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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):77-88
生物转化是一种高效生产重要化学品的路线，
并能实现绿色生产。但在化学工业中使用的大部分
底物，如类固醇类，都是非水溶性的，其转化效率
受到水溶解度低的影响。研究者采用多种方法提高
底物的溶解度，如底物微粒化、环糊精包合、浊点
系统和离子液体等，这些方法有的操作繁琐，有的
成本较高，有的难以实现产业化［1，2］。目前为止，
添加有机溶剂是工业上疏水性化合物生物转化工艺
中普遍用来改善底物溶解性的方法。但有机溶剂的
用量却因为其对微生物细胞或胞内酶的不利影响受
到严格控制，这大大限制了转化体系中底物的投料
量，最终影响生产效能。为了突破这一瓶颈，迫切
需要获得耐受有机溶剂的生物催化剂（完整细胞和
酶）。其中，完整细胞作为生物催化剂具有更多的优
收稿日期 ：2015-01-23
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21306138），天津市应用基础与前沿技术研究计划（自然科学基金）（13JCYBJC20600），天津科技大学
大学生实验室创新基金项目（1504A205X）
作者简介 ： 王艳霞，女，硕士研究生，研究方向 ：工业微生物育种 ；E-mail ：wangyanxia323@126.com
通讯作者 ：骆健美，女，博士，教授，研究方向 ：工业微生物育种 ；E-mail ：luojianmei@tust.edu.cn
利用分子生物学技术提高微生物有机溶剂耐受性的
研究进展
王艳霞  刘祥胜  王敏  骆健美 
（天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室（天津科技大学） 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）
摘 要 ： 耐有机溶剂微生物是一类能够在较高浓度有机溶剂中存活或者生长的微生物，其在非水相生物催化等领域表现出
巨大的应用优势。与自然筛选、长期驯化和传统诱变等方法相比，利用分子生物学技术获得微生物有机溶剂耐受菌株是一种更为
理性且高效的手段。主要综述了近年来利用分子生物学技术对耐性相关功能基因和转录因子进行改造，提高微生物有机溶剂耐受
性的研究进展，并展望了有机溶剂耐受菌株的应用前景。
关键词 ： 有机溶剂耐受性 ；分子生物学技术 ；工程菌 ；生物转化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.015
Research Advances on Molecular Techniques for Improving Microbial
Tolerance to Organic Solvents
Wang Yanxia Liu Xiangsheng Wang Min Luo Jianmei
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology of Ministry of Education，Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology，College of
Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457）
Abstract:  Organic-solvent-tolerant microorganisms can survive and grow in the higher concentrations of organic solvents, which exhibit
significant application advantages in the field of the non-aqueous phase biocatalysis. Compared to natural screening, long-term domestication
and traditional mutagenesis methods, molecular technique is a more rational and efficient way to obtain organic-solvent-tolerant strains. This
paper mainly summarizes the research advances on the improvement of microbial organic-solvent tolerance by the reformation of functional genes
related to the resistance to organic solvents and transcriptional factors using molecular biology techniques, also prospects the application of
organic-solvent-tolerant strain.
Key words:  organic solvent tolerance ；molecular biology techniques ；engineered strain ；biotransformation
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1078
点。如可以催化未知目标酶的反应、增加催化剂对
有机溶剂的适应性、在还原生物转化中简化辅酶因
子的再生过程等［3-5］。因此，开发耐有机溶剂的全
细胞催化剂对于推动非水相工艺的广泛应用和深入
发展具有重要的意义。
耐有机溶剂的微生物是指一类能在较高浓度有
机溶剂中存活或者生长的微生物。研究者采用直接
筛选分离的方法已从有机溶剂污染的环境（如水体、
土壤、海洋沉积物等）中得到了多种耐受有机溶剂
的微生物［6-8］。此外，也有用长期驯化或者传统诱
变方法提高微生物有机溶剂耐受性的报道［9-11］，但
这些方法都存在盲目性高，工作量大，研究周期长，
产生的正向突变体频率低，难以有效控制变异的方
向和性质等问题。
近年来，研究者已从细胞水平和分子水平对微
生物有机溶剂耐受机制进行了较为全面和深入的研
究，主要包括一般的应激反应、细胞膜调节机制、
细胞形态的改变、细胞能量代谢调节机制、与能量
偶联的溶剂外排泵及囊泡外排等，发现了许多与有
机溶剂耐受性相关的特定基因［12，13］。在此基础上，
利用各种现代分子生物学技术（如基因工程、代谢
工程、全局转录机制工程等）对微生物菌株进行理
性改造，提高其有机溶剂耐受性是一种更为理性且
高效的方法。本文总结了近年来国内外微生物有机
溶剂耐性工程菌株构建方面的研究进展，并展望其
在全细胞催化和环境污染治理等领域的应用前景。
1 耐受有机溶剂基因工程菌的构建
1.1 功能基因的操作
主要是根据已知的有机溶剂耐性机制，对与耐
性相关的功能基因（内源或者外源）基因进行操作
（如突变、敲除和过表达）。但这种改造依赖于对菌
株遗传背景和耐性机制的全面认识，因此多局限于
大肠杆菌、酿酒酵母、假单胞菌等模式微生物。
1.1.1 热激蛋白相关基因 热激蛋白（Heat shock
proteins，HSP）也称分子伴侣，是细胞在外界物理
化学刺激下产生的一类蛋白质，在胞内蛋白质合成、
转运、折叠和降解过程中起到重要作用。有机溶剂
存在的胁迫环境下，耐受菌中的大量热激蛋白被诱
发，用来阻止蛋白质聚集，并协助其重新折叠以抵
抗有机溶剂的毒性侵害［14，15］。
热激蛋白 GroESL 由单体分别为 60 kD 的 GroEL
和 10 kD 左右的 GroES 两种成分组成。GroESL 通过
催化 ATP 水解提供能量，瞬时维持其他蛋白质在折
叠过程中间态的稳定，阻止了聚集，帮助其他蛋白
质形成正确构象［16］。Zingaro 等［17］将 groESL 在大
肠杆菌中进行过表达。结果表明，与对照菌株相比，
重组菌株分别在 4%（V/V）乙醇、0.75%（V/V）正
丁 醇、1.25%（V/V）2-丁 醇、20%（V/V）1，2，4-丁
三醇中培养 48 h 后，菌体浓度分别增大了 12 倍，2.8
倍、3 倍 和 4 倍。2002 年，Akiko 等［18］ 将 groESL
在 Acetobacter aceti 中进行过表达，重组菌株在 5%
（V/V）乙醇条件下培养 36 h 后的菌体浓度与对照菌
株相比增加了 10 倍左右，此外，重组菌株对醋酸和
热条件也表现出较好的耐受性。2003 年，Tomas 等［19］
发现在 Clostridium acetobutylicum 中过表达 groESL 可
以减少丁醇对细胞的毒害作用，重组菌株在 0.75%
（V/V）丁醇处理 2 h 后的细胞存活率较对照菌株
提高了 85%。2012 年，Mann 等［20］ 研究发现在 C.
