全 文 ：·综述与专论· 2013年第3期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
基因沉默（Gene silencing）作为生物学研究的
新领域，吸引了无数生物学家的眼球，在近 20 年间
有许多关于这一方面的研究及假说被提出。基因沉
默现象最早是 Napoli 等发现，他们在进行转基因紫
牵牛花的研究中意外发现白色花和杂色花表型，后
来证实该表型是由转基因诱导植物体内基因功能缺
失所致，当时称这种现象为共抑制。1995 年，Guo 等［1］
在对秀丽新小杆线虫进行反义 RNA 技术的研究时，
也出现了同样的抑制现象。直至 1998 年，Fire 等［2］
将 dsRNA 导入线虫体内，检测该 dsRNA 对线虫的
影响，结果证实外源 dsRNA 会使特定基因沉默，并
且该沉默作用具有遗传特性。他们将这种现象定义
为 RNA 干 扰 作 用（RNA interference，RNAi）， 也
称为转录后基因沉默作用（Post transcriptional gene
收稿日期 ：2012-10-10
基金项目 ：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金 (BS2010SW031)
作者简介 ：吴雪，女，硕士研究生，研究方向 ：细胞生物学 ；E-mail ：wx5533@126.com
通讯作者 ：袁金铎，男，博士，副教授，研究方向 ：分子生物学 ；E-mail ：yuanjd@sdnu.edu.cn
涡虫的基因沉默作用
吴雪  袁金铎  赵楠楠  杨桂文  安利国 
（山东师范大学生命科学学院 山东省动物抗性生物学重点实验室，济南 250014）
摘 要 ： 涡虫具有惊人的再生能力，作为经典的模型生物应用于后生动物的研究工作。基因沉默是指生物体中特定基因由
于外源性或内源性因素的作用而无法表达的现象。目前，RNA 干扰作用作为诱导涡虫基因沉默的有效技术，在涡虫发育生物学和
分子生物学的研究中发挥重要作用。对涡虫中的基因沉默作用进行了归纳总结，为理解涡虫再生的分子机制提供了基础资料。
关键词 ： 涡虫 基因沉默 RNA 干扰 miRNA piRNA
Gene Silencing in Planarian
Wu Xue Yuan Jinduo Zhao Nannan Yang Guiwen An Liguo
（The Key Laboratory of Animal Resistant Biology of Shandong Province，College of Life Sciences，
Shandong Normal University，Ji’nan 250014）
Abstract:  Planarians have powerful capability of regenerating complete organisms from tiny fragments of their bodies, it’s a classic
experimental model for investigating metazoan and has been revitalized by the application of modern molecular biological approaches. Gene
silencing, which means special gene not expressing in organisms by some exogenous or endogenous reason. At present, RNA interference is
a potent means to induce gene silencing in planarian and could play an important role in developmental biology and molecular biology. Gene
silence mediated by exogenous or endogenous factors in planarians were reviewed in this paper, which is helpful for understanding of the
molecular mechanisms of regeneration in planarian.
