ，ＮａＣｌ０．１ｇ，ＭｇＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ０．２ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ［２８］。供试Ｃａ２＋为分析纯ＣａＣｌ２，Ｐ素为ＮａＨ２ＰＯ４。
自体诱导物（ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒｓ，ＡＩ）高效检测菌株ＫＹＣ５５由南京农业大学朱军教授馈赠。检测菌株采用改进的
ＡＴ培养基：５０ｍＬＡＴ盐，５０ｍＬＡＴｂｕｆｆｅｒ，１０ｍＬ５０％葡萄糖，８９０ｍＬＨ２Ｏ［ＡＴ盐：４０ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１．５６
ｇＭｇＳＯ４，０．１５２ｇＣａＣｌ２，０．１ｇＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．０４４ｇＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ，１ＬＨ２Ｏ；ＡＴｂｕｆｆｅｒ：２１４ｇＫＨ２ＰＯ４，
定容１Ｌ，ＫＯＨ调节ｐＨ＝７．３；５０％葡萄糖：消毒，常温保存］。
１．２ 试验方法
１．２．１ 紫花苜蓿无菌幼苗及苜蓿根瘤菌９１５２２的培养 紫花苜蓿种子幼苗准备：先用９５％乙醇浸泡５ｍｉｎ，再
用０．１％ ＨｇＣｌ２溶液灭菌６～１０ｍｉｎ，无菌水冲洗５～６次，播种于灭菌的滤纸上［２８］，于（２８±１）℃下暗培养１ｄ，
再于（２８±１）℃、１６ｈ的光照下萌发２ｄ（用于根毛变形率检测）和５ｄ（用于结瘤检测）。
苜蓿根瘤菌９１５２２的培养：取生长于ｐＨ４．８斜面的供试菌株各１支，用５ｍＬ无菌水洗下菌体，取１ｍＬ接
种于１００ｍＬ中性ＹＭＡ培养液中进行快速培养复活，置于２８℃恒温震荡器中培养２４ｈ，调节其 ＯＤ６００值约为
１．０。
１．２．２ 紫花苜蓿结瘤试验 试验于２０１１年１０－１２
月，在西南大学温室内进行。用２Ｌ不透明塑料桶作
培养钵，每盆注入用无菌水配制的Ｆａｈｒａｅｕｓ无氮营养
液１０００ｍＬ［１４］，营养液含ＡｌＣｌ３ 浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ
［２４］，
以ＨＡｃＮａＡｃ缓冲液调节溶液ｐＨ 为４．８，取正常生
长５ｄ的苜蓿幼苗分散固定在漂浮盘上，培养于各处
理营养液中，每盆１０株。同时，每盆中接种新培养的
苜蓿根瘤菌９１５２２菌液１０ｍＬ。处理８ｄ后进行钙、
表１ 水培条件不同钙、磷水平试验设计表
犜犪犫犾犲１ 犇犲狊犻犵狀狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犆犪２＋犪狀犱犘犾犲狏犲犾狊
Ｃａ２＋
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｐ（μｍｏｌ／Ｌ）
０ ４ ３０
０ Ｃａ０Ｐ０ Ｃａ０Ｐ４ Ｃａ０Ｐ３０
５ Ｃａ５Ｐ０ Ｃａ５Ｐ４ Ｃａ５Ｐ３０
１０ Ｃａ１０Ｐ０ Ｃａ１０Ｐ４ Ｃａ１０Ｐ３０
磷处理。钙、磷水平如表１，每个处理设置３个重复；所有处理均在（２８±１）℃、光照／黑暗为１６ｈ／８ｈ条件下培
养，期间每天通气２０ｍｉｎ，每周调节ｐＨ并补充营养液。从接入苜蓿根瘤菌９１５２２开始起，前２０ｄ每天观察苜蓿
根系结瘤情况，之后每２ｄ观察结瘤，记录现瘤日期和１０株苜蓿各阶段结瘤总数，培养６０ｄ后收获，统计最终结
瘤率。
培养结束后，取出植株，剪掉地上部分，将结瘤的根系分别剪开。主根上的瘤子可用剥皮法取下，侧根瘤要带
少量根剪断，收集到１５０ｍＬ血清瓶内，盖上反口胶塞，立刻按瓶子体积用注射器注入占体积１０％的Ｃ２Ｈ２，２８℃
保温１ｈ。然后用注射器吸出一定体积的混合气体，用气相色谱仪测定Ｃ２Ｈ４ 产生量，获得固氮酶活性。
将培养液通过真空泵进行抽滤，除去水体中的杂物或杂质，然后用等量的酸化乙酸乙酯（含０．５％的甲酸）提
取，收集的有机相用旋转蒸发仪蒸发至剩余４ｍＬ左右，溶于一定量的甲醇中，－２０℃保存作自体诱导物Ｎ乙酰
高丝氨酸内酯（ＡＨＬｓ）测定。
９０１第２１卷第６期 草业学报２０１２年
１．２．３ 紫花苜蓿根毛变形试验 试验于２０１１年１１月进行。分别设置酸铝胁迫条件为ｐＨ＝４．８和铝浓度２０
μｍｏｌ／Ｌ和含钙、磷水平如表１的Ｆａｈｒａｅｕｓ营养液，装于不透明塑料杯中，１００ｍＬ／杯。将在Ｆａｈｒａｅｕｓ无氮营养
液中培养的苜蓿幼苗（在人工气候箱中培养２ｄ，根长３ｃｍ 左右）１５株根浸入酸铝营养液中处理２４ｈ，之后将幼
苗移入含钙、磷的营养液中，并接种根瘤菌（菌株９１５２２，ＯＤ６００＝１．０）１ｍＬ，培养２４和４８ｈ后用０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＣａＣｌ２ 洗根，滤纸吸干后用倒置显微镜镜检根毛变形，每个处理设置３个重复。分别统计根毛总数和变形根毛
数，计算根毛变形率［２４］。
根毛变形率（％）＝
变形根毛数
根毛总数 ×１００
１．２．４ 测定方法 群体感应测定：β半乳糖苷酶活法检测自体诱导物活性，按照Ｚｈｕ等
［２９］的方法进行操作，将
检测菌株ＫＹＣ５５在不含抗生素的新鲜ＡＴ培养基培养至ＯＤ６００＝０．５左右，摇匀，分装到１．５ｍＬ离心管中，加
入１５０μＬＡＨＬｓ粗提液后摇匀，２８℃过夜培养，约１４ｈ；吸取２００μＬ上述菌液加入到２ｍＬ无菌离心管，然后依
次加入０．８ｍＬＺｂｕｆｆｅｒ，５０μＬ０．１％ＳＤＳ，１５０μＬ氯仿，剧烈振荡１０ｓ后，加入１００μＬ４ｍｇ／ｍＬ的邻硝基苯
βＤ半乳糖苷（ＯＮＰＧ），摇匀，待变黄后加入６００μＬＮａ２ＣＯ３（１ｍｏｌ／Ｌ）终止反应，记变色时间；４０００ｒ／ｍｉｎ离心
５ｍｉｎ后，以新鲜培养基作阴性对照，分别测定上清液ＯＤ４２０和ＯＤ６００；根据变色时间，计算β半乳糖苷酶的活性。
计算公式如下：
Ｍｉｌｅｒｕｎｉｔｓ＝１０００×ＯＤ４２０／［ＯＤ６００×（犜犛－犜０）×０．２］
式中，犜０表示起始时间；犜犛表示变色时间。
固氮酶酶活性测定主要参考张国霞等［３０］的方法，采用气相色谱测定根瘤还原乙炔为乙烯的量。
１．３ 数据处理
原始数据在Ｅｘｃｅｌ中进行标准化处理，应用ＳＰＳＳ１７．０软件对试验数据进行方差分析，５％水平下ＬＳＤ多重
比较各处理平均值之间的差异显著性。
２ 结果与分析
２．１ 钙磷交互作用对酸铝胁迫后苜蓿结瘤的影响
２．１．１ 钙磷交互作用对酸铝胁迫后紫花苜蓿结瘤的恢复效果 酸铝胁迫降低苜蓿结瘤率至３６．６７％。施加不
同浓度Ｐ素能够提高结瘤率，但不显著（表２）；１０ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋ 可以将结瘤率提高到８０．００％；在５和１０
ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋下，均表现出４μｍｏｌ／ＬＰ素处理优于３０μｍｏｌ／Ｌ处理。
表２ 不同钙磷处理对酸铝胁迫下紫花苜蓿结瘤的影响
犜犪犫犾犲２ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犆犪２＋犪狀犱犘狅狀狀狅犱狌犾犪狋犻狅狀狅犳犕．狊犪狋犻狏犪狌狀犱犲狉犪犮犻犱犪狀犱犪犾狌犿犻狀狌犿狊狋狉犲狊狊犲狊
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
结瘤率
Ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎｒａｔｅ（％）
结瘤总数
Ｎｏｄｕｌａｒｎｕｍｂｅｒ（个Ｎｏ．／１０株Ｐｌａｎｔ）
瘤鲜重
Ｎｏｄｕｌｅｓｆｒｅｓｈｗｅｉｇｈｔ（ｇ）
现瘤时间
Ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎｔｉｍｅ（ｄ）
Ｃａ０Ｐ０ ３６．６７±４．７１ｂ １７．６７±１．７０ｆ ０．０３８４±０．０００６ｅ ２６．６７±０．９４ａ
Ｃａ０Ｐ４ ４６．６７±４．７１ｂ ２３．００±２．１６ｅ ０．０５０６±０．００２８ｄｅ ２２．６７±０．９４ｂ
Ｃａ０Ｐ３０ ４６．６７±９．４３ｂ ２２．３３±３．４０ｅ ０．０５０３±０．００２７ｄｅ ２１．３３±０．９４ｂ
Ｃａ５Ｐ０ ７０．００±８．１６ａ ４２．００±１．４１ｄ ０．０６２７±０．００３４ｄ １７．００±０．８２ｃｄ
Ｃａ５Ｐ４ ８３．３３±９．４３ａ ５２．３３±０．４７ｃ ０．０９３８±０．００９０ｃ １６．００±０．００ｄｅ
Ｃａ５Ｐ３０ ７６．６７±９．４３ａ ４０．００±１．６３ｄ ０．０８４１±０．００５５ｃ １８．００±０．８２ｃ
Ｃａ１０Ｐ０ ８０．００±８．１６ａ ５４．３３±０．９４ｂｃ ０．１０８７±０．００４０ｂ １４．３３±０．４７ｆ
Ｃａ１０Ｐ４ ９０．００±１４．１４ａ ６１．３３±１．７０ａ ０．１３６２±０．００５５ａ １４．００±０．００ｆ
Ｃａ１０Ｐ３０ ８３．３３±１２．４７ａ ５７．３３±１．２５ｂ ０．０８８７±０．０１３５ｃ １４．６７±０．４７ｅｆ
注：表中结果为３个重复的平均值。同列不同字母表示处理间差异显著（犘＜０．０５）。
Ｎｏｔｅｓ：Ｄａｔａｉｎｔｈｅｔａｂｌｅａｒｅｔｈｅａｖｅｒａｇｅｏｆ３ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０．０５ｌｅｖｅｌ．
０１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
４μｍｏｌ／ＬＰ能够显著提高苜蓿结瘤总数，高浓度Ｐ（３０μｍｏｌ／Ｌ）则表现出一定的抑制作用；施加Ｃａ
２＋后结瘤
总数显著提高，在处理浓度范围内，Ｃａ２＋浓度越高，其影响越显著，１０ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋的最高，较不施钙条件下结瘤
数提高了２０７．５％；在同一Ｃａ２＋水平下，４μｍｏｌ／ＬＰ素处理结瘤总数显著高于０和３０μｍｏｌ／Ｌ，Ｃａ
２＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ
和Ｐ４μｍｏｌ／Ｌ处理下结瘤总数比无钙磷处理提高了２４７．１％。
在酸铝胁迫条件下，紫花苜蓿结瘤鲜重为３８．４ｍｇ／株，施加一定量Ｐ对瘤鲜重具有一定促进作用，但提高不
显著；Ｃａ２＋能够显著提高瘤鲜重，而且高浓度Ｃａ２＋效果优于低浓度，１０ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋下瘤鲜重比不施钙磷处理
提高了１８３．１％。钙磷交互作用表现为同一 Ｃａ２＋ 水平下，４μｍｏｌ／ＬＰ处理瘤鲜重均高于无 Ｐ和高 Ｐ（３０
μｍｏｌ／Ｌ）处理，Ｃａ
２＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ和Ｐ４μｍｏｌ／Ｌ条件下苜蓿瘤鲜重较无钙磷处理提高了２５４．７％。
在酸铝胁迫处理１周后接种耐酸根瘤菌９１５２２，紫花苜蓿现瘤时间为２６ｄ，胁迫后只加入Ｐ，现瘤时间比对照
提前了４～５ｄ；胁迫后施入不同浓度的Ｃａ２＋能够使现瘤时间提前９～１２ｄ，表现出良好的恢复效果；Ｃａ２＋、Ｐ交互
作用下，１０ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋和４μｍｏｌ／ＬＰ处理苜蓿现瘤时间可提前至１４ｄ。
２．１．２ 钙磷交互作用对酸铝胁迫后紫花苜蓿根瘤菌
图１ 不同犆犪２＋、犘交互对酸铝胁迫条件下
紫花苜蓿结瘤（个／１０株）动力学曲线的影响
犉犻犵．１ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犆犪２＋犪狀犱犘狅狀犱狔狀犪犿犻犮犮狌狉狏犲狊狅犳狀狅犱狌犾犪狋犻狅狀
（犖狅．／１０狆犾犪狀狋）狅狀犕．狊犪狋犻狏犪狌狀犱犲狉犪犮犻犱
犪狀犱犪犾狌犿犻狀狌犿狊狋狉犲狊狊犲狊
结瘤动力学曲线的影响 图１为统计各处理１０株苜
蓿结瘤总数构建的结瘤动力学曲线，结瘤过程可分为
现瘤期（１４～２６ｄ）、结瘤中期（２６～３８ｄ）和平台期（３８
～６０ｄ）。酸铝胁迫条件下，紫花苜蓿在接种根瘤菌后
２６ｄ出现结瘤，补充适当的Ｐ素现瘤时间提前到２０～
２２ｄ（图１），补充不同浓度Ｃａ２＋后现瘤时间提前到１４
～１７ｄ，比无钙磷处理提前了９～１２ｄ（图１）；施加Ｐ
和Ｃａ２＋对同期结瘤数均有促进（图１），其中Ｐ素作用
不显著，Ｃａ２＋作用从现瘤起就表现出显著效果，而且
Ｃａ２＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ对同期结瘤数增效显著高于Ｃａ２＋ ５
ｍｍｏｌ／Ｌ处理。Ｃａ２＋ ５ ｍｍｏｌ／Ｌ 条件下，施加 Ｐ４
μｍｏｌ／Ｌ对同期结瘤数影响显著，Ｐ３０μｍｏｌ／Ｌ作用与
不施磷相似；Ｃａ２＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ条件下，Ｐ４μｍｏｌ／Ｌ处
理在结瘤中期对同期结瘤数有显著提高，而 Ｐ３０
μｍｏｌ／Ｌ并未表现出促进作用。比较同水平Ｐ素条件
下施加Ｃａ２＋后结瘤动力学曲线的变化，随Ｃａ２＋浓度
的提高，同时期结瘤数相应提高。
单独补充Ｃａ２＋条件下，１０ｍｍｏｌ／Ｌ处理现瘤时间
比５ｍｍｏｌ／Ｌ处理提前３～５ｄ，在１４～３０ｄ结瘤数提
高程度高于３０ｄ之后（图１）；在Ｐ４μｍｏｌ／Ｌ条件下补
充Ｃａ２＋，其促进作用贯穿整个培养过程，且促进程度
稳定；Ｐ３０μｍｏｌ／Ｌ条件下补充Ｃａ