acetobutylicum 分别过表达 groESL、grpE 和 htpG 时，
重组菌株的丁醇耐受能力均得到明显提高。将重组
菌株与对照菌株分别置于 2%（V/V）丁醇中处理 2 h
后，对照菌株不能存活而重组菌株仍保持较高的活
力，进一步研究发现，重组菌株中 groESL、grpE 和
htpG 基因的表达量较对照菌株分别提高 45%、25%
和 56%。此外，热激蛋白 GroESL 的过表达也成功
提高了乳酸乳球菌、副干酪乳杆菌及植物乳杆菌等
其他微生物的有机溶剂耐受性［21］。
DnaK 是一种重要的热激蛋白 70（Hsp70），它
包含一个 N 末端 ATPase 和一个 C 末端区域，dnaK
在体外能溶解热变性的蛋白聚集物，在活体内能与
胁迫诱导的未折叠多肽结合阻止其聚集变性，在胁
迫减轻后有活性的酶又被释放出来，达到保护酶结
构的作用。DnaJ 是一种调节蛋白，它能活化 DnaK
的 ATPase 活 性， 协 同 完 成 对 底 物 蛋 白 的 ATP 依
赖 的 结 合 和 释 放［22］。2010 年，Sugimoto 等［23］ 将
Escherichia coli 中的 dnaK 基因在 Lactococcus lactis 中
异源表达，与对照菌株相比，重组菌株在 5%（V/V）
乙醇中培养 36 h 后，菌体浓度增大了 1.13 倍，细
胞倍增时间降低了 1.29 倍。同时，重组菌株对 3%
2015,31(10) 79骆健美等：分子生物学技术提高微生物有机溶剂耐受性的研究进展
NaCl，高温（40℃）和 0.5% 乳酸（pH 5.47）都表
现出良好的耐受性。Akiko 等［24］将热激蛋白 DnaKJ
在 A.aceti 中进行过表达，大大提高了菌株在较高浓
度乙醇下的生长能力。重组菌株在 5%（V/V）乙醇
中培养 36 h 后的 OD660 值约为 1.2，而对照菌株仅为
0.9。除此以外，重组菌株对高温胁迫也表现出较好
的耐受能力。
Kang 等［25］通过分析嗜冷菌 Bacillus psychrosac-
charolyticus 的二维电泳和串联质谱发现，热激蛋
白 Hsp33 在 3%（V/V） 异 丙 醇 处 理 30 min 后 被
诱导表达。为进一步验证 Hsp33 功能，研究者将
B.psychrosaccharolyticus 中 的 Hsp33 在 E.coli 进 行 异
源表达，结果发现重组菌株经 3%（V/V）异丙醇处
理 30 min 后活细胞数与对照菌株相比提高了 100 倍。
除了对单个功能基因进行操作，研究者还利用
多个功能基因的共表达提高微生物的有机溶剂耐受
性。2012 年，Zingaro 等［26］在大肠杆菌中同时过表
达热激蛋白 GrpE 和 GroESL，重组菌株在 5%（V/V）
乙醇中培养 24 h 后的活菌数是对照菌株的 3 倍 ；同
时过表达 GroESL 和 ClpB 的重组菌株在 5%（V/V）
乙醇、1%（V/V）正丁醇和 1%（V/V）异丁醇中培
养 24 h 后的活菌数较对照菌株分别提高了 1130%、
78% 和 25% ；同时过表达 GrpE、GroESL 和 ClpB 的
重组菌株在 7%（V/V）乙醇、1%（V/V）正丁醇和
25%（V/V）1，2，4-丁三醇中培养 24 h 后的活菌数较
对照菌株分别提高了 200%、390% 和 78%。这些研
究表明，利用基因工程技术对热激蛋白相关基因进
行操作是构建有机溶剂耐受菌的一种有效手段。
1.1.2 细胞膜调节机制的相关基因 微生物细胞膜
是细胞与外界物质交换的通道，而且对细胞内能量
传导有着特殊的意义，因而直接影响微生物的有机
溶剂耐受性。大量研究表明，微生物细胞主要通过
增加细胞膜饱和 / 不饱和脂肪酸的比率、细胞膜不
饱和脂肪酸的顺 - 反异构化及磷脂极性头部的变化
来提高其有机溶剂耐受性［12，27，28］。
微生物细胞膜中饱和脂肪酸的相变温度高于对
应的不饱和脂肪酸［29］。所以通常认为，增大脂肪
酸的饱和度，可以抵消有机溶剂引起的细胞流动性
的增加。如菌株 Pseudomonas putida DOT-T1E 接触
甲苯时，通过增大脂肪酸的饱和度提高了其溶剂耐
受性［30］。Oh 等［31］ 在 E.coli 中敲除一个参与饱和
脂肪酸降解和不饱和脂肪酸合成的基因 fad 的抑制
基因 fadR，结果表明，敲除菌株细胞膜上各种饱和
脂肪酸的含量比对照菌株增加了 16%，敲除菌株在
终浓度为 2%（V/V）的混合有机溶剂（正己烷 / 环
己烷 =1/1，V/V）中培养 7 h 后菌体 OD600 值为 0.5，
而对照菌株 OD600 值仅为 0.14。Luo 等
［32］将 E. coli
W3110 中编码 3-羟基癸脂酰 ACP 脱水异构酶（主要
参与饱和脂肪酸合成）的 fabA 在 E.coli DH5α 中进
行过表达，结果表明，与对照菌株相比，重组菌株
于 3%（V/V）乙醇中培养 25 h 后，其饱和脂肪酸含