Key words:  Planarian Gene silencing RNA interference microRNA piwiRNA
silencing，PTGS）。
在发现 RNAi 作用后的几年间，该技术作为热
点课题在多种生物中开展研究。在真菌、果蝇 、拟
南芥等生物体内相继发现了 RNA i 现象的存在［3］。
1999 年，再生模型涡虫体内也发现了相同的基因
沉默作用［4］，自此，RNAi 作为一项能有效诱导特
定基因功能缺失的新兴技术，在涡虫发育生物学和
分子生物学的研究中发挥重要作用。近年，科学家
研究发现内源性小 RNA 同样可以引起涡虫的基因
沉默现象——miRNA、piRNA［5］，这种内源性基因
沉默作用涉及涡虫生命活动的整个过程，如胚胎发
育、干细胞维持、组织再生和配子形成等等，是涡
虫维持正常生命活动所必须的调控过程。但目前对
于 miRNA、piRNA 的作用机制还不是很清楚，尚需
2013年第3期 25吴雪等 ：涡虫的基因沉默作用
进一步试验研究来证实。
1 涡虫 RNA 干扰作用
1.1 RNA干扰机制
近年来对于 RNAi 技术的研究发现，在此过程
中主要有几个控件发挥着重要作用，使得 RNA 干扰
赖 以 发 生。（1） 双 链 RNA（double stranded RNA，
dsRNA）——触发分子 ；（2）干扰性小 RNA（small
interfering RNA，siRNA） —— 重 要 效 应 分 子 ；（3）
RNase Ⅲ家族核酸酶（Dicer，DCR）——dsRNA 剪
切酶 ；（4）RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced sile-
ncing complex，RISC）—— 沉默诱导物 ；（5）RNA
依赖的 RNA 聚合酶（RNA directed RNA polymerase，
RdRP）——级联放大效应酶。RNAi 发生机制大致
分为 3 个阶段，即启动阶段 ：dsRNA 进入生物体
内，会被细胞内的 Dicer 酶识别并在 ATP 供能的条
件下剪切成长约 21-24 个核苷酸（Nucleotide，nt）
的片段，即 siRNA。效应阶段 ：siRNA 与 Dicer 酶、
Argonaute 蛋白家族等分子结合形成 RISC，但此时
的 RISC 处于无活性状态，无活性的 RISC 需在核酸
内切酶 Ago-2 的作用下使 siRNA 解旋，解旋后的反
义链 RNA 将作为“向导”指导 RISC 识别靶 mRNA。
最终，RISC 在 Ago-2 协助下降解靶 mRNA，引发基
因沉默［3，6］（图 1）。 级联放大系统 ：由 Dicer 酶切
割而成的 siRNA 除了与作用因子结合形成 RISC 之
外，还能在 RdRp 的作用下，以靶 mRNA 为模板合
成 dsRNA，这些新合成的 dsRNA 最终也可被剪切成
大量的 siRNA，从而放大由 siRNA 引发的基因沉默
作用，因此即使是很微量的 dsRNA 也能产生比较彻
底的基因沉默效应［7，8］。
1.2 RNA干扰技术在涡虫中的发现
涡虫以其惊人的再生能力闻名于世，早在 1989
年，Morgan 等［9］就已发现即使将涡虫切成 279 段，
其每一截段也可以再生成一个完整的个体，证实了
涡虫强大地再生能力。除此之外，涡虫作为具有三
胚层、左右对称、头部集中化等特性的最简单生物体，
在后生动物的进化过程中占据重要地位［10］。在过去
的一个世纪里，涡虫作为经典的模型生物，为后生
动物乃至人类生物学难题的解答提供了重要的参考
依据，尤其是涡虫再生机制的研究，对于脊椎动物
再生模型的建立具有重要意义［11］。但是由于缺乏行
之有效的技术，涡虫的很多相关研究只局限在形态
学和细胞学水平上，无法深入展开，因此科学家们
花费大量的精力探索新的技术用于涡虫的深入研究。
1998 年，科学家们在比涡虫高等的线虫中发现
了 RNAi 作用，主要通过 dsRNA 注射法进行干扰。
为了检测这种方法是否会在涡虫体内引发同样的基
因沉默现象，Alvarado 等［4］选取了体壁肌肉组织、
具纤毛的腹部上皮组织、光感受器 3 个涡虫易于检
测的代表性部位进行 RNAi 测定试验。研究结果表明：
dsRNA 注射法在涡虫体内会引起同样的基因沉默效
果 ；dsRNA 注射法在涡虫体内所引发的基因沉默效
应是特异的 ；dsRNA 在涡虫体内通过降解靶 mRNA
致使基因功能丧失。Alvarado 的试验结果作为一个
强有力的证据，证实了 RNAi 技术在涡虫体内发挥
的强大功效，为 RNAi 技术在涡虫生物学研究中的
应用奠定了基础。
随着 RNAi 作用在涡虫中的发现，很多科学家
ཆⓀᙗdsRNA
ATP
siRNA
ADP+Pi
ADP+Pi
5 -˃P
3 -˃OH
ATP
mRNA
mRNA
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P-5˃
OH-3˃
图 1 RNA 干扰机制［3］（仿文献中图 1 与图 2，有改动）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期26
对该领域产生了浓厚的兴趣。他们尝试用一些改良
的方法来诱导涡虫体内的基因沉默作用，如 dsRNA
饲喂法和 siRNA 浸泡法，都较为成功的起到了基因
干扰作用［10］。在之后的 10 多年时间里，dsRNA 注
射法与 dsRNA 饲喂法作为涡虫 RNAi 技术的主要方
法，在涡虫基因功能和再生机制的研究中发挥着无
法替代的作用。
1.3 RNA干扰技术在涡虫中的应用
RNAi 技术的应用，克服了涡虫研究技术的局
限性，为涡虫基因功能的研究准备了条件。2005 年，
Reddien 等［12］在 EST 库的基础上，结合 RNAi 技术，
建立了第一个以 siRNA 干扰基因功能为基础的涡虫
RNAi 基因筛选文库。这一文库的建立为涡虫更好
地作为模型生物在发育生物学研究中发挥作用奠定
了基础，同时也掀起了涡虫基因水平研究的新高潮，
此后，科学家们积极开展涡虫 RNAi 的相关研究。
1.3.1 涡虫 RNAi 多样化表型的确定 Reddien 等［5］
建立的 RNAi 基因筛选文库中，对瑞士种涡虫进行
代表性取样，选取 53 400 个涡虫截段，干扰 1 065
个基因，共筛选出 240 个代表性表型类别，用于涡
虫再生和稳态的研究。对这 240 个基因进行分析发
现，其中的大部分基因在进化上存在高度的保守
性——205 个（85%）基因在其他生物体的基因组中
发现了序列相似的同源基因。例如，涡虫中有 38 个
基因的编码序列与人类某些疾病的引发序列存在同
源性，在涡虫中对这些基因进行深入研究，有望开
发出治疗人类相关疾病的药物，并且涡虫特定基因
干扰表型易于获得，这也为相关疾病基因的研究提
供了便利的条件。另外，还有 35 个无任何进化保守
性的涡虫基因，这些基因被认为是扁形动物维持自
身生命活动所必需的看家基因，在很多扁形纲的病
原虫中这些基因也起至关重要的作用。因此可以针
对这些已知的病原基因，设计相应有效的生物制剂，
用于疾病的防御和治疗。涡虫 RNAi 多样化表型的
确定，是涡虫基因功能研究的先决条件，为特定疾
病的控制和治愈提供了有效信息，为疾病的检测技
术提供了强大后盾［13］。
1.3.2 RNAi 在涡虫 neoblast 研究中的应用 Neoblast
即涡虫成体干细胞，主要存在于涡虫的间充质区，
是涡虫体内唯一具有增殖分裂活性的细胞，涡虫的
neoblast 占其细胞总数的 20% 以上，因而可作为模
式生物用于干细胞的研究［14］。在 RNAi 机制被发现
之前，主要是通过紫外照射法特异性杀伤 neoblast，
但紫外线的杀伤作用具有非特异性，因此无法对
neoblast 的特定基因进行专门研究。而 Reddien［5］
通过 RNAi 作用筛选出导致 neoblast 表型异常的基
因——异常表型与紫外照射的涡虫截段表型相似。
再对这些筛选出的基因进行分组干扰试验，从而
确定出 neoblast 发生相关的关键基因 ：smedwi-2 和
smedwi-3［15］。近年，Salvetti 等［16］用相同的 RNA 干
扰方法在涡虫体内检测到果蝇 Pumilio 的同源基因
DjPum，该基因对于 neoblast 数量和形态的维持起重
要作用。Guo 等［17］将涡虫干细胞中的 Bruno-like 基
因干扰后，neoblast 将不能进行自我更新。除此之外，