２＋５ｍｍｏｌ／Ｌ后，结
瘤数增加程度有限，且至３８ｄ达到平台期，补充Ｃａ２＋
１０ｍｍｏｌ／Ｌ在中期有一段停滞期，总体的增加程度不
如Ｐ４μｍｏｌ／Ｌ。
２．２ 根毛变形
酸铝胁迫处理后，仅接种苜蓿根瘤菌９１５２２处理，
２４ｈ苜蓿根毛没有发生变形，不同浓度Ｐ素处理下少
量根毛出现变形；Ｃａ２＋处理下根毛变形率显著提高，
而且效果随Ｃａ２＋浓度增加而显著提高。
１１１第２１卷第６期 草业学报２０１２年
接种苜蓿根瘤菌９１５２２４８ｈ后，３．３％的苜蓿根
图２ 不同犆犪２＋、犘交互对酸铝胁迫条件下紫花
苜蓿根毛变形率的影响
犉犻犵．２ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犆犪２＋犪狀犱犘狅狀犺犪犻狉犱犲犳狅狉犿犪狋犻狅狀狉犪狋犲
狅犳犕．狊犪狋犻狏犪犪犳狋犲狉犪犮犻犱犪狀犱犪犾狌犿犻狀狌犿狊狋狉犲狊狊犲狊
图中结果为３个重复的平均值。不同字母表示处理间差异显著（犘＜
０．０５）。Ｄａｔａｉｎｔｈｅｆｉｇａｒｅｔｈｅａｖｅｒａｇｅｏｆ３ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎ
ｔｈｅｆｉｇｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０．０５ｌｅｖｅｌ．
毛发生变形，而且发生变形的根毛数量表现出随
Ｃａ２＋、Ｐ浓度提高而升高，但与Ｐ０μｍｏｌ／Ｌ处理相
比，Ｐ素处理没有显著差异。Ｃａ２＋显著提高根毛变
形率，Ｃａ２＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ处理的根毛变形率显著高于
５ｍｍｏｌ／Ｌ处理。Ｃａ２＋、Ｐ处理存在交互效应（图
２）：在Ｃａ２＋ ５ｍｍｏｌ／Ｌ条件下，添加Ｐ素根毛变形
率显著高于无Ｐ处理，Ｃａ２＋ １０ｍｍｏｌ／Ｌ时，添加Ｐ
素处理根毛变形较无Ｐ处理有所提高，但不显著。
可见，Ｐ素在低钙（５ｍｍｏｌ／Ｌ）条件下对根毛变形的
修复效果好于高钙（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）条件。在Ｃａ２＋存
在时，Ｐ素３０μｍｏｌ／Ｌ对根毛变形反而有抑制作用，
不利于对根毛变形的修复。
２．３ 群体感应ＱＳ
β半乳糖苷酶活性代表６０ｄ培养结束后营养
液中ＡＨＬｓ活性（图３），即群体感应强度。不同浓
度Ｐ素处理的群体感应强度没有显著差异，维持在４０ＭｉｌｅｒＵｎｉｔｓ左右；加Ｃａ２＋处理下群体感应强度显著高于
零钙处理，Ｃａ２＋５和１０ｍｍｏｌ／Ｌ处理比Ｃａ２＋０ｍｍｏｌ／Ｌ群体感应强度分别提高了８５．０４％和７５．４３％；在同浓度
Ｃａ２＋处理中，施加Ｐ素群体感应强度均表现为Ｐ０μｍｏｌ／Ｌ＜Ｐ３０μｍｏｌ／Ｌ＜Ｐ４μｍｏｌ／Ｌ，但没有显著差异，其中
以Ｃａ２＋５ｍｍｏｌ／Ｌ和Ｐ４μｍｏｌ／Ｌ处理群体感应强度最高，该条件下苜蓿根瘤菌９１５２２自体诱导物的分泌显著
恢复和增加，进而促进修复苜蓿、根瘤菌的信息交流。
２．４ 固氮酶活性
本试验中对不同处理下根瘤固氮酶活性进行检测。与不加Ｃａ２＋、Ｐ处理相比，Ｐ处理对酸铝毒害下紫花苜蓿
根瘤固氮酶活性具有显著的恢复效应，Ｐ３０μｍｏｌ／Ｌ处理固氮酶活性高于Ｐ４μｍｏｌ／Ｌ，但是没有显著差异（图
４）；Ｃａ２＋也能够显著恢复固氮酶活性，但１０ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋显著低于５ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋处理，可见，Ｃａ２＋对酸铝胁迫
之后苜蓿根瘤固氮酶活性的恢复具有显著作用，而高浓度Ｃａ２＋并不利于固氮酶活性的提高；在相同Ｃａ２＋浓度处
理下，补充Ｐ素固氮酶活性较无Ｐ素处理均有提高，而且低磷（４μｍｏｌ／Ｌ）处理效果显著。
图３ 不同钙磷交互处理对酸铝胁迫下苜蓿
根瘤菌９１５２２群体感应的影响
犉犻犵．３ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犆犪２＋犪狀犱犘狅狀犙犛狅犳犛．犿犲犾犻犾狅狋犻
狌狀犱犲狉犪犮犻犱犪狀犱犪犾狌犿犻狀狌犿狊狋狉犲狊狊犲狊
图４ 不同钙磷交互处理对酸铝胁迫下苜蓿
根瘤固氮酶活性的影响
犉犻犵．４ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犆犪２＋犪狀犱犘狅狀狀犻狋狉狅犵犲狀犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳
犛．犿犲犾犻犾狅狋犻狌狀犱犲狉犪犮犻犱犪狀犱犪犾狌犿犻狀狌犿狊狋狉犲狊狊犲狊
２１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
３ 讨论
酸铝胁迫条件下，Ｃａ２＋、Ｐ吸收受阻成为限制豆科植物结瘤固氮的重要原因。本研究对酸铝胁迫７～８ｄ后
的苜蓿根瘤菌９１５２２和紫花苜蓿进行Ｃａ２＋、Ｐ处理，结果表明Ｃａ２＋能够显著促进酸铝胁迫后苜蓿与耐酸根瘤菌
的结瘤，缓解胁迫对结瘤过程的限制，提高结瘤率、结瘤总数以及瘤鲜重，而且随Ｃａ２＋浓度的提高，对紫花苜蓿结
瘤过程的修复效果越显著。Ｃａ２＋在缓解酸铝对苜蓿根瘤菌９１５２２结瘤固氮中效果显著；Ｃａ２＋、Ｐ处理的修复效果
有交互作用，适当的Ｐ素（４μｍｏｌ／Ｌ）可以在Ｃａ
２＋基础上进一步提高结瘤效果，对受到酸铝胁迫后紫花苜蓿结瘤
能力有良好的修复效果。一般对豆科植物而言，Ｃａ２＋被认为是结瘤因子信号转导途中的第二信使［３１］。当根毛接
触结瘤因子之后，胞内Ｃａ２＋通过细胞质膜上的配位体－通道释放出来，耦合ＩＩＡ型钙离子泵形成Ｃａ２＋循环，引起
结瘤基因被激活［３２］。另外，磷素能够通过影响豆科作物的生长间接影响根瘤的形成和生长［３３］，或是直接参与根
瘤的形成和共生固氮［３４３８］。所以Ｃａ２＋、Ｐ缓解铝毒害的作用得到共识［１３，１４，１５，２５］，然而往往忽略了Ｃａ２＋、Ｐ素对遭
受酸铝毒害后共生体系形成过程的恢复作用。本研究在苜蓿根瘤菌体系遭受短期酸铝毒害之后补充Ｃａ２＋、Ｐ，得
到了良好的修复效果，所以南方酸雨频发地区可通过雨后补充少量Ｃａ２＋、Ｐ以恢复苜蓿生长，提高抗逆能力。
Ｓｏｔｏ等［３９］研究表明，ｐＨ５．６条件下耐酸苜蓿根瘤菌结瘤动力学曲线不受Ｃａ２＋影响。而张琴等［１４］研究表
明，ｐＨ５．５，５．２，５．０，４．８条件下施加５ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋能够促进耐酸苜蓿根瘤菌９１５２２与紫花苜蓿结瘤，而且在
整个培养时期效果都非常明显。本试验中，酸铝胁迫处理７～８ｄ后，单独施加Ｃａ２＋、Ｐ均能够使酸铝胁迫后苜蓿