量提高 15%，菌体浓度提高了 67%，而将 Bacillus
subtilis 中编码脂肪酸脱氢酶（催化脂肪酸链上特定
位置形成双键）的 des 基因在 E.coli DH5α 中进行异
源表达后发现，重组菌株在 3%（V/V）乙醇中培养
25 h 后，饱和脂肪酸含量和菌体浓度比对照菌株分
别下降了 10% 和 22%。
微生物细胞对有机溶剂的适应行为表现出明显
的菌种特异性。研究表明，不饱和脂肪酸（如油酸、
棕榈油酸等）对酿酒酵母的有机溶剂耐受性具有重
要的作用。酿酒酵母的去饱和酶基因 OLE1 编码位
于细胞质膜上的去饱和酶，这种酶可以通过氧化作
用和依赖 NADH 的去饱和过程将酵母细胞中的饱和
脂肪酸（棕榈酸和硬脂酸）转化为对应的不饱和脂
肪酸（棕榈油酸和油酸）［33］。Kajiwarat 等［34］在酿
酒酵母中过表达去饱和酶基因 OLEl，结果发现，重
组菌株细胞内油酸、棕榈油酸这两种不饱和脂肪酸
的含量较对照菌株增加 5%，重组菌株对乙醇的耐受
浓度提高到 15%（V/V）。You 等［35］利用纹夜蛾中
的膜去饱和酶基因 TniNPVE 与酿酒酵母去饱和酶基
因 OLE1 的突变体进行互补。结果表明，表达纹夜
蛾去饱和酶基因的重组菌株在 5%（V/V）乙醇中培
养 48 h 后的油酸和棕榈酸含量比对照菌株分别增加
了 2 倍和减少了 38%，菌体浓度比对照菌株提高了
5 倍 左 右。2003 年，Zhao 等［36］ 在 C.acetobutylicum
中过表达环丙烷脂肪酸合酶基因 cfa，与对照菌株
相比，重组菌株在对数初期的环丙烷脂肪酸含量出
现了明显增加，其中 C17-环丙烷脂肪酸增加 27%，
C19-环丙烷脂肪酸增加了 91%。对数初期添加 90
mmol/L 丁醇后继续培养 100 min，重组菌株表现出
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1080
更好的丁醇耐受性，其 OD600 值达到 0.727，而对照
菌株 OD600 仅为 0.416。
Okochi 等［37］将甘露糖的磷酸转移酶 ManXYZ
在大肠杆菌中进行过表达，结果表明，10%（V/V）
正己烷处理 0.5 h 后，重组菌株细胞内的正己烷含量
比对照菌株降低了 11%。这可能是因为 ManXYZ 在
大肠杆菌中的表达改变了细胞膜性质（如减小了细
胞膜通透性或增加细胞排除有机溶剂的能力），从而
提高了其对正己烷的耐受性。
1.1.3 外排泵相关基因 细胞膜作为细胞的第一道
防御屏障，并不能阻挡所有的有机溶剂，当溶剂进
入细胞后，会产生相应的破坏作用，面对这种情况，
耐受性微生物会通过与能量偶联的外排泵机制将胞
内的溶剂排出，保证其正常的生理环境。
Dunlop 等［38］利用生物信息学方法，在数据库
中发掘到了 43 个外排泵基因，并将其在大肠杆菌中
表达，用 7 种常见的有机溶剂分别测试其耐受性，
发现 43 株工程菌对丁醇和异戊醇的耐受性都没改
变，而对其他 5 种（香叶酯，香叶醇，α-蒎烯，柠檬烯，
法尼己）有机溶剂的耐受性均有显著提高。
AcrAB-TolC 是大肠杆菌中最重要的主动外排
泵系统，能够将己烷、庚烷、辛烷和壬烷等排出胞
外［39］。AcrAB-TolC 属于 RND 家族，由膜融合蛋白
（AcrA）、外排转运蛋白（AcrB）和外膜通道蛋白（TolC）
组成。其中，AcrAB 的表达受到多种调控因子的调
节，如正调控因子 MarA、Rob、SoxS 和 Fis。其中，
MarA、Rob 和 SoxS 都能直接与 acrAB 的启动子结合，
提高 acrAB 的转录，也能通过增加 marA 的表达间
接促进 acrAB 转录。而负调控因子 MarR，通过抑制
marRAB 的表达调控细胞内 MarA 的水平［40］。研究
者通过对以上调控因子的过表达和突变，提高了大
肠杆菌对有机溶剂的耐受性。1997 年，Asako 等［41］
利用高拷贝质粒 pHA 将 marA 和 marR 基因在大肠
杆菌中分别进行过表达。结果表明，对数初期加入
10%（V/V）环己烷继续培养 8 h 后，对照菌株的活
细胞数为 105 个 /mL，过表达 marA 基因的重组菌株
的活细胞数维持在 107 个 /mL，而过表达 marR 基因
的重组菌株的活菌数仅为 104 个 /mL。为进一步验
证 marR 功能，2012 年，Oh 等［31］将大肠杆菌中的
marR 基因进行敲除。结果表明，敲除菌株在终浓度
为 2%（V/V）混合有机溶剂（正己烷 / 环己烷 =1/1，
V/V）中培养 7 h 后的 OD600 值为 0.28，而对照菌株
OD600 仅为 0.14。1995 年，Nakajima 等
［42］利用高拷
贝质粒 pOST4034BR 将 robA 基因在大肠杆菌中进行
过表达。结果表明，重组菌株在 10%（V/V）环己烷
的条件下仍然保持一定的生长速率，倍增时间由原