在瑞士种涡虫中还发现 vasa、piwi、tudor 和 nanos
的同源基因，这些基因功能的缺失会引起 neoblast
数量的明显减少，表明它们是维持 neoblast 活性所
必需的［18］。neoblast 相关基因的发现为成功分离和
培养涡虫干细胞准备了条件，为人类更好地了解干
细胞的调控机制提供了有价值的线索［19］。
1.3.3 RNAi 在涡虫再生研究中的应用 涡虫的再
生过程主要伴随着胚基发生和 neoblast 分化而进
行，所有与 neoblast 的发生分化相关的基因在涡虫
的再生过程中都起着重要作用，除此之外，再生过
程中还涉及很多其他基因的相互作用，是一个非
常复杂的基因调控过程。将 RNAi 文库中已鉴定出
的 240 个干扰表型，按截段的再生阶段和胚基大小
进行分类，针对各分类表型中的相应基因进行功能
测定，从而确定出再生过程中各阶段的关键作用因
子。Cebrià 等［20］通过干扰 roboA 基因，发现神经系
统在调控涡虫前端形态发生过程中起关键作用，神
经系统相关基因干扰后，出现前端再生异常表型。
Lapan［21］发现涡虫眼点再生过程中的关键调控因
子——ovo，OVO 缺少时涡虫无法形成正常的眼点结
构。FGF-like 受体 nou-darake 基因被认为可能与涡
虫头部再生有关，该基因敲除后，可诱导涡虫的其
他部位形成异位的大脑和眼点［22］。此外，Kobayashi
和 Iglesias 等［23，24］通过对 DjwntA 基因的干扰作用
证实 ：Wnt 在涡虫再生过程前后轴极性的确立中起
关键作用，并且发现了 DjwntA 和 nou-darake/FGFR
2013年第3期 27吴雪等 ：涡虫的基因沉默作用
信号通路间的相互作用。通过分析这些已确定的再
生因子，科学家们正逐步建立起涡虫的再生模型。
该模型的建立有助于阐明高等动物细胞分化及器官
再生的分子机制，将给人类疾病的治疗、组织器官
损伤的修复带来新的希望。
2 涡虫内源性基因沉默
2.1 miRNA介导的内源性基因沉默
近年，在涡虫中发现另一条引发基因沉默的途
径。该途径的主要效应因子为 miRNA（microRNAs）：
miRNA 与 siRNA 同 为 20-25 nt 单 链 小 分 子 RNA，
但与外源性干扰 siRNA 所不同，miRNA 是由内源
性具发夹结构的 pre-miRNA 加工而成，因此该过程
又称为内源性基因沉默作用。基因组中位于内含子
或基因间隔区的非编码基因经 RNA 聚合酶Ⅱ转录
形 成 pri-miRNA，pri-miRNA 在 Drosha 及 其 辅 助 因
子 DGCR8/PASHAR 的作用下去除帽、尾结构成为
pre-miRNA［25，26］，再经 Dicer 酶切割成 20-25 nt 的
miRNA ：miRNA* 配对分子，最终成熟的 miRNA 从
miRNA ：miRNA* 双体中分离出来，与 Argonaute 蛋
白结合形成沉默诱导复合体并进行靶基因识别，从
而诱发内源性基因沉默作用［27，28］。近来的研究结果
表明，miRNA 在转录后调控中起着至关重要的作用，
miRNA 介导的内源性基因沉默作用涉及涡虫生命活
动的整个过程，如胚胎发育、形态发生、干细胞维
持及组织再生等是涡虫维持正常生命活动所必须的
调控过程［29］。
涡虫体内已发现了多种基因，它们与其他物种
中编码 miRNA 发生相关蛋白的基因同源，当被敲除
时会导致涡虫再生过程的异常，表明 miRNA 在涡虫
再生和 neoblast 维持过程中是必须的。例如，Ago-2
作为涡虫形成沉默诱导复合体的必需蛋白，被 RNAi
技术沉默后，不仅阻碍了再生过程，而且 neoblast
的数量也出现了明显的下调［30，31］。目前，在瑞士
种 涡 虫 中 已 鉴 定 出 很 多 保 守 的 miRNA 和 miRNA
簇，预测这些 miRNA 在涡虫中具有相似功能。对
涡虫 miRNA 进行高通量测序，发现了两类 miRNA ：
strain-specific miRNA 和 neoblast-specific miRNA［32］。
2.1.1 strain-specific miRNA 瑞士种涡虫具有有性
品系和无性品系两种，有性品系成熟个体同时具有
雌性生殖系统和雄性生殖系统，即雌雄同体。而无
性品系缺少成熟的生殖器官，只能进行裂体生殖。
Newmark［9］对两品系进行核型分析，发现无性品
系中的染色体易位现象可能是导致其无法产生成熟
生殖器官的根本原因。通过高通量测序对两品系的
miRNA 进行分析，寻找出很多品系特异 miRNA，其
中大部分的无性品系 miRNA 为涡虫所特有的［33］。
虽然这些特异 miRNA 与染色体易位现象间的关系还
不是很清楚，但可以确定它们确实在涡虫品系分化
中发挥作用，这些 miRNA 的发现为涡虫生殖模型的
建立准备了条件。
2.1.2 neoblast-specific miRNA 通过对紫外处理组
和非处理组涡虫 miRNA 进行高通量测序，鉴定出许
多在 neoblast 中特异表达的 miRNA。例如，miRNA
簇 mir71a/2d/13/752 中 的 41 个 miRNA 进 行 整 体 原
位杂交，杂交痕迹主要定位在神经系统和上皮组织
的 neoblast 中［33，34］。涡虫中有斑马鱼 mir-133 的同
源基因，Wnt 和 Fgf 是该基因的主要作用靶点——
它们是涡虫伤口愈合、干细胞再生及前后轴极化所
必需的［35］。最近的研究显示，涡虫 miRNA 可能在
中枢神经系统发育过程中起重要作用，因为很多涡
虫 miRNA 的作用靶点是中枢神经系统再生过程中的
关键因子，但这些特异 miRNA 对神经链接进行再生
修复的调节机制还不清楚。
2.2 piRNA介导的内源性基因沉默
2006 年，《Nature》和《Science》杂志同时刊载
了关于 piRNA 分子的报道。piRNA 是一种 26-31nt
组成的内源性单链小 RNA，主要分布在转座子、重
复序列等区域。可通过 Piwi-piRNA 复合物引起基因
沉默从而调控生殖细胞的生长发育过程，是多种生
物生殖发育得以顺利进行的重要保障［36-38］。piRNA
最早在雄性小鼠睾丸中发现，这些小 RNA 特异地与
Piwi 蛋白家族的成员相互作用，因而被命名为 Piwi-
interacting RNAs，即 piRNAs［39］。随后，Reddien 在
涡虫中也发现了 piRNA。它们可与涡虫的 Piwi 同源
蛋 白 Smedwi-2、Smedwi-3 相 互 作 用。Smedwi 蛋 白
家族在维持涡虫干细胞性能中起作用，piRNA 可通
过沉默 Smedwi-2、Smedwi-3 的表达来完成对干细胞
形态数量的调控［15］。涡虫 piRNA 在染色体上的分
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期28
布位置具有保守性。同时，其形成过程也遵循其他
物种所适用的“乒乓模型”（ping pang model）假说。
2008 年，Palakdoeti［15］证实，涡虫 piRNA 确实具有
与其他物种 piRNA 相似的功能，即 piRNA 在涡虫生
殖干细胞命运决定、减数分裂、精子发生等配子形
成事件中发挥重要作用［34］。目前，对于涡虫 piRNA
的研究较少，对其分子特征及作用机制还不是很清
楚。有人认为，piRNA 能通过表观遗传调控及转录
后调控的方式发挥基因沉默作用［40，41］，但尚需进一
步探究考证。
3 结语
RNA 干扰技术在涡虫的基因功能研究中有着
广泛的应用，对其机制和功能的研究比较透彻。
miRNA 和 piRNA 介导的内源性基因沉默作用作为
一种重要的调节机制，在涡虫新陈代谢、生长发
育、繁衍后代的过程中发挥重要作用。但目前对于
这些小 RNA 的研究较少，对它们的作用机制和功能
特性还不是很清楚。在未来的试验中，可以应用新
的测序技术对不同再生阶段中的各类细胞和组织进
行小 RNA 表达检测。同时，利用定点监测技术明
确 miRNA 和 piRNA 的作用靶点，从而建立起涡虫
小 RNA 在干细胞维持及再生调节中的作用模型。另
外，在生物体中还检测到许多其他非编码小 RNA 的
存在。如 snoRNAs 和 lncRNAs［42］，它们可调节哺乳
动物的发育过程，猜测在涡虫中也具有相似的功能，
可通过进一步的试验进行证实。
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（责任编辑 狄艳红）