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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-06-12
基金项目 : 国家“863”项目（2007AA09Z436）
作者简介 : 彭晓慧 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 生物材料 ; E-mail: pengxiaohui198799@163.com
通讯作者 : 汤顺清 , 男 , 博士 , 研究员 , 研究方向 : 生物材料 ; E-mail: tshunqt@jnu.edu.cn
受四环素调控的真核表达系统 SK-Hep1 细胞株的建立
彭晓慧 毛宣 汤顺清
（暨南大学生物医学工程系，广州 510632）
摘 要 : 建立稳定、高效表达外源基因的 SK-Hep1 细胞株，以便进一步研究基因的作用。首先将调控质粒 pCDNA6/TR 转
染 SK-Hep1 细胞，经潮霉素筛选得到多个稳定单克隆。各个单克隆分别扩大培养后，转染 pCDNA4/TO/lacZ 质粒，再经过 DOX（强
力霉素）诱导表达，检测 β-半乳糖苷酶（β-D galaetosidase，β-gal）活性，从而筛选出高诱导水平低背景表达的 SK-Hep1 tet-on 细胞株。
最后，再将 pCDNA4/TO/c-myc 质粒转染进 SK-Hep1 tet-on 细胞株，进一步通过 Western blotting 检测该系统对下游基因的表达调控。
成功建立了一株受 DOX 调控的高诱导水平低背景表达的细胞株 SK-Hep1 tet-on 10#。
关键词 : 强力霉素 转染 诱导 表达调控 SK-Hep1 细胞株
Establishment of a Tetracycline-inducible System in
Human Hepatoma Cell Line SK-Hep1
Peng Xiaohui Mao Xuan Tang Shunqing
（Biomedical Engineering Institute of Jinan University，Guangzhou 510632）
Abstract: It was to establish a liver cancer cell line, SK-Hep1 tet-on with gene expression regulated by DOX, which is useful tool for
investigations of gene function and gene transfer. SK-Hep1 cells were transfected with pCDNA6/TR using Liposome2000 transfection reagent,
and the transfected cells were selected with hygromycin. The hygromycin-resistant clones were isolated and cultivated. The clones were selected
with high induction of luciferase and low background in response to Dox after all clones being transfected with pCDNA4/TO/lacZ for clones.
Finally, SK-Hep1 tet-on cells were transfected with pCDNA4/TO/c-myc using Liposome2000 transfection reagent, and the transfected cells
were treated with DOX for 24 h. The expression level of c-myc was detected by Western blotting. SK-Hep1 tet-on cell line which exhibits low
background and high induction of luciferase in response to DOX was established.
Key words: DOX Transfection Induction Regulated expression SK-Hep1 cell line
1995 年 Gossen 等构建了受四环素正性调节的
基因表达系统 , 称为 Tet-on 基因表达系统。该系统
在没有四环素的情况下表达水平为零，在加入四环
素或强力霉素后目的基因高效表达。Tet-on、Tet-off
基因表达系统被认为是目前最为理想的真核生物基
因表达系统。与目前所有的真核基因表达系统比较 ,
该系统具有严密性、特异性、高效性等优点［1,2］。调
节 质 粒（pCDNA6/TR） 和 反 应 质 粒（pCDNA4/TO）
组成了 Tet-on 基因表达系统。目前，有多个实验室
已经在癌细胞系中建立了受四环素调控的真核表达
系统，然而还没有在人肝癌细胞 SK-Hep1 中建立受
四环素调控的真核表达系统的相关报道。SK-Hep1
是恶性程度较高的肝癌细胞，对其基因表达调控有
利于研究肝癌的发生和发展，其重要性不言而喻。