来的 25 min 延长到 80 min，环己烷处理 10 h 后重组
菌株的活细胞数维持在 5×106 个 /mL，而对照菌株
仅 为 103 个 /mL。1998 年，Aono 等［43］ 发 现 marA、
robA 和 soxS 的过表达使得大肠杆菌中 AcrA 和 TolC
蛋白表达量增加，有利于外排泵的活动，从而提高
了菌株对环己烷的耐受能力。而敲除 tolC 基因的突
变株却对正己烷及环己烷表现出敏感性。
恶臭假单胞菌中有 4 个溶剂外排泵 ：ttgABC、
ttgDEF、ttgGHI 和 srpABC。 其 中 srpABC 属 于 RND
家族，由 3 部分组成，分别为内膜转运蛋白（SrpB），
胞质连接蛋白（SrpA）以及外膜通道蛋白（SrpC）［44］。
Kieboom 等［45］ 从 Pseudomonas putida S12 中 克 隆 得
到了膜结合溶剂外排泵基因 srpABC 的核苷酸序列，
将其转入对溶剂敏感的 P.putida JK1 中。结果发现，
重组菌株在 1%（V/V）己烷和环己烷中生长良好，
而对照菌株则不能生长。
2012 年，Teixeira 等［46］ 将酵母中编码 ABC 转
运蛋白的 PDR18 基因进行敲除，结果表明，6%（V/V）
乙醇中处理 10 h 后敲除菌株的活细胞数出现明显
下降，而对照菌株活细胞数呈增长趋势。2013 年，
Yang 等［47］ 从 Saccharomyces cerevisiae BY4741 中 克
隆了溶剂外排泵基因（ADP1）并将其进行过表达。
结果表明，与对照菌株相比，重组菌株在 5%（V/V）
乙醇处理条件下生长速率提高了 20%，同时乙醇产
量提高了 10%。
1.1.4 相容性溶质合成与分解相关基因 相容性溶
质是一类在生理条件下不带净电荷的易溶有机渗透
保护物质，能在细胞内大量积累，而不影响细胞的
生理活动、DNA 复制和蛋白质分子的正确折叠，对
于稳定细胞组分和蛋白质分子的天然结构具有重要
的作用［48］。研究表明，微生物细胞通过相容性溶质
的大量积累提高其对干旱、氧化、冷和热、有机溶
剂等环境胁迫的耐受性［49］。目前在细菌中发现的相
容性溶质分为以下几类 ：氨基酸类（如脯氨酸、甘
2015,31(10) 81骆健美等：分子生物学技术提高微生物有机溶剂耐受性的研究进展
氨酸和色氨酸）、氨基酸衍生物类（如甘氨酸甜菜碱、
脯氨酸甜菜碱和四氢嘧啶）、甲胺类（如肉碱和二甲
基丙磺酸）、小分子肽类（如 NAGGN 和 N-乙酰鸟甘
酸）、双糖类（如海藻糖）、多元醇类（如甘油）和
硫酸酯类［50］。但不同微生物对相容性溶质的选择不
同，同一微生物在生长的不同时期对相容性溶质种
类的要求也存在变化。
大部分革兰氏阳性菌积累的游离氨基酸主要是
脯氨酸。Takagi 等［51］通过定点突变的方法对酿酒
酵母中的 PROI 基因（编码脯氨酸合成的关键酶——
谷氨酰蛋白激酶）进行改造，结果表明，突变菌株
在 9%（V/V）乙醇条件下培养 2 d 后，细胞内的脯
氨酸含量和活细胞数较对照菌株分别提高了 2.7 倍
和 1 倍。研究者还对脯氨酸代谢所必须的脯氨酸氧
化酶 put1 基因进行了敲除，结果发现，敲除菌株在
9%（V/V）乙醇条件下培养 2 d 后，细胞内的脯氨
酸含量及活细胞数分别是对照菌株的 1.55 倍和 1.4
倍，说明胞内脯氨酸含量的增加能够提高酿酒酵母
对乙醇的耐受性。
海藻糖作为一种非还原的双糖，广泛存在于植
物、细菌、真菌和昆虫等无脊椎动物中，它既是一
种储藏性糖类，又是应激代谢和渗透保护的重要物
质［52］。2012 年，Moon 等［53］在酿酒酵母内异源表
达了来自白色链霉菌的海藻糖合成基因 SALc，重组
菌株在 12%（V/V）乙醇中培养 12 h 后的细胞相对
活力维持在 94%，而对照菌株仅为 57%。海藻糖在
酸性海藻糖酶和中性海藻糖酶的催化下分解成 2 个
葡萄糖分子。Jung 等［54］利用反义 RNA 技术干扰酸
性海藻糖酶基因（ATH1）在酿酒酵母的表达，降低
了酸性海藻糖酶基因的表达量和酸性海藻糖酶活性，
结果发现，8%（V/V）乙醇浓度处理 8 h 后，重组菌
株（进行反义 RNA 干扰处理）到的活菌数约为对照
组（未进行反义 RNA 干扰处理）的 1.5 倍。Nguyen 等［55］
研究了海藻糖合成途径关键基因 otsBA 过表达对大
肠杆菌对甘油中有毒杂质耐受性的影响，结果表明，
otsBA 基因过表达的重组菌株可耐受 60 μmol/L 的过
氧化叔丁醇。
2007 年，HirasawaI 等［56］ 分 析 了 S. cerevisiae
FY834 和 S. cerevisiaeIFO2347 经 5%（V/V） 乙 醇 处
理 0-180 min 后的 DNA 芯片数据。结果发现，乙醇
处理后色氨酸合成相关基因（TRP1、TRP2、TRP3
和 TRP5）的表达量发生显著变化。为进一步证明其
功能，分别将 TRP1、TRP2、TRP3和 TRP5 基因于 S.
cerevisiaeYN120 进行过表达，结果表明，与对照菌
株相比，重组菌株在 5%（V/V）乙醇培养条件下的
比生长速率分别提高了 32%、16%、20% 和 28%。
1.2 转录因子的操作
大量文献表明，细胞表型和基因并非是一一对
应的线性关系，细胞表型往往是由多个基因通过复
杂的代谢网络进行调控的。因此，完全依赖于单个
或者多个与有机溶剂耐受性相关的功能基因（内源
和外源）的操作，往往不能获得同步的、全局的最
优结果，目的表型在整体水平上的提高受到一定限
制。转录因子是指那些专一结合于 DNA 的特定列上
的、能激活或抑制其他基因转录的蛋白质。它的表
达会激活多种抗逆功能基因同时表达，因此可以通
过水平转移转录因子来提高生物的抗逆特性。与导
入或改良个别功能基因来提高某种抗性的传统方法
相比，通过改良或增强一个关键转录因子对于提高
微生物抗逆性的方法则更为有效。
1.2.1 原核生物 RNA 聚合酶相关的转录因子 原核
生物细胞体内只有一种 RNA 聚合酶，负责基因的转
录。细菌 RNA 聚合酶由 5 种不同的亚基构成。首先
包含一个由 α、β、β’和 ω 组成的核心酶。核心酶
只能使已经开始合成的 RNA 链延长，但不具有起始
合成 RNA 的能力，必须加入 σ 亚基才表现出全部聚
合酶的活性［57］。目前大肠杆菌中发现的 σ 因子有 7
种，分别为：σD（70）、σN（54）、σS（38）、σH（32）、
σF（28）、σE（24）和 σfecI。其中，σD 是最主要的因
子（Primary / housekeeping factor），负责与细胞生长
相关的 1 000 多个基因的转录控制 ；σS 则负责细胞
稳定期与压力响应相关的 100 多个基因的转录调控；
σH 调控细胞的热应激响应与压力响应基因（约 40
个）；σE 则控制约 5 个极端热应激响应及外细胞质基
因 ；其他几种 σ 因子的功能分别与 N 代谢调控与压
力响应（σN）、鞭毛排列（σF）及柠檬酸铁代谢调控
（σfecI）等几十个基因相关。目前，研究者在大肠杆菌、
枯草芽孢杆菌、棒杆菌等模式菌株中对 σ 因子的结
构与功能展开了深入的研究［58-60］。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1082
2007 年，美国麻省理工学院的 Alper 等［61］提
出了“全局转录工程”的概念（Global transcription
machinery engineering，gTME）。全局转录工程是一
种全新的改进细胞表型的定向进化方法，主要通过
易错 PCR 等技术对细胞中转录元件进行突变修饰，
使细胞的转录在整体水平上发生改变，有利于由多
种基因调控的性状得以改进。研究者对大肠杆菌中
编码 σ70 因子的 rpoD 基因及其上游启动子之间的序
列进行易错 PCR，将扩增得到的片段连接至一个低
拷贝的表达载体上，转入大肠杆菌构建一个容量为
106 的突变文库，然后在不同的乙醇压力下进行突变
菌株的筛选。结果表明，含有突变 σ70 因子的大肠杆
菌在含有 50 g/L 乙醇的 LB 培养基中的倍增时间为 3.5
h，在含有 60 g/L 乙醇的 LB 培养基中的倍增时间为
6 h，而对照菌株在含有 50 g/L 乙醇的 LB 培养基中
的倍增时间为 4-6 h，在含有 60 g/L 乙醇的 LB 培养
基中已经没有明显的生长现象。最终筛选得到的优
良突变株对乙醇的耐受性提高到 70 g/L。这说明转
录因子 σ70 的突变显著提高了大肠杆菌的乙醇耐受
性。2012 年，Ma 等［62］利用 TAIL-PCR 技术克隆得
到了革兰氏阳性菌 Rhodococcus ruberTH3 的 σ70 基因
（sigA），采用易错 PCR 对 sigA 基因进行随机突变，
将扩增得到的片段连接在大肠杆菌 - 红球菌的穿梭
载体 pNVA 上，并电转入 R. ruber TH3 中，采用不
同浓度的丙烯腈和丙烯酰胺进行筛选，最终获得在
丙烯腈和丙烯酰胺双重压力下耐受能力最高的突变
株 TH3/M4N1-59，该菌株在 0.6%（V/V）丙烯酰胺
条件下培养 48 h 后，菌体浓度与对照菌株相比提高
了 1.6 倍。Klein-Maruschamer 等［63］进一步提出，由
于 RNA 聚合酶 α 亚基的功能可能参与 RNAP 全酶与
启动子上游序列的牢固结合以及结合某些活化因子。
因此，对 α 亚基的突变同样可以在转录水平上产生
对细胞表型调控的全局扰动，从而可以获得各种性
能提升的细胞表型。为此，他们在高、中、低 3 个
频度水平上构建了 RNA 聚合酶 α 亚基（rpoA）的随
机突变库，并导入大肠杆菌。在 0.9%（V/V）丁醇
的压力条件下进行筛选，最终获得优良突变株 L33，
该菌株在 0.9%（V/V）1-丁醇，1.6%（V/V）2-丁醇，
0.25%（V/V）1-戊醇和 0.6（V/V）3-戊醇条件下培
养 12 h 后，菌体浓度与对照菌株相比分别提高了
125%、25%、120% 和 46%。
1.2.2 真核生物 RNA 聚合酶相关的转录因子 真核
生物细胞体内存在 3 种 RNA 聚合酶，RNA 聚合酶 I
转录 rRNA，RNA 聚合酶Ⅱ转录 mRNA，RNA 聚合
酶Ⅲ转录 tRNA 和其他小分子 RNA，在 RNA 复制和
转录中起作用。其中 RNA 聚合酶Ⅱ引导的转录中有
近 75 种转录因子和共刺激因子的参与［64］。转录因
子 spt15 属于转录起始复合物部分，它是一种 TATA
结合蛋白，与 RNA 聚合酶Ⅱ及十几种基本转录因子
结合后可以对基因组中绝大多数的 mRNA 基因进行
转录。因此，对其进行代谢工程操作可同时改变细
胞内多个基因的转录水平，从而引起表型的改变［65］。
Alper 等［64］通过易错 PCR 对酿酒酵母（S.cerevisiae）
的 RNA 聚合酶Ⅱ转录因子 TFIID 中 TAF25 亚基和
与 TATA 序列结合的 SPT15 亚基进行多轮改组突变
修饰，建立二者的突变库后转化入酿酒酵母中，筛
选得到的 SPT15-300 突变株在含有 6%（V/V）乙醇
的培养基中的生长速率达到了对照菌株的 13 倍，该
菌株在 12.5%（V/V）乙醇条件下培养 30 h 后 OD600
值为 0.6，而对照菌株 OD600 仅为 0.25。
SPT3 是 酵 母 菌 转 录 起 始 共 激 活 因 子 复 合 体
SAGA 的成分之一，负责引导 TATA 结合蛋白 TBP
（TATA-binding protein）结合到特定的启动子区。大
连理工大学的赵心清等［66］对酿酒酵母中负责胁迫
相关基因转录的 SAGA 复合体的 SPT3 编码基因进行
易错 PCR，并将易错 PCR 产物连接改造的 pYES2.0
表 达 载 体 并 转 入 S.cerevisiae 4126， 构 建 了 突 变 文
库。筛选得到了在高浓度乙醇中耐受性提高的突变
株 M25，该菌株能在 10%（V/V）乙醇中生长较好，
并能利用 125 g/L 的葡萄糖进行乙醇发酵，此时，
乙醇产量比对照菌株提高了 11.7%。Hou 等［67］在
S.cerevisiae TH-AADY 中共表达 SPT3 和 SPT15 的编
码基因，结果表明，重组菌株在 12%（V/V）乙醇
条件下的活菌数与对照菌株相比增加了 1 000 倍。
1.2.3 cAMP 受 体 蛋 白（CRP） CRP 是 一 个 能 调
控 100 多个基因启动子 / 操纵子转录激活的因子。
cAMP 激 活 CRP 后， 形 成 cAMP-CRP 复 合 物， 该
复合物能与上游启动子区的对称保守的 DNA 序列
TGTGA-N6-TcAcA（被称为 CRPbox）结合，而 CRP-
启动子区 DNA 的相互作用是调控靶基因的关键［68］。
2015,31(10) 83骆健美等：分子生物学技术提高微生物有机溶剂耐受性的研究进展
目前，大肠杆菌中的 CRP 正调控模型研究的非常
深入。
2012 年，Basak［69］通过易错 PCR 得到随机突
变的 crp 基因，将其连接到载体 pKSCP 并电转入大
肠杆菌中，利用含有 0.25%（V/V）甲苯的培养基进
行筛选，得到了 3 株甲苯耐受菌株 M1、M2 和 M3。
其中，M2 突变株在 0.23%（V/V）的甲苯培养 43 h
后的生长速率达到了 0.51/h，而对照菌株未见生长，
此外，M2 分别在 3.0%（V/V）正己烷，0.23%（V/V）
对二甲苯的条件下培养 53 h，其 OD600 均能达到 2.25
左右，而对照菌株均不能生长。同年 Zhang 等［70］
对 crp 基因进行易错 PCR，并将易错 PCR 产物连接
到载体 pKSCP 并电转入 E. coli DH5α，构建突变文库，
最终筛选得到了能耐受高浓度 1-丁醇的突变株 MT5，
该菌株在 1.2%（V/V）1-丁醇条件下培养 12 h 后的
生长速率为 0.18 h-1，而对照菌株仅为 0.09/h，采用 2%
（V/V）1-丁醇冲击 40 min 后，突变菌株 MT5 的细胞
存活率为 25%，而对照菌株仅为 3%。
1.2.4 其他的转录因子
1.2.4.1 耐辐射异常球菌中的 IrrE IrrE 是来源于耐
辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）的一个全
局转录因子，能够通过调控一系列代谢途径进而高
效提高耐辐射异常球菌 DNA 修复能力和极端辐射
抗性［71，72］。
2010 年，Ying 等［73］将耐辐射异常球菌中 irrE
在运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）异源表达，
重组菌株在 12%（V/V）乙醇条件下培养 60 h 后的
OD600 值为 1.57，而对照菌株 OD600 仅为 1.0。经 20%
（V/V）乙醇处理 4 h 后，重组菌株的活菌数比对照菌
株提高了 1 000 倍。2011 年，Chen 等［74］的研究却
表现出不一样的结果。野生型 irrE 基因在大肠杆菌
中进行异源表达后不能明显提高菌株对乙醇的耐受
性。因此，研究者采用易错 PCR 技术对野生型 irrE
基因进行随机突变，将易错 PCR 产物连接到 pMG1
载体并电转入 E. coli DH5α 中，构建容量为 106 的液
体突变文库，在不同乙醇压力下进行筛选，最终得
到乙醇耐受性提高的突变菌株 E1，该菌株在 3%、
4% 和 5%（V/V）乙醇条件下培养 23 h 后的菌体浓
度较含空质粒的对照菌株分别提高了 1.6 倍，3 倍
和 48 倍。经 12.5% 乙醇冲击 1 h 后，突变菌株的活
菌数较含有野生型 irrE 菌株和含空质粒的对照菌株
分别提高了 10 倍和 100 倍。这些结果表明，IrrE 作
为一个全局转录因子，在微生物耐受性表型的定向
进化中具有遗传背景清楚、分子操作手段成熟、效
果提高明显等优点，突出表现了其广泛的应用潜力。
1.2.4.2 人工转录因子 人工转录因子是通过模拟
天然转录因子的结构，由人为设计的 DNA 结合结构
域和功能结构域组成。因此，可以通过改变 DNA 结
合结构域灵活选择其作用靶位，也可以通过改变效
应结构域对目的基因进行激活、抑制、甲基化等改造。
人工转录因子（ATF）目前已作为研究抗逆性的一
种重要手段，具有应用灵活，方便调控目的基因表
达等优点［75］。
2011 年，Lee 等［76］通过随机组装 40 个不同的
锌指 DNA 结合蛋白，构建容量为 6.4×104 的人工转
录因子文库，将构建的 ATF 连接到 pACYC 载体并
转入大肠杆菌中，在不同浓度的丁醇压力下进行突
变株的筛选，最终获得丁醇耐受性提高的菌株 BT，
该菌株在 1.5%（V/V）丁醇中培养 24 h 后 OD600 值
为 0.9，而对照菌株 OD600 仅为 0.2。
1.2.4.3 转录因子 spo0A spo0A 基因对 C. acetobuty-
licum 孢子的形成和溶剂的产生具有关键的调控作
用，对多种稳定遗传的现象具有调控作用，直接
或间接影响了细胞发展早期超过 500 种基因的表
达［77］。2003 年，Keith 等［78］ 将 spo0A 基 因 在 C.
acetobutylicum 进行过表达，结果表明，0.6%（V/V）
丁醇条件下，重组菌株相较于对照菌株的丁醇耐受
能力明显提高，培养 70 h 后，重组菌株的葡萄糖利
用率为 75%，而对照菌株在处理 18 h 后就停止了对
葡萄糖的利用。
2 耐有机溶剂微生物的应用
2.1 全细胞生物转化领域中的应用
生物转化体系中，有机溶剂作为反应介质具有
以下优点 ：（1）由于底物在有机介质中的溶解度比
水相中大大提高，因此可提高投料浓度 ；（2）减少
基质和产物对酶的抑制作用，提高转化率 ；（3）有
利于产物的分离，提高产物得率。更为重要的是，
有机相中进行的微生物催化反应可以得到一些传统
方法无法合成的重要物质。因此，耐有机溶剂微
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1084
生物的发现和创建表现出巨大的应用价值。Faizal
等［79］以甲苯为唯一碳源，从活性污泥中分离出一
株恶臭假单胞菌 P. putida T-57，该菌能利用丁醇、
甲苯、二甲苯等多种有机溶剂，能够在甲苯和矿物
盐类培养基的配比为 10%-90% 的范围内生长，并
能忍受 logP 高于 2.5 的有机溶剂。因此，P. putidaT-
57 在非水相的全细胞生物转化领域具有重要的应用
价值。Suzuki 等［80］从土壤中筛选到一株耐二甲苯
的 Pseudomonas putida ST-491， 该 菌 株 能 转 化 石 胆
酸生成固醇类激素的前体化合物雄甾 -1，4-二烯 -3，
17-二酮（ADD）。研究者发现，在 20%（V/V）二苯
醚的双相体系中投加 1.33 mmol 的石胆酸，转化 13
d 后的转化率达到 60%，与不添加有机溶剂的反应
体系相比，ADD 的产率提高了 9 倍。Aono 等［81］筛
选得到一株耐甲苯的 P. ST-200，该菌株可以在含量
为 10%（V/V）混合有机溶剂（二苯基甲烷 / 二甲苯
=7/3，V/V）的双相体系中转化胆固醇（20 mg/mL），
反应 8 d 后 98% 的底物被转化，其中，产物胆甾 -4-
烯-3，6-二酮的产率为 37%。 随 后 的 研 究 表 明，P.
ST-200 在含有环辛烷的双相体系中转化胆固醇的速
率最快，与不添加有机溶剂的反应体系相比，反应
速率提高了 5 倍，而且使用不同的有机溶剂可以获
得不同的转化产物。
2.2 生物燃料和生物基化学品生产上的应用
随着石油资源的耗竭和温室效应等环境问题的
日益突出，高效利用可再生原料生产能源和化学品
已成为全球关注的重点之一。乙醇等有机溶剂是一
类重要的平台化学品，被认为是极具发展潜力的生
物燃料和生物基化学品［82］，但发酵终点高浓度的
醇类物质会对微生物的生长和活性产生强烈的抑制
和毒害作用，进而影响发酵效率。因此，开发耐有
机溶剂的微生物是解决这一关键问题的有效途径。
2003 年，Tomas 等［19］将热激蛋白（groES 和 groEL）
在 C. acetobutylicum ATCC 824 中进行过量表达，重
组菌株丁醇的产量比野生菌株和对照菌株分别提高
40% 和 33%，代谢活性周期比野生菌株延长了 215
倍。2008 年，Hou 等［67］ 在 S.cerevisiae TH-AADY 中
共表达 SPT3 和 SPT15 的编码基因，结果表明，重
组菌株能在 12%（V/V）乙醇中生长较好，并能利
用 250 g/L 的葡萄糖进行乙醇发酵，与对照菌株相
比葡萄糖利用率提高了 49.03%，乙醇产量提高了
8.09%。2012 年，Mann 等［20］ 将 groESL 基 因 在 C.
acetobutylicum 进行过量表达，研究结果发现，重组
菌株的丁醇耐受能力均得到明显提高，重组菌株丁
醇产量与对照菌株相比提高了 130%。
2.3 在环境污染治理领域的应用
有机溶剂对环境的污染具有持久性并有致癌风
险，是目前环境污染治理领域的研究难点和热点。
常见的处理方法一般包括化学法、物理法和微生物
法等，其中，微生物法由于处理费用低、处理效果好、
不产生二次污染等优点而表现出巨大的应用潜力。
李春荣等［83］从炼油厂污水池底泥中筛选得到到 4
株有机溶剂耐受菌株，这些菌株对石油污染物均表
现出较高的降解能力。将筛选到的节细菌（Arthrob-
acte sp.）接种于石油烃质量浓度为 10 000 mg/L 的
液体培养基中，培养 20 d 后，石油烃的降解率达到
90.8%。Paje 等［84］从活性污泥中分离得到一个菌株
R.sp.33，该菌株在苯浓度为 174 ppm 的培养基中培
养 30 d 后，菌体的 OD600 维持在 0.6 左右，此时苯
的 降 解 率 达 到 95%。Tao 等［85］ 将 R.erythropolis XP
中的 dszABCD 基因在耐有机溶剂菌株 P.putida Idaho
中进行过表达，构建得到了耐有机溶剂的脱硫菌株
P.putida A4，该菌株在 10%（V/V）对二甲苯条件下
培养 22 h 后的菌体浓度比对照菌株提高了 26%。同
时，该菌株在 10%（V/V）对二甲苯体系下培养 40 h
后能够降解 0.485 mmol/L 的硫芴，降解率达到 97%。
3 展望
生物转化正在引起工业生物技术的革命性变化，
主要是因为生物催化剂具有周期短、成本低、区域
和立体选择性强、反应条件容易控制、对环境友好
等优点。其中，生物催化剂的有机溶剂耐受性作为
一种非常重要的特性，在生物燃料生产、生物修复、
生物医药合成、污水处理等领域具有巨大的应用价
值［86］。目前，在工业生产中，一些耐有机溶剂的酶
已得到广泛应用，如脂肪酶等［87］，而耐有机溶剂的
微生物（完整细胞）还少见报道。但后者在操作上
表现出的简便性和灵活性使其成为近年来有机相生
物催化领域的研究热点。
2015,31(10) 85骆健美等：分子生物学技术提高微生物有机溶剂耐受性的研究进展
微生物有机溶剂耐受性是受到多个基因共同控
制的复杂表型，这些基因之间存在着非常复杂的相
互作用，且表达容易受到环境的影响。与其他获得
耐有机溶剂微生物的方法（如自然分离和筛选、诱
变等）相比，利用分子生物学技术对微生物进行遗
传改造以提高其有机溶剂耐受性则表现出操作简单、
目标定向、效果明显等优点。但对于一些非模式的
微生物，其复杂的生理代谢过程和尚不清楚的耐性
机制，以及有效的遗传操作工具的缺乏，给分子生
物学的改造带来了很大的困难。近年来，随着各种
组学技术（基因组学、转录组学、蛋白质组学和代
谢组学等）的发展，研究者对微生物生理代谢过程
的理解不断深入和全面，发现了越来越多与微生物
有机溶剂耐性相关的蛋白或转录调控因子，这些都
为从分子水平上系统全面的揭示微生物有机溶剂耐
性机制奠定了基础，也为进一步改造和提高现有菌
株的有机溶剂耐受性提供了新的靶标。因此，利用
现代分子生物学技术创建耐有机溶剂的微生物将成
为工业生物催化剂改造的重要方向。该工作将对促
进绿色高效的生物转化和污染环境的生物修复产生
重要的社会效益和巨大的经济价值。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）