全 文 ：
摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 (SHENGTAI XUEBAO)
摇 摇 第 32 卷 第 14 期摇 摇 2012 年 7 月摇 (半月刊)
目摇 摇 次
海滨沙地砂引草对沙埋的生长和生理适应对策 王摇 进,周瑞莲,赵哈林,等 (4291)……………………………
外源 K+和水杨酸在缓解融雪剂对油松幼苗生长抑制中的效应与机理 张摇 营,李法云,严摇 霞,等 (4300)…
钱塘江中游流域不同空间尺度环境因子对底栖动物群落的影响 张摇 勇,刘朔孺,于海燕,等 (4309)…………
贡嘎山东坡非飞行小型兽类物种多样性的垂直分布格局 吴永杰,杨奇森,夏摇 霖,等 (4318)…………………
基于斑块的红树林空间演变机理分析方法 李春干,刘素青,范航清,等 (4329)…………………………………
亚热带六种天然林树种细根养分异质性 熊德成,黄锦学,杨智杰,等 (4343)……………………………………
浙江省植被 NDVI动态及其对气候的响应 何摇 月,樊高峰,张小伟,等 (4352)…………………………………
亚热带 6 种天然林树种细根呼吸异质性 郑金兴,熊德成,黄锦学,等 (4363)……………………………………
亚高山 /高山森林土壤有机层氨氧化细菌和氨氧化古菌丰度特征 王摇 奥,吴福忠,何振华,等 (4371)………
耕作方式对紫色水稻土轻组有机碳的影响 张军科,江长胜,郝庆菊,等 (4379)…………………………………
火烧对长期封育草地土壤碳固持效应的影响 何念鹏,韩兴国,于贵瑞,等 (4388)………………………………
闽江河口潮汐湿地二氧化碳和甲烷排放化学计量比 王维奇,曾从盛,仝摇 川,等 (4396)………………………
2010 年夏季珠江口海域颗粒有机碳的分布特征及其来源 刘庆霞,黄小平,张摇 霞,等 (4403)………………
新疆冷泉沉积物葡萄糖利用细菌群落多样性的稳定同位素标记分析 楚摇 敏,王摇 芸,曾摇 军,等 (4413)……
土壤微生物群落多样性解析法:从培养到非培养 刘国华,叶正芳,吴为中 (4421)………………………………
伊洛河河岸带生态系统草本植物功能群划分 郭屹立,卢训令,丁圣彦 (4434)…………………………………
濒危植物蒙古扁桃不同地理种群遗传多样性的 ISSR分析 张摇 杰,王摇 佳,李浩宇,等 (4443)………………
强潮区较高纬度移植红树植物秋茄的生理生态特性 郑春芳,仇建标,刘伟成,等 (4453)………………………
冬季高温对白三叶越冬和适应春季“倒春寒冶的影响 周瑞莲,赵摇 梅,王摇 进,等 (4462)……………………
中亚热带细柄阿丁枫和米槠群落细根的生产和死亡动态 黄锦学,凌摇 华,杨智杰,等 (4472)…………………
欧美杨水分利用效率相关基因 PdEPF1 的克隆及表达 郭摇 鹏,金摇 华,尹伟伦,等 (4481)……………………
再力花地下部水浸提液对几种水生植物幼苗的化感作用 缪丽华,王摇 媛,高摇 岩,等 (4488)…………………
无致病力青枯雷尔氏菌对烟草根系土壤微生物脂肪酸生态学特性的影响
郑雪芳,刘摇 波,蓝江林,等 (4496)
………………………………………
……………………………………………………………………………
基于更新和同化策略相结合的遥感信息与水稻生长模型耦合技术的研究
王摇 航,朱摇 艳,马孟莉,等 (4505)
………………………………………
……………………………………………………………………………
温度和体重对克氏双锯鱼仔鱼代谢率的影响 叶摇 乐,杨圣云,刘摇 敏,等 (4516)………………………………
夏季西南印度洋叶绿素 a分布特征 洪丽莎,王春生,周亚东,等 (4525)…………………………………………
大沽排污河生态修复河道水质综合评价及生物毒性影响 王摇 敏,唐景春,朱文英,等 (4535)…………………
李肖叶甲成虫数量及三维空间格局动态 汪文俊,林雪飞,邹运鼎,等 (4544)……………………………………
专论与综述
基于景观格局的城市热岛研究进展 陈爱莲,孙然好 ,陈利顶 (4553)……………………………………………
沉积物质量评价“三元法冶及其在近海中的应用 吴摇 斌,宋金明 ,李学刚,等 (4566)…………………………
问题讨论
中国餐厨垃圾处理的现状、问题和对策 胡新军,张摇 敏,余俊锋,等 (4575)……………………………………
研究简报
稻秸蓝藻混合厌氧发酵沼液及其化学物质对尖孢镰刀菌西瓜专化型生长的影响
刘爱民,徐双锁,蔡摇 欣,等 (4585)
………………………………
……………………………………………………………………………
佛山市农田生态系统的生态损益 叶延琼,章家恩,秦摇 钟,等 (4593)……………………………………………
期刊基本参数:CN 11鄄2031 / Q*1981*m*16*314*zh*P* ￥ 70郾 00*1510*33*
室室室室室室室室室室室室室室
2012鄄07
封面图说: 噶龙山南坡的高山湖泊———喜马拉雅山南坡的嘎龙山光照强烈、雨量充沛,尽管是海拔 4500 多米的高寒地区,山上
的草甸依然泛着诱人的翠绿色,冰川和雪山的融水汇集在山梁的低洼处形成了一个又一个的高山湖泊,由于基底的
差别和水深的不一样,使得纯净清澈的冰雪融水在湖里呈现出不同的颜色,湖面或兰或绿、颜色或深或浅,犹如一块
块通体透明的翡翠镶嵌在绿色的绒布之中。 兰天下面,白云落在山间,通往墨脱的公路像丝带一样随随便便地缠绕
着,一幅美丽的自然生态画卷就这样呈现在你的面前。
彩图提供: 陈建伟教授摇 北京林业大学摇 E鄄mail: cites. chenjw@ 163. com
第 32 卷第 14 期
2012 年 7 月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 32,No. 14
Jul. ,2012
http: / / www. ecologica. cn
基金项目:中国博士后科学基金 (20110490219)
收稿日期:2011鄄06鄄21; 摇 摇 修订日期:2011鄄09鄄28
*通讯作者 Corresponding author. E鄄mail: yezhengfang@ iee. pku. edu. cn
DOI: 10. 5846 / stxb201106210906
刘国华,叶正芳,吴为中.土壤微生物群落多样性解析法:从培养到非培养.生态学报,2012,32(14):4421鄄4433.