根瘤菌与紫花苜蓿结瘤时间提前，Ｃａ２＋恢复效果好于Ｐ素；Ｃａ２＋能够显著提高同期结瘤数，补充Ｐ素对结瘤数有
增加效果。因此，在酸性土壤中种植紫花苜蓿，可以通过合理的补充Ｃａ２＋、Ｐ修复其与土著耐酸根瘤菌的结瘤固
氮，进而可以作为修复酸铝土壤的可行途径。
根瘤菌根毛变形是根毛对根瘤菌入侵和结瘤因子诱导的结瘤反应，是苜蓿结瘤的第一步。根毛变形率提高
意味着结瘤数的增加，固氮能力的提高。本研究证实，酸铝胁迫处理２４ｈ，接种根瘤菌后苜蓿根毛变形率仅为
３．３％，这与杨敏等［２４］结论相似。本研究发现，补充Ｃａ２＋和适当的Ｐ素使得酸铝胁迫后紫花苜蓿根毛变形显著
恢复。一方面，施钙提高根瘤菌在酸性胁迫土壤中的生长存活能力［１４］，而且本研究也表明Ｃａ２＋、Ｐ可能通过改善
酸铝胁迫后苜蓿根瘤菌的活力（结果未列出），进而影响结瘤因子分泌；另一方面，杨敏等［２４］研究认为，酸铝抑制
结瘤信号传递导致苜蓿根毛变形受阻，而Ｃａ２＋作为结瘤因子信号转导途中的第二信使，提高了经受酸铝胁迫后
的根毛感应结瘤因子的能力。Ｃａ２＋、Ｐ修复酸铝胁迫后紫花苜蓿根毛变形，成为结瘤固氮恢复的重要原因之一。
王树起等［４０］研究表明，随着磷浓度的增加，大豆根瘤固氮酶活性呈增加趋势，而且随着反应时间的延长，各
磷处理间的差异有增大的趋势，表明施磷对提高豆科根瘤的固氮效率有显著的促进作用。Ｔａｎｇ等［４１］在苜蓿对
磷素的反应试验中表明，磷素能够提高苜蓿根瘤固氮酶还原乙炔生成乙烯的量，即提高固氮酶活性。本试验中酸
铝胁迫后，通过补充Ｐ素，紫花苜蓿根瘤固氮酶活性显著提高；本试验中Ｃａ２＋能够有效地恢复固氮酶活性，但较
高浓度Ｃａ２＋（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）对固氮酶活性有抑制作用；同水平Ｃａ２＋条件下，适当补充Ｐ素（４μｍｏｌ／Ｌ）能够显著提
高固氮酶活性。所以利用Ｃａ２＋对酸铝毒害后苜蓿根瘤固氮酶活性具有良好的恢复能力，而且４μｍｏｌ／ＬＰ浓度
在Ｃａ２＋作用的基础上也表现出促进作用。
根瘤菌产生ＡＨＬｓ可能参与其和宿主豆科植物形成有固氮活性共生体的过程中的信息交流［４２］。祖慧琳
等［４３］分别采用３．０，６．０，９．０μｍｏｌ／ＬＡｌＣｌ３处理苜蓿根瘤菌１１２８后，其ＡＨＬｓ的产生水平及胞外多糖的合成量
显著降低，进而抑制苜蓿根瘤菌１１２８对苜蓿幼根的根毛吸附，降低结瘤信号传递；另有研究表明，天山根瘤菌
（犚犺犻狕狅犫犻狌犿狋犻犪狀狊犺犪狀犲狀狊犲）的群体感应突变株完全丧失了固氮结瘤能力［４４］；Ｇａｏ等［４５］的研究中，经过４ｈ的根系
培养，华癸根瘤菌（犕犲狊狅狉犺犻狕狅犫犻狌犿犺狌犪犽狌犻犻）群体感应突变株仅有６×１０２ 依附在５条根系，同时约有７×１０５ 的野
生型菌株附着，所以群体感应会影响根瘤菌与宿主植物根毛的识别依附，促进二者信号交流，从而影响根毛变形
和共生结瘤。本试验中通过补充Ｃａ２＋、Ｐ，使得酸铝胁迫下苜蓿根瘤菌９１５２２ＡＨＬｓ的产生水平显著提高。大量
研究认为酰基高丝氨酸内酯（ＡＨＬ）介导的群体感应（ｑｕｏｒｕｍｓｅｎｓｉｎｇ）不仅能调节根瘤菌自身的数目［２０］，还能影
响根瘤菌胞外多糖的产生、根瘤菌与豆科植物的结瘤效率甚至共生体的建成［４６］。因此，在酸性土壤中，通过施加
Ｃａ２＋、Ｐ修复土著根瘤菌群体感应系统，能够提高紫花苜蓿与土著根瘤菌的共生固氮能力，为紫花苜蓿在酸性土
３１１第２１卷第６期 草业学报２０１２年
壤上良好结瘤提供了保障。
在利用植物改良土壤的研究中，苜蓿良好的共生固氮能力能够促进土壤有机质及全氮在耕层的累积［４７］。酸
性土壤中紫花苜蓿共生结瘤受到抑制，从而限制紫花苜蓿在酸性土壤改良中的应用。通过施加钙磷，根瘤菌自体
诱导物的分泌量增加，促进其与宿主植物特异性识别依附过程，改善根瘤菌与宿主植物间的信号交流过程，最终
促进结瘤。本研究中５，１０ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋对苜蓿结瘤修复效果显著，而在此基础上补充４μｍｏｌ／ＬＰ可进一步促
进结瘤，而３０μｍｏｌ／ＬＰ则有一定抑制作用，可见在实际应用中合理的配施才能发挥良好的作用。影响苜蓿－根
瘤菌高效共生的因素非常多，是复杂的综合效应［４８］，有许多基础性问题，如酸性土壤中耐酸根瘤菌的存活、迁移、
对苜蓿根系信号物质的感知以及群体感应物质在酸性土壤中的作用等，均需要更深入的研究。而且，施用钙磷对
酸铝胁迫后苜蓿－根瘤菌共生体系形成的恢复效果在实际生产环境如何尚待通过酸性土壤大田试验进一步验
证。
４ 结论
本研究探讨了酸铝处理苜蓿幼苗及其根瘤菌１周后，施加Ｃａ２＋、Ｐ对紫花苜蓿－根瘤菌结瘤固氮性能和群
体感应的修复／恢复作用。结果表明，在受酸铝毒害后，Ｃａ２＋对紫花苜蓿－根瘤菌结瘤过程有显著的修复效应，
补充５，１０ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋条件下，根瘤菌群体感应、根瘤固氮酶活性有显著的提高；４μｍｏｌ／ＬＰ素营养与Ｃａ
２＋的
上述促进作用有交互效应，而且该交互效应导致苜蓿现瘤时间较未经修复处理的提前１４ｄ，结瘤总数提高了
２４７．０９％，结瘤率可达到９０％，使根毛变形率由无钙磷处理的３．３３％提高到２８．８９％。Ｃａ２＋、Ｐ对结瘤动力学曲
线影响主要体现在Ｃａ２＋对同期结瘤数有显著修复效果，并且这种修复从开始结瘤起就非常明显，Ｐ素对结瘤数
影响在Ｃａ２＋５ｍｍｏｌ／Ｌ条件下较显著；Ｃａ２＋对固氮酶活性有显著提高作用，但高浓度Ｃａ２＋（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）效果不
如低浓度（５ｍｍｏｌ／Ｌ），同时４μｍｏｌ／ＬＰ浓度可以进一步提高固氮酶活性。补充Ｃａ
２＋、Ｐ能够显著提高酸铝胁迫
下根瘤菌ＡＨＬｓ分泌量，即提高了根瘤菌的群体感应水平，可能是Ｃａ２＋、Ｐ对紫花苜蓿－根瘤菌结瘤过程有显著
的修复效应的内在机理之一。
因此，在酸性铝毒环境下，施入适当钙、磷营养，能够修复胁迫对苜蓿植物及其根瘤菌体系的负面影响，极大
地恢复紫花苜蓿－根瘤菌结瘤固氮性能，提高紫花苜蓿在酸铝胁迫条件下生长能力。
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５１１第２１卷第６期 草业学报２０１２年
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犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；ｑｕｏｒｕｍｓｅｎｓｉｎｇ；ｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆＣａ２＋ａｎｄＰ
６１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６