本 研 究 拟 将 pCDNA6/TR 质 粒 转 染 进 SK-Hep1 细
胞，旨在筛选出基因组稳定整合 pCDNA6/TR 的细胞
株［3］。
1 材料与方法
1.1 材料
pCDNA6/TR、pCDNA4/TO、pCDNA4/TO/lacZ
质粒以及 Lipofectamine2000 均购自 Invitrogen 公司 ；
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期94
pCDNA4/TO/c-myc 质粒由本实验室构建 ；小鼠 SK-
Hep1 肝癌细胞株由本实验室保存 ；潮霉素、DMEM
培养基购自 Gibco 公司；胎牛血清购自 Hyclone 公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 SK-Hep1 细胞在 5% CO2，37℃的
培养条件下，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液
培养。
1.2.2 用 Lipofectamin2000 将 质 粒 pCDNA6/TR 稳
定 转 染 SK-Hep1 细 胞 转 染 前 24 h 将 生 长 良 好
的 SK-Hep1 细 胞 种 于 6 孔 板 , 接 种 密 度 为 1×105
个 / 孔，待细胞生长至 90%-95% 的融合度时开始转
染。转染前用 PBS 洗涤 6 孔板中的 SK-Hep1 细胞两
次，然后添加含 10% FBS 无双抗的 DMEM。准备两
个 Eppendorf 管，其中的一管加入质粒 pCDNA6/TR
4 μg，另一管加入 Lipofectamin2000 10 μg，两管均用
Opti-MEM 稀释到 250 μL，待 Lipofectamin2000 室温
孵育 5 min 后 , 混合两管 , 室温放置 30 min。然后将
混合液加入六孔板中，转染 SK-Hep1 细胞。5 h 后更
换为新鲜培养液，48 h 后更换为含 100 μg/mL 潮霉
素的筛选培养液，并且之后换液都用此筛选培养液。
两周后挑取单克隆，扩大培养。结果得到了已经稳
定转染质粒 pCDNA6/TR 的 SK-Hep1 细胞［4］。
1.2.3 脂质体法将质粒 pCDNA4/TO/LacZ 瞬时转染
1#-24# 克隆 瞬时转染的方法同上步，用脂质体法
将质粒 pCDNA4/TO/LacZ 瞬时转染已经稳定转染质
粒 pCDNA6/TR 的 SK-Hep1 细胞。最终得到 SK-Hep1
tet-on 细胞株。
1.2.4 检测 β-gal 的活性 将 6 孔板中已经瞬时转染
pCDNA4/TO/LacZ 的 SK-Hep1 tet-on 细胞用 PBS 冲洗
2-3 次，加入 100 μL Harvest buffer 后放入 4℃冰箱
中 20 min。准备 Eppendorf 管，将细胞转移至管中，4℃
12 000 r/min 离心 5 min, 收集上清液至新管。准备 96
孔板，每孔加入 20 μL 上清，120 μL β-gal 测定液（含
有 70 mmol/L PBS，1 mmol/L MgCl2，1 μg/μL ONPG，
50 mmol/L β-巯基乙醇），37℃避光孵育至黄色出现，
大约为 30 min。然后每孔加入 60 μL Na2CO3 （1 mol/L）
终止反应，于酶标仪 405 nm 测 OD 值。
1.2.5 质 粒 pCDNA4/TO/c-myc 转 染 SK-Hep1 tet-on
细胞 将已经稳定转染质粒 pCDNA6/TR 的 SK-Hep1
细胞用脂质体法进行质粒 pCDNA4/TO/c-myc 瞬时转
染。转染方法同 1.2.2 所述。
1.2.6 蛋白提取与 Western blotting 分析 细胞用预
冷的 PBS 洗一次，加入 150 μL RIPA 细胞裂解液，
稍振荡使细胞分散，-20℃放置 20 min ；吸取细胞裂
解液，12 000 r/min 离心 10 min，收集上清 ；BCA 法
测定蛋白浓度（参见 PIERCE 公司 BCA 蛋白分析试
剂盒使用说明书）；取 40 μg 蛋白样品，加入等体积
2×SDS 凝胶上样缓冲液，100℃沸水浴 6 min，离心
后 SDS-PAGE 电泳分离 ；4℃，100 V 电转 1.5 h ；硝
酸纤维膜用封闭液（10 mL TBST，0.5 g 脱脂奶粉）
封 闭 1 h， 封 闭 后 的 膜 于 TBST 中 洗 3 次， 每 次 5
min ；室温孵育一抗 1.5 h ；TBST 中洗 3 次，每次 10
min ；室温孵育二抗 1 h ；TBST 中洗 3 次，每次 10
min ；ECL 反应液（A 液 ：500 μL 鲁米诺，220 μL 对
羟基丙烯酸 DMSO 溶液，用 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）
缓冲液定容至 50 mL ；B 液 ：50 mL 1 mol/L Tris-HCl
（pH8.0） 缓 冲 液 中 加 入 30.5 μL H2O2。；临 用 前 将
ECL 反应液 A 液与 B 液等体积混合）显影［5］。
1.2.7 统计学方法 所有数据均来自于 3 次独立
重复试验。数据以 mean+SD（x±s）表示，组间比
较采用方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义（*
P<0.05，** P<0.01）。
2 结果
2.1 SK-Hep1 tet-on细胞株的建立
将质粒 pCDNA6/TR 转染 SK-Hep1 细胞，潮霉
素筛选 10 d 后，对照组细胞全部死亡，试验组细胞
出现克隆，命名为 SK-Hep1 tet-on 细胞。挑取单克隆
并扩大培养，编号为 1#-24#。将质粒 pCDNA4/TO/
LacZ 分别转染 1#-24# 细胞，DOX 刺激 24 h 后检测
β-gal 活性，结果（图 1）显示，10#，19# 克隆同时
具有较低背景表达。其中，10# 克隆具有高诱导水
平低背景表达。
2.2 SK-Hep1 tet-on 10#细胞株的细胞形态
将 生 长 良 好 的 SK-Hep1 细 胞 和 SK-Hep1 tet-
on 10# 细胞分别接种于 6 孔板，接种密度为 1×105
个 / 孔。24 h 后在倒置荧光显微镜下观察并拍照。
结果（图 2）显示， SK-Hep1 tet-on 10# 细胞株呈梭形，
并且形态细长，与对照组相比轮廓清晰可辨。这表
2012年第2期 95彭晓慧等 ：受四环素调控的真核表达系统 SK-Hep1 细胞株的建立
明该细胞株为稳定转染细胞株。
2.4 DOX刺激不同时间对SK-Hep1 tet-on 10#细胞
的诱导表达效率
将质 pCDNA4/TO/c-myc 转染 SK-Hep1 tet-on 10#
细胞。以相同浓度（0.6 μg/μL）的 DOX 分别刺激
SK-Hep1 tet-on 10# 细 胞 12-48 h 后 Western blotting
检测 c-myc 表达水平，结果（图 4）显示，在 0 至
36 h 内，随着 DOX 诱导时间的升高，c-myc 表达水
平递增。当 DOX 诱导时间超过 36 h，c-myc 表达水
平基本维持稳定。结果表明，在 SK-Hep1 tet-on 10#
细胞株中，DOX 的最佳诱导时间为 36 h。
A,C.SK-Hep1 ； B,D.SK-Hep1 tet-on 10# 细胞株
图 2 筛选后的 10# 克隆的形态变化情况图 1 部分克隆在 DOX 诱导后 β-gal 活性
图 4 SK-Hep1 tet-on 10# 细胞在 DOX 诱
导不同时间后 c-myc 的表达情况
3 讨论
长期以来，为了研究基因功能，人们一直在寻
求一种能够对目的基因进行精确调控的方法［6-8］。
传统的依赖于热休克、激素等因素的基因诱导表达
系统存在诱导效率低、特异性差等缺陷。四环素诱
导表达系统是目前最理想的真核基因表达调控系统，
该系统具有高效性和高特异性等优点，弥补了传统
方法的不足，极大地促进了基因功能研究的发展。
本实验室已经在前期工作中成功构建了 PCR3.1-
c-myc 表达质粒，但仅仅凭借该质粒无法实现表达
2.3 不同浓度DOX对SK-Hep1 tet-on 10#细胞的诱
导表达效率
将质粒 pCDNA4/TO/c-myc 转染 SK-Hep1 tet-on
10# 细胞。以不同浓度的 DOX（0-0.8 μg/μL）分别
刺激 24 h 后，Western blotting 检测 c-myc 表达水平，
结果（图 3）显示，当 DOX 浓度由 0 μg/μL 增加到
0.6 μg/μL 时，c-myc 表达水平递增。当 DOX 浓度大
于 0.6 μg/μL 时，c-myc 表达水平基本不变。该结果
表明 , 在 SK-Hep1 tet-on 10# 细胞株中，DOX 的最佳
诱导浓度为 0.6 μg/μL。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期96
调控，这将给我们进一步研究该基因的功能带来不
便。因此，本研究的目的是通过四环素诱导表达调
控系统实现对目的基因表达的精确调控。我们将质
粒 pCDNA6/TR 转染 SK-Hep1 细胞，经潮霉素筛选
得到一系列克隆。为了排除假阳性克隆，并挑选出
具有高诱导效率和低背景表达的克隆，先用 DOX 在
相同条件下对这些克隆进行诱导，然后通过 β-半乳
糖苷酶检测试验对这些克隆进行 β-半乳糖苷酶活性
检测。结果显示，10# 和 19# 克隆相对于其他克隆
及对照组均具有较低的背景表达，然而 19# 克隆的
诱导效率不高，只有 10# 克隆具有高诱导效率。此外，
不同克隆之间的诱导表达的效率存在很大差异，这
可能是由于不同克隆的质粒整合位点不同，而质粒
整合位点的不同会极大地影响基因的表达水平。同
时，多数克隆都存在一定的背景表达，而且部分克
隆的背景表达很高，这可能是由于四环素抑制蛋白
对四环素操纵子的抑制作用不完全［9］。
在本研究中，c-myc 基因的表达水平随 DOX 的诱
导浓度增加而递增，该结果说明在 10# 克隆中 DOX
对下游基因的诱导具有浓度依赖性。同时，c-myc 基
因的表达水平在一定范围内随着 DOX 的诱导时间的
增加而递增，说明在 10# 克隆中 DOX 对下游基因的
诱导具有时间依赖性。综上所诉，通过四环素诱导
表达调控系统实现了对目的基因的调控表达，这一
研究成果为进一步研究基因功能奠定了坚实的基础。
4 结论
本研究在肝癌细胞系中成功构建了四环素诱导
表达调控系统。通过 DOX 对靶基因实现了精确的表
达调控，该调控方式具有时间依赖性和浓度依赖性。
这一结果为今后的试验奠定了坚实的基础。
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（责任编辑 李楠）