Liu G H, Ye Z F, Wu W Z. Culture鄄dependent and culture鄄independent approaches to studying soil microbial diversity. Acta Ecologica Sinica,2012,32
(14):4421鄄4433.
土壤微生物群落多样性解析法:从培养到非培养
刘国华1,叶正芳1,*,吴为中2
(1. 北京大学环境工程系 教育部水沙科学重点实验室,北京摇 100871; 2. 北京大学环境科学系,北京摇 100871)
摘要:土壤微生物群落多样性是土壤微生物生态学和环境科学的重点研究内容之一。 传统的土壤微生物群落多样性解析技术
是指纯培养分离法(平板分离和形态分析法以及群落水平生理学指纹法)。 后来,研究者们建立了多样性评价较为客观的生物
标记法(磷脂脂肪酸法和呼吸醌指纹法)。 随着土壤基因组提取技术和基因片段扩增(PCR)技术的发展,大量的现代分子生物
学技术不断地涌现并极大地推动了土壤微生物群落多样性的研究进程。 这些技术主要包括:G+C%含量、DNA 复性动力学、核
酸杂交法(FISH和 DNA芯片技术)、土壤宏基因组学以及 DNA指纹图谱技术等。 综述了这些技术的基本原理、比较了各种技
术的优缺点并且介绍了他们在土壤微生物群落多样性研究中的应用,展望了这些技术的发展方向。
关键词:土壤微生物多样性;生化技术;分子生物学技术;应用和进展
Culture鄄dependent and culture鄄independent approaches to studying soil microbial
diversity摇
LIU Guohua1, YE Zhengfang1,*, WU Weizhong2
1 The Key Laboratory of Water and Sediment Science, Ministry of Education, Department of Environmental Engineering, Peking University, Yi Heyuan Road
5, Beijing 100871, China
2 Department of Environmental Science, Peking University, Yi Heyuan Road 5, Beijing 100871, China
Abstract: One gram of soil may harbor up to 10 billion microorganisms belonging to possibly more than 104 different
species, most of which play vital roles in various biogeochemical cycles such as the release and fixation of nutrient elements
and decomposition of organic matter. The microbial community is considered to be a functional indicator because changes in
the soil environments in which they live can affect their structure and diversity. Microbial diversity is a growing field of
study in soil science and microbial ecology. Increases in knowledge of soil microbial diversity depend on improvement in the
approaches to its study. Over the last four decades, culture鄄dependent and culture鄄independent technologies have been
developed to assess microbial diversity in soil.
Conventional culture鄄dependent methods such as plate counts, morphology analysis and community level physiological
profiling ( CLPP) provide information on the active heterotrophic component and the functional role of the population.
However, the evaluation of soil microbial diversity based on these methods has been limited to the cultivable cells, amounts
of which are less than 1% of the microorganisms observed under the microscope. To overcome this issue, profiles based on
biochemical components of cell membrane have been used to characterize the soil microbial community. The profiles mainly
include phospholipids fatty acids and respiratory quinines, the structure of which can be used to classify microorganisms.
Since these methods avoid the limits of selective culturing and isolating, they have been considered to be an approach to
http: / / www. ecologica. cn
objectively reflecting soil microbial community diversity.
With improvements in DNA extraction and polymerase chain reaction (PCR) technologies, a number of molecular鄄
based methods, which are more reliable and accurate than the above鄄mentioned methods, have been developed to assess soil
microbial diversity. These approaches include DNA reassociation, guanine + cytosine ( G + C)% content, nucleic acid
hybridization technologies such as fluorescent in situ hybridization (FISH) and DNA microarrays, soil metagenomics based
on cloning and library screening of soil genomic DNA, PCR鄄based genetic fingerprinting such as terminal restriction
fragment length polymorphism ( T鄄RFLP), denaturing / temperature gradient gel electrophoresis ( DGGE / TGGE), single
strand conformation polymorphism ( SSCP) and two鄄dimensional DNA gel electrophoresis(2鄄DGE) with high resolution.
These molecular鄄based technologies can potentially provide excellent insights into diversity information of the cultivable as
well as uncultivable soil microorganisms. Without a doubt, they have opened up novel ways to study soil microbial diversity
in detail, and thus enable us to acquire a better understanding of the relationship between function and diversity of soil
microorganisms. Genetic fingerprinting especially is a very suitable approach to monitoring changes of soil quality through
analyzing temporal and spatial dynamics of microbial diversity.
The culture鄄independent methods do not require the selection of culture media and conditions, and also enable us to
obtain more abundant and accurate information of microbial diversity than the culture鄄dependent methods. However, each
method has its own limitations. Therefore, when applying these methods to the assessment of soil microbial community, a
combination of more than two methods is recommended. This review introduces their principles, advantages and
disadvantages, as well as summarizing their application and progress in studying soil microbial diversity.
Key Words: soil microbial diversity; culture鄄dependent; culture鄄independent technologies; application and progress
土壤中存活着种类极其丰富的微生物,据估算,1g土壤中有数千乃至数万种约数十亿个微生物个体[1鄄5]。
以群落的形式存在于土壤中的微生物不仅是土壤养分和有机质循环和转化的动力[6],而且也影响着土壤的
结构[7]、土壤肥力[8]以及地上植物的健康[9]等。 另外,土壤微生物也是一个相当大的地下能源宝库,世界的
可持续发展以及未来能源问题的解决都离不开土壤微生物。 因此,土壤微生物系统越来越成为当代最前沿的
研究内容之一[10]。 土壤微生物研究中非常重要的研究内容之一就是土壤微生物群落多样性的研究。 通过土
壤微生物多样性的研究不仅可以预测土壤养分和环境质量的变化,而且还可以认识和掌握在土壤微生物生态
中起重要作用的微生物类群和他们的功能角色。
土壤微生物群落多样性主要研究土壤环境中微生物种群的种类、丰度、分布均匀性、结构变化和微生物群
落的功能多样性等。 在过去的 40 多年里,土壤微生物多样性的研究方法已经从传统的培养分离发展到了无
需培养的现代分子生物学技术。 为了更好地了解和把握这些技术和方法,本文将简要地综述他们的原理,优
缺点以及在土壤微生物多样性解析中的应用,并且展望这些技术的发展方向。
1摇 以生化技术为基础的研究方法
这部分主要包括以培养为主的平板计数和形态分析、以检测微生物酶活性的群落水平生理学指纹分析以
及以微生物细胞内生化成分为分析指标的生物标记法。
1. 1摇 平板计数和形态分析
在 20 个世纪 70 年代以前,土壤微生物多样性解析技术主要依靠细胞的培养分离和形态分析[11],即通过
人工配制的简单营养基质对土壤中的微生物进行定时定温培养,然后对生长的菌落进行计数、并通过形态构
造和生理生化特性来鉴定种属。 该方法直观快捷,而且可以提供具有代谢活性、异养类型等种群信息[12]。 然
而,微生物在实际土壤生境中的生长与温度、pH值、养分和种间的相互作用有很大关系,简单的人工模拟环境
是无法满足其生长要求的。 因此,这种方法仅能培养出极少数(少于 1% )的微生物。 Torsvik 等[13]利用染色
法在荧光显微镜下观察到 1 g(干重)土壤中含有 4. 2伊1010 个细菌细胞,而在培养平板上仅有 4. 2伊106 个细菌
2244 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
http: / / www. ecologica. cn
菌落形成(CFU)。
1. 2摇 群落水平生理学指纹(CLPP)或单一碳源利用模式法(SSCU)
这个技术主要是基于某一微生物群落所含有的酶可催化利用特定的碳源基质,然后通过测定其利用能力
和模式来评价微生物种群多样性。 Garlan 和 Mills[14]于 1991 年首次提出该技术,经 BIOLOG公司商业化后在
土壤微生物群落功能多样性的评价研究中得到了广泛的应用[15]。 如, Derry等利用 BIOLOG系统分别研究了
杂酚油污染土壤[16]和北极土壤[17]中微生物的功能多样性和种群结构;李云等[18]利用 BIOLOG生态测试微平
板研究了气候对旱地紫色土微生物功能多样性的长期影响,结果发现中亚热带气候的紫色土壤微生物对含 C
化合物的利用能力强,而暖温带气候的紫色土壤微生物对含 N化合物的利用能力强。 BIOLOG公司根据不同
的检测目的开发了 ECO(生态板)、GP(革兰氏阳性板)、GN(革兰氏阴性板)、FF(丝状真菌板)和 MT 等一系
列微平板。 每个平板上有 96 个微井,其中 95 个微井的干膜上都含有碳源基质和氧化还原染料,一个不含碳
源的微井用作对照。 当微生物利用碳源进行呼吸时释放出的 NADH 还原染料并使其变色,然后通过测定氧
化还原燃料的变色速率来推测微生物的呼吸速率,最终达到评价能利用碳源基质的微生物种类和利用程度的
目的。 MT微平板上只含染料不含基质,允许科研人员自行设计和检测不同的碳源基质。
该方法具有自动化程度高,检测速度快等优点。 然而,BIOLOG 系统仅限于检测那些可培养、能迅速生长
的微生物。 检测结构并不能完全代表原位的代谢多样性。 另外,样本处理、培养条件和微平板应用类型等都
会给微生物多样性评价带来误差[19]。
1. 3摇 生物标记法
生物标记法[20]主要是利用微生物细胞内某种生化成分的结构特点来区别微生物种类。 这种方法避免了
传统培养法的缺陷,能比较客观地评价微生物多样性。 方法的主要步骤是通过提取土壤微生物中的某种生化
成分并纯化,然后利用气、液相色谱等化学手段对该种化学成分进行分类鉴定。 常用的微生物多样性生物标
记法有:磷脂脂肪酸分析法[21鄄22]和呼吸醌指纹法[23鄄24]。
1. 3. 1摇 磷脂脂肪酸(PLFA)分析法
磷脂是所有生物活细胞重要的膜组分。 在正常生理条件下,磷脂中的长链成分———PLFA 在细胞内的含
量一定而且具有生物特异性,故 PLFA 可用作微生物群落分析标记物[25]。 磷脂随着细胞的死亡而很快分
解[26],PLFA总含量可以用来表征活性微生物的生物量。 通过从土壤中提取 PLFA并且测量其种类和丰度来
判断特定微生物种群的存在和丰度,进而揭示土壤微生物种群结构和多样性的变化。 Murata 等[27]分析了大
米土壤中细菌群落多样性和 PLFA的关系后发现,细菌多样性和 PLFA 的量呈比例关系。 Keith鄄Roach 等[28]
的研究表明,温暖的季节可促使盐碱地微生物的 PLFA丰度增加,并且发现一年中好氧细菌是优势菌。 Zhang
等[29]利用 PLFA法分析了不同管理方式对农业土壤微生物的结构和多样性的影响。 结果表明,适度或加强
土壤管理可以提高土壤微生物多样性。 微生物 PLFA 的提取和测定是该分析法的关键所在。 Zelles 等[22]介
绍了 3 种 PLFA提取方法即简单提取法、MIDI(microbial identification systems)系统提取法和扩展提取法。 采
用前两种方法提取 PLFA后产生的脂肪酸谱相似,而且可检测到的 PLFA一般有 20—48 种,最多可达 72 种;
采用扩展提取法提取的 PLFA数量可多达 200—400 种。 PLFA的测定方法经过不断完善,目前主要是采用准
确、方便和快捷的 GC鄄MS方法[27]。
PLFA分析法在描述整个微生物群落结构变化的研究中具有快捷,可靠的优点,然而其分类水平较低,不
能鉴定到微生物种的水平。
1. 3. 2摇 呼吸醌指纹法
呼吸醌是微生物细胞膜的重要组份,也是微生物呼吸链中的一种电子传导体[30]。 它主要包括泛醌
(ubiquinone, UQ) 即辅酶 Q和甲基萘醌 (menaquinone, MK) 即维生素 K两大类。 泛醌广泛存在于革兰氏阴
性细菌的细胞膜上,主要用于微生物的好氧呼吸,甲基萘醌存在于革兰氏阳性细菌和个别革兰氏阴性细菌的
细胞膜上,主要用于微生物的厌氧呼吸。 每种微生物所含的呼吸醌在结构上是特有的,因此根据呼吸醌的测
3244摇 14 期 摇 摇 摇 刘国华摇 等:土壤微生物群落多样性解析法:从培养到非培养 摇
http: / / www. ecologica. cn
量能判断微生物的群落的种类多样性。 并且,在土壤里微生物呼吸醌的含量和和微生物生物量存在线性关
系[31]。 因此,呼吸醌指纹法能评估土壤尤其是被污染土壤微生物成分和生物量的变化。 如,日本的 Katayama
研究组多次使用该方法成功地分析了除草剂[32]、杀虫剂[33]和烃类[34]等有机化合物对土壤微生物群落结构、
成分和多样性的影响,并且认为它是有潜力的土壤微生物群落变化的检测工具。 此方法的主要步骤是首先从
土壤中提出呼吸醌,然后用液相等方法测定呼吸醌的种类,进而推断土壤中微生物种类多样性。 Fujie 等[24]
已经报道了一些呼吸醌和微生物种类的对应关系。 比如,泛醌 Q鄄8,9,10 分别代表了 Proteobacteria 的 琢鄄,茁鄄,
和 酌鄄subclass.
该方法简单方便,然而和磷脂脂肪酸法一样,缺点是分类水平低,无法判断到微生物属或种[35]。
2摇 现代分子生物学技术
为了克服上述方法的分类局限性,科研人员利用微生物细胞内的遗传物质来评估土壤微生物的种类和结
构多样性。 这种从遗传分子的水平来研究微生物群落特点的方法即为现代分子生物学方法。 遗传分子特征
序列主要是核糖体基因序列(rRNA)。 在生物漫长的进化过程中,rRNA分子在碱基组成、核苷酸序列和高级
结构等方面表现出高度的变化和保守性,被喻为生物进化的分子计时钟[36]。 16S rRNA 基因由于分子大小适
中而且拥有相当丰富的数据库等优点已经成为原核微生物分类和进化标记的最常用核糖体操纵子基因,而
18S rRNA基因分子被用来分析真核微生物。 另外,许多特异性蛋白编码基因也常常被用作微生物分析的靶
标分子[37]。 如:用来检测细菌的促旋酶 B 亚单位基因( gyrB)、用来检测氨氧化细菌的氨单加氧酶基因
(amoA)、用来检测反硝化细菌的亚硝酸还原酶(含 Cu)基因(nirK)、用来检测沙门氏菌的沙门氏菌侵袭蛋白
A基因( invA)和用来检测甲烷杆菌属的甲基 coA还原酶基因(mcrA)等。
随着 DNA提取、聚合酶链式反应(PCR)等技术的发展,现代分子生物学技术被逐步建立和改进,为土壤
微生物群落多样性的研究带来了良好的契机。 自 20 世纪 70 年代以后,国外就已经建立了各种分子微生物生
态学研究机制。 这些机制主要包括:(1)基于 DNA 热变性后同源单链发生重组行为的核酸复性动力学和基
于 DNA序列成分不同的 G+C%含量法。 (2)基于核酸的碱基配对原则,用特异性的 DNA 探针与待测样品的
DNA(RNA)杂交或者直接进行原位杂交( in situ)形成杂合分子,然后由仪器检测杂交后的信号并定量。 (3)
以基因组学技术为依托,将从环境样品中直接提取的 DNA克隆到合适的载体中,然后将载体转化到宿主细菌
建立环境基因组文库,对得到的环境基因组文库再进行功能基因筛选和基因测序等。 (4)以检测基因组中
DNA多态性为目的而开发出了许多 DNA指纹图谱技术。
2. 1摇 核酸复性动力学技术和 G+C%含量法(G+C% content)
核酸复性动力学技术是一个被用来测量微生物基因复杂程度的方法,它已经被用于评价土壤微生物的多
样性[38]。 如,Torsvik等[2鄄3]用核酸复性动力学的方法很好地估计了土壤当中的细菌多样性,并且发现 1 g 干
燥的土壤中含有大约 4000 个完全不同的染色体基因单位。 该方法的步骤是总 DNA 被从土壤中提取、纯化、
变性解链和再复合。 通常,再复合的程度取决于微生物多样性大小。 在特定条件下,半数 DNA发生复性时的
C0t1 / 2(C0 为核苷酸浓度)值与总 DNA的复杂度即微生物多样性的复杂度成正比。 因此,C0t1 / 2 可被作为一
个指标来评价土壤微生物的多样性。 该方法的优点是不受 PCR扩增偏差的影响,可是受基因拷贝数的影响,
即由于大部分土壤细菌的拷贝数很低故利用此法检测土壤微生物多样性时缺乏灵敏度。
G+C%含量法是基于 DNA链上 G+C%含量的不同来评价土壤微生物多样性。 N俟sslein等[39]利用 G+C%
含量法研究了不同植被覆盖下土壤细菌群落的多样性并且发现,森林和草地两种植被对土壤细菌群落的成分
和结构有很大影响。 该法主要利用二苯丙咪唑与 DNA链上 A+T 碱基对结合,放大了不同基因之间 G+C%含
量的差别,进而通过 DNA分子质量差异离心产生不同 DNA 的 G+C%含量分布图谱。 该法也是不受 PCR 扩
增偏差的影响而且能使分类鉴定达到属的水平,然而也同样需要大量 DNA样品,而且不同种类的微生物可能
拥有同样的 G+C%含量,是一种粗略的方法。
2. 2摇 核酸杂交技术
核酸杂交技术是将已知微生物基因序列作为特异探针,与从样品中提取的 DNA 或者 RNA 进行杂交,然
4244 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
http: / / www. ecologica. cn
后通过杂交信号的检测和分析来判断土壤微生物多样性。 这是一种既能定性又能定量地进行土壤微生物多
样性解析的分子生物学工具[40鄄41]。
2. 2. 1摇 原位杂交(In situ hybridization, ISH)技术
对于土壤微生物多样性研究而言,细胞水平的原位杂交可能更具有实际应用价值。 比如,利用探针可以
直接和环境土壤样品、纯培养菌落进行原位杂交,获得自然和人工状态下微生物种类、相对丰度和空间分布信
息[42鄄43]。 Delon等[44]于 1989 年首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。 由于安全、灵敏和简
便等特点,荧光原位杂交技术(FISH)已经被广泛地用来研究土壤微生物多样性。 如,Llobet鄄Brossa 等[45]用荧
光标记的 rRNA探针和海底底质土壤微生物细胞进行原位杂交后发现,73%以上被 DAPI 染色的细胞能被杂
交,总细胞数的 45%能被鉴定到细菌门,而且还发现噬胞菌属(Cytophaga)和黄杆菌属(Flavobacterium)丰度
最高,其次是硫酸还原菌。 Liebner等[46]通过 FISH法发现永久冻土中存在极其多样的细菌群落,并且观察到
拟杆菌(Bacteroidetes)和放线菌(Actinobacteria)是优势菌群。 原位杂交要求土壤微生物基因必须有很高的拷
贝数,否则那些非优势微生物很难被检测出来。 然而,原位 PCR 技术的开发使核酸杂交技术克服了上述问
题,通过在细胞内扩增目标基因片断然后用特异探针进行杂交可以更加准确地评价土壤微生物多样性。
2. 2. 2摇 基因芯片技术
基因芯片(DNA chip),又称 DNA微阵列(DNA microarrays),是核酸杂交技术家族中的另一重要成员,是
将成千上万个已知序列的探针分子按照特定的排列方式固定在固相载体(玻片,硅片等)上所组成的微点阵
阵列。 经过标记的靶核苷酸序列与基因芯片特定位点上的探针进行杂交,然后通过检测杂交信号定性和定量
地判断样品中的靶序列分子[47鄄48]。 自从 Fodor 等人于 1991 年报道了应用光刻技术制作 DNA 芯片的技术以
来[49],具有不同功能的基因芯片的研究和商业化得到了快速的发展。 目前,用于土壤微生物生态研究的基因
芯片技术主要有 3 种类型[50]:(1)群落基因组芯片(community genome array,CGAs);(2)系统寡核苷酸芯片
(phylogenetic oligonucleotide arrays,POAs);(3)功能基因芯片( functional gene arrays,FGAs)。 CGAs 和 POAs
芯片最合适用来分析复杂的土壤环境中微生物的种群结构和多样性变化以及种群间的系统发育关系,而
FGAs芯片适合用来描述土壤环境中那些具有特殊功能的微生物(如,硝酸盐还原菌、固氮菌和硫酸还原菌
等) [51]。 Wu等[52]建立了一个用于检测特定微生物种群的全基因组芯片,该芯片具有特异性高,敏感性强(0.
2 ng DNA)的特点,而且可以根据调节杂交温度鉴定到细菌种或株的水平。 作者利用该芯片成功地分析了土
壤、海洋和河流沉积物之间的微生物群落结构差异。 Yergeau等[53]利用含有 8741 个细菌和古菌 16S rDNA探
针的 POAs芯片,研究了不同的南极土壤微生物的群落多样性。 结果显示了微生物多样性随着纬度的增高而
明显地减小,也证明了在检测微生物多样性的广泛性时基因芯片技术比基于 PCR 的 16SrRNA 基因克隆库更
敏感。 Liang等[54]利用 FGAs芯片评价了用臭氧氧化和生物方法联合处理原油污染土壤过程中,细菌功能基
因的变化,即在臭氧作用后,微生物的功能基因多样性有所降低,然而在生物处理后,那些主要的具有碳氮硫
等循环功能的功能基因数量却有所回升。
尽管核酸杂交技术对于那些特殊的土壤微生物的鉴定非常有效,但是由于目前我们还无法得到所有土壤
微生物的探针序列,故该方法不适宜检测总土壤微生物多样性。
2. 3摇 土壤宏基因组学
Handelsman等[55]于 1998 年首次提出宏基因组学的概念,即不需要经过培养、分离单一种类的微生物,而
是利用现代基因组技术直接研究自然状态中环境微生物群落。 土壤宏基因组学的主要任务之一就是揭示土
壤微生物群落多样性[56]。 通过 16S rRNA基因(或其他标记基因如 amoA 等)文库的构建和系统化分析来研
究土壤微生物群落种类和存在丰度,并且挖掘有用的基因,使土壤微生物多样性分析更趋于完整客观[57]。 该
方法的步骤主要包括土壤 DNA的提取克隆文库的构建和筛选[58]。
(1)DNA提取摇 DNA提取是现代分子生物学方法的基础和关键,提取方法会影响所构建文库的代表性。
DNA提取方法大致分为两类,即直接细胞溶解法(直接从土壤细胞中提取 DNA) [59]和间接细胞溶解法(先从
5244摇 14 期 摇 摇 摇 刘国华摇 等:土壤微生物群落多样性解析法:从培养到非培养 摇
http: / / www. ecologica. cn
土壤中分离细胞,再从细胞中提取 DNA) [60]。 直接法比间接法简便、且能获得更多 DNA[61], 但是间接法能获
得更大更纯的基因片断[62]。 细胞的溶解通常采用多种方式相结合的策略,如用酶 (如, lysozyme 或
proteonaseK)、高温、界面活性剂(如,SDS)和机械破碎法(beads beating)同时处理土壤细胞。 在土壤宏基因组
学中,采用什么样的 DNA提取方法取决于土壤性质特点和研究目的。
(2)文库的构建摇 根据插入载体的片断大小,宏基因组文库一般能被分为两种,即插入质粒载体的小片
断基因文库和插入人工染色体(BAC)或粘粒(cosmid)的大片段基因文库。 小片断文库(<15 kb)适宜于单个
基因或具有新的代谢功能的小操纵子基因的筛选[63鄄64]。 大片段文库(>40 kb)适宜于分析那些不可培养微生
物的基因组[65鄄66]。
(3)文库筛选摇 高度复杂的土壤元基因组要求文库的筛选方法具有高通量和高灵敏度的能力。 目前,筛
选技术主要包括功能驱动筛选[67]、序列驱动筛选[68]和底物诱导基因表达筛选[69]等。
土壤宏基因组学为土壤微生物群落结构和多样性,特别是对那些土壤功能微生物的分析提供了很好的技
术平台。 Rondon等[70]采用 BAC载体构建了两个大片段土壤宏基因组文库(>1Gbp of DNA),对文库进行 16S
rDNA 系统发育学分析后发现,文库中的 DNA代表了不同的细菌门(如,低 G+C 百分含量细菌,Acidobacterium,
Cytophagales, and Proteobacteria),揭示了该土壤样品中有很高的微生物多样性。 德国 Schleper 研究室的研究
者们通过大插入片段文库的构建和鉴定,第一次报道了在草地土壤基因组中酸杆菌门的基因组成分和多样
性[71],通过构建 3 个大片断 Fosmid基因文库,分析了沙地生态和森林土壤中古细菌的多样性[72]。
然而,这个技术对所构建文库的质量和文库筛选方法的要求比较高,而且工作量大,不适合用来分析不同
土壤环境中微生物多样性的时空动态变化和监测。
2. 4摇 基因指纹图谱技术
基因指纹图谱技术是基于基因在长度、成分和结构上的多态性,利用电泳方法将复杂的 PCR扩增片断分
离成简单的基因条带图谱,然后根据条带信息进行基因分析的技术。 一般地,每个条带代表一种不同的可操
作分类单位(operational taxonomy unit,OTU),条带的数量可反映土壤环境微生物群落中优势类群的种类,而
亮度可以反映微生物种群的相对丰度。 由于具有操作简便以及可同时分析多个样品的优点,这个技术已经被
广泛地用于土壤微生物群落结构和多样性评价以及他们的动态监测。 指纹图谱技术在土壤微生物多样性研
究中的主要步骤包括土壤总核酸(DNA或 RNA)提取、PCR(或 RT鄄PCR)扩增、电泳分离和统计分析。 目前,
指纹图谱技术主要有以下几种类型。
2. 4. 1摇 DNA长度多态性图谱分析
DNA长度多态图谱分析主要用于检测土壤微生物基因片断的长度多态性。 DNA长度多态片断常常通过
限制性酶切的方法产生,因此也被称为限制性片断长度多态( restriction fragment length polymorphism,RFLP)
和末端限制性片断长度多态(terminal restriction fragment length polymorphism,T鄄RFLP)。 这两个方法的原理相
同,均是利用无变性的琼脂或者聚丙烯酸凝胶对限制性酶切片断进行电泳分离,不同长度的 DNA片断会停留
在不同的凝胶位置上,最后形成长度多态图谱。 T鄄RFLP 是 RFLP 的发展,克服了 RFLP 图谱复杂的缺点,即
在 PCR 扩增的过程中,一个引物被用荧光标记,当进行片断分析时,只针对那些末端带有荧光标记的产物。
因此,T鄄RFLP 简化了 RFLP 的条带图谱,能够更加准确地反映土壤微生物多样性[73]。 由于核糖体 DNA 常常
被用来作为基因标记,故 RFLP 也通常被称为扩增核糖体 DNA 限制分析(amplified ribosomal DNA restriction
analysis,ARDRA)。 限制性酶的应用是这些方法的关键,2—4种酶通常被同时用来产生不同长度的土壤 DNA
片断。 对于各种土壤微生物多样性的动态变化检测,这 3 个方法是非常方便的。 T鄄RFLP 技术自 1997 年被
Liu等[74]首次将应用于土壤微生物多样性的研究以来,已经被广泛地用来研究各种土壤中的微生物群落结构
和多样性变化[75鄄76]。 王英等[77]利用 ARDRA和 RFLP 技术对免耕水稻土壤中细菌的多样性和空间分布分析
后发现,细菌种类非常丰富,而且在不同层的土壤中细菌的多样性存在差异。 然而,一条 RFLP (T鄄RFLP /
ARDRA)条带可能代表几种微生物种类,容易给微生物多样性评价带来误差。
6244 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
http: / / www. ecologica. cn
另外,核糖体间隔区分析( ribosomal intergenic spacer analysis,RISA) 和随机扩增多态性 DNA( random
amplified polymorphic DNA, RAPD)也是长度多态性图谱家族中的成员,常被用来研究土壤微生物多样
性[78鄄79]。 RISA以原核生物 16S和 23S rDNA间隔片断为研究对象,根据 rDNA大小转录单元间的长度多态性
揭示土壤环境中微生物多样性。 RAPD方法利用单个人工合成的随机多态核苷酸序列(通常 10 bp)为引物,
在一定的 PCR条件下(低退火温度)对土壤基因组 DNA进行随机扩增,产物被电泳分离后产生长度多态性指
纹图谱。
2. 4. 2摇 DNA 成分多态性图谱分析
DNA 成分多态性图谱分析是用来分离那些 DNA分子长度相同,碱基序列成分不同的 PCR扩增产物。 该
技术主要包括变性剂浓度梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、温度梯度凝胶电泳
(temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)和时间温度梯度凝胶电泳( temporal temperature gradient gel
electrophoresis, TTGE)。 这些电泳技术的原理是相似的,即通过使双链 DNA在化学变性剂或者温度形成线性
梯度的环境下部分熔解变性成单链,然后根据不同序列的 DNA在聚丙烯酸凝胶上移动速度的差异而将其分
离成条带图谱。 DGGE技术最初被用于检测人类基因的点突变,自 Muyzer 等[80]将其首次应用于微生物基因
多样性的研究以来,已经被广泛应用于土壤等环境微生物群落结构和多样性的评价[81鄄86]。 为了提高 DNA 片
断的分离效率,在 PCR扩增土壤基因组时,PCR 引物的一端常常被加上一个约 30—40 个碱基的 GC 夹子以
保证扩增产物在被凝胶电泳分离时,不至于将双链 DNA完全熔解成单链。 理论上,DGGE 可以分离仅有 1 bp
碱基差异的 DNA片断,然而对于超过 500 bp的 DNA片断,DGGE的分离灵敏度会降低[87]。
TGGE和 TTGE都是在 DGGE的基础上开发出来的,尽管都是采用温度梯度,但是凝胶的变性环境的形
成过程却不一样。 在 TGGE方法中,从凝胶的上端到下端有一个固定的温度梯度[88],而在 TTGE 中,温度是
在电泳的过程中以一定的速率缓慢地增加的。 在实际执行这两个方法时,TTGE 更容易被达到,而且由于能
够提供更宽的分离范围,故分离灵敏度更高[89鄄90]。
2. 4. 3摇 DNA 单链构象多态性图谱分析
DNA单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)是另一个重要的指纹图谱技术。 它
是一种基于单链 DNA的构象差异来分离 DNA片断的方法。 理论上,当 DNA 分子链上的一个碱基发生改变
时,单链 DNA的空间折叠构象就会发生改变,这些空间构象有差异的单链 DNA 在非变性聚丙烯酰胺凝胶中
电泳时会产生不同的迁移率,从而可以在凝胶上产生单链 DNA 条带图谱。 和 DGGE 一样,SSCP 最初也是被
于来检测碱基点突变和已知小分子基因序列变化[91]。 该技术对 300 bp的 DNA片断中的单碱基突变,可以达
到 90%以上的检出率。 有时为了提高单链 DNA的分离效率,往往在聚丙烯酰胺凝胶中加入化学交联剂如甘
油或聚乙二醇(PEG) [92]。 该技术的优点是无需 DNA 片断带 GC 夹和凝胶变性梯度的建设,故操作相对简
便,已经被广泛地应用于土壤微生物群落分析。 Schwieger 等[93]首次证明 SSCP 在土壤微生物多样性的研究
中具有应用潜力。 而后,Kleinsteuber等[94]利用 SSCP 技术分析了不同盐度(0, 7. 5, 15 和 20)的柴油污染土
壤中优势菌群结构的变化。 Smalla 等[95]利用包括 SSCP 在内的 3 种 DNA 指纹技术(另两种是 DGGE 和 T鄄
RFLP)考察了 4 种可耕种土壤中的细菌群落,结果发现, 菌群结构与土壤的理化性质相关,对于同一类土壤,
3 种方法可产生相似的细菌群落多样性结果。 Vivas 等[96]通过 PCR鄄SSCP 分析发现,在被烃类污染最严重的
土壤中 PAH降解基因的多样性是最大的。 然而,SSCP 的重现性较差,易受电泳温度(4—16益)和凝胶浓度
等条件的影响,对于 300 bp以上的 DNA序列,分离效率低下。
2. 4. 4摇 DNA双向(2鄄D)图谱分析
DNA双向(2鄄D)图谱技术是一种具有高分辨率的新型基因指纹图谱技术。 该技术主要以 DNA序列在长
度、成分和空间构象 3 种多态性参数中的任何两个为 DNA 片断分离依据,对复杂的土壤基因组进行分离鉴
定[97]。 DNA双向图谱技术的概念最早由 Fischer 和 Lerman[98]于 1983 年提出,目的是用来检测基因的点突
变。 近年,该技术已经渐渐地被用来详细地分离土壤等环境基因组,以至于使我们对环境基因组有更好的认
7244摇 14 期 摇 摇 摇 刘国华摇 等:土壤微生物群落多样性解析法:从培养到非培养 摇
http: / / www. ecologica. cn
识和把握。 Isshi等[99]于 2006 年利用 16S rRNA基因在 V1 高度变化区域的自然多态性(长度和成分)开发了
一个新的高分辨率 2鄄D 基因图谱技术。 后来,Liu 等[100鄄102]将此技术成功地应用于土壤微生物群落结构多样
性的研究,并且发展建立了两个不同的 2鄄D基因图谱技术[97]。 另外,Jones and Thies[103]也建立了可以用来详
细分离土壤微生物核糖体基因的转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)片断的 2鄄D技术。
2鄄D技术的主要特点是具有基因高分辨率,那些利用常规的 DGGE、T鄄RFLP 和 SSCP 等一维方法无法分
开的基因片断,利用 2鄄D 技术便能将其很好地分开。 李刚等研究者[104]具体比较了 RISA、DGGE 和 2鄄D 方法
在分析大豆根际土壤细菌多样性时的不同,结果表明 2鄄D方法能够获得更多的土壤细菌多样性信息。 如果对
图谱中的信号进行剪切并鉴定分析时,具有高分辨率特点的 2鄄D技术可以简化克隆文库中的基因种类,并利
用 2鄄D参数可以排除那些由于 PCR的错误扩增产生的序列和假阳性克隆体基因序列,从而确定正确的基因
扩增序列来准确地鉴定土壤微生物种类[102]。
然而,由于基因 2鄄D图谱技术尚处于发展期,而且还受仪器装置的限制,目前还不适宜同时分析比较大量
的土壤样品。 随着技术的发展,2鄄D技术在土壤等环境微生物群落结构多样性的分析中将发挥更大的作用。
3摇 土壤微生物多样性研究方法的应用策略
如前所述,现有的每一种技术都有其局限性。 因此,任何一种方法都无法全面地解决土壤微生物群落结
构和多样性。 在实际应用中,研究人员往往根据自己的研究目的利用多种方法组合的策略减少误差,以获得
更准确的信息。 Ellis等[105]利用培养和非培养的方法研究了重金属污染对可培养和不可培养土壤微生物多
样性的影响。 结果发现,各种污染土壤的总基因组的 DGGE 图谱非常相似,而每种土壤的可培养细菌基因的
DGGE图谱却显示出了很大的不同。 因此,作者们认为,对于评价重金属对土壤微生物多样性的影响研究而
言,培养的方法可能更准确。 Enwall等[106]利用 T鄄RFLP 和 DGGE的方法评价了农业土壤中脱氮菌群的组成。
结果发现,DGGE 比 T鄄RFLP 有更高的解析度,更适合区别样本的不同。 Rosenberg 等[107]利用 FISH 和 DGGE
研究了土壤变形虫对阿拉伯芥根圈细菌群落的影响,第一次全面地阐明了原生动物是如何迅速地使根圈细菌
群落发生改变的。 Voget等[108]通过联合培养方法和土壤宏基因组学筛选的策略迅速鉴定出多个已知和新的
编码生物催化剂基因,表明了土壤微生物具有高度多样性。
4摇 土壤微生物群落多样性解析技术发展方向的展望
土壤微生物群落多样性研究对于人类理解整个生物圈的物质循环和能量流通、认识微生物在土壤生态系
统中的功能、挖掘有用的土壤微生物资源以及保护土壤生物多样性方面有着非常重要的意义。 今后,土壤微
生物多样性解析技术主要从以下几个方向发展。
(1)开发新的培养技术摇 尽管培养技术被严格的培养条件所限制,仅能培养土壤中小部分的微生物,但
是它在菌株水平(如高效产酶菌株的筛选和定性等)的研究上是非常重要的,是其它技术无法代替的。 另外,
培养方法可以为微生物种群分子分类积累大量的数据,为生物标记法或分子生物学方法提供可靠的参照标
准。 因此,培养方法在微生物多样性的研究中仍然是很重要的,需要开发新的技术来培养那些在过去认为
“不可培养冶的微生物。 Kaeberlein等[109]认为,尽管有充足的营养,有些微生物在一个不熟悉的环境中是不生
长的。 他们采用了一个模拟自然环境的扩散装置培养出一些在人工的灭菌培养基上不可培养出来的海洋微
生物。 Joseph等[110]利用一个简易的固体培养基(装在一个灭菌碟子里)从土壤中培养分离出了 350 个细菌
个体(属于 9 个细菌门和 60 个细菌科),经过 16S rRNA基因分类学比较发现,93 个细菌个体(属于 20 个未命
名的细菌科)是所谓的不可培养细菌。
(2)进一步发展分子生物学技术摇 分子生物学技术,特别是以基因为研究目标的现代分子生物学技术为
土壤微生物多样性的研究提供了强有力的工具。 然而,许多比较流行而且非常有潜力的方法还有待进一步改
善。 比如,土壤宏基因组学在阐明土壤微生物多样性和功能关系、开发微生物资源多样性、筛选新型活性物质
以及发掘有机物高效降解基因的研究方面有着广阔的应用前景。 然而,由于该方法工作量大且对 DNA 质量
和宿主细胞的要求和选择性比较高,往往在实际应用中小范围或者某个个体研究者很难完成或者深入进行这
8244 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
http: / / www. ecologica. cn
方面的工作。 因此,在今后需要这方面的专家统一、整合以及标准化研究方案以方便研究人员使用[57]。 再
如,基因芯片技术除了需要在高密度和微量化方面进一步发展外,不同基因与探针之间的错配等技术性问题
也有待改善。 另外,一种新型的芯片技术即宏基因组芯片[111]是一种将芯片和宏基因组技术结合起来的新技
术,该技术无需分离培养菌株、无需了解菌群的基因序列,它的探针来源于环境 DNA 的宏基因组文库,因此,
对于大部分基因属于未知基因的土壤环境而言,该技术具有实际应用价值,需要进一步发展。
(3)多种技术的有机结合摇 要实现全面,准确的土壤微生物多样性评价,任何一种单一的技术都无法完
成。 比如,大部分土壤微生物是不易被目前的纯培养技术培养的。 然而,尽管现代分子生物学技术可以克服
不可培养的困难,但是它无法在菌株水平上对土壤微生物进行研究。 因此,快速、准确以及全面的土壤微生物
多样性研究需要多种方法的有机结合来完成。
References:
[ 1 ]摇 Pace N R. A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science, 1997, 276(5313): 734鄄740.
[ 2 ] 摇 Torsvik V, Goks覬yr J, Daae F L. High diversity in DNA of soil bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 1990, 56(3): 782鄄787.
[ 3 ] 摇 Torsvik V, Salte K, S覬rheim R, Goks覬yr J. Comparison of phenotypic diversity and DNA heterogeneity in a population of soil bacteria. Applied and
Environmental Microbiology, 1990, 56(3): 776鄄781.
[ 4 ] 摇 Rosell佼鄄Mora R, Amann R. The species concept for prokaryotes. FEMS Microbiology Review, 2001, 25(1): 39鄄67.
[ 5 ] 摇 Gans J, Wolinsky M, Dunbar J. Computational improvements reveal great bacterial diversity and high metal toxicity in soil. Science, 2005, 309
(5739): 1387鄄1390.
[ 6 ] 摇 Yao K Y, Huang C Y. Soil Microbial Ecology and Experiment Technology. Beijing: Science Press, 2006, 7鄄17.
[ 7 ] 摇 Dodd J C, Boddington C L, Rodriguez A, Gonzalez鄄Chavez C, Mansur I. Mycelium of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) from different genera:
form, function and detection. Plant and Soil, 2000, 226(2): 131鄄151.
[ 8 ] 摇 O忆Donnell A G, Seasman M, Macrae A, Waite I, Davies J T. Plants and fertilisers as drivers of change in microbial community structure and
function in soils. Plant and Soil, 2001, 232(1 / 2): 135鄄145.
[ 9 ] 摇 Smith K P, Goodman R M. Host variation for interactions with beneficial plant鄄associated microbes. Annual Review of Phytopathology, 1999, 37
(1): 473鄄491.
[10] 摇 Curtis T P, Sloan W T. Exploring microbial diversity鄄A vast below. Science, 2005, 309(5739): 1331鄄1333.
[11] 摇 Jensen V. The plate count technique椅Gray T R G, Parkinson D, eds. The Ecology of Soil Bacteria. Liverpool: Liverpool University Press, 1968:
158鄄170.
[12] 摇 Kirk J L, Beaudette L A, Hart M, Moutoglis P, Klironomos J N, Leea H, Trevors J T. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of
Microbiological Methods, 2004, 58(2): 169鄄188.
[13] 摇 Torsvik V, 覫vre覽s L. Microbial diversity and function in soil: from genes to ecosystems. Current Opinion in Microbiology, 2002, 5 (3 ):
2402鄄2451.
[14] 摇 Garland J L, Mills A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community鄄level鄄sole鄄
carbon鄄source utilization. Applied and Environmental Microbiology, 1991, 57(8): 2351鄄2359.
[15] 摇 Zheng H, Ouyang Z Y, Fang Z G, Zhao T Q. Application of BIOLOG to study on soil microbial community functional diversity. Acta Pedologica
Sinica, 2004, 41(3): 456鄄461.
[16] 摇 Derry A M, Staddon W J, Trevors J T. Functional diversity and community structure of microorganisms in uncontaminated and creosote鄄
contaminated soils as determined by solecarbon鄄 source鄄utilization. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1998, 14(4): 571鄄578.
[17] 摇 Derry A M, Staddon W J, Kevan P G, Trevors J T. Functional diversity and community structure of micro鄄organisms in three arctic soils as
determined by sole鄄carbon鄄source鄄utilization. Biodiversity and Conservation, 1999, 8(2): 205鄄221.
[18] 摇 Li Y, Sun B, Li Z P. Long鄄term effect of climate condition on soil microbial diversity of purple soil upland. Soils, 2009, 41(2): 230鄄235.
[19] 摇 Preston鄄Mafham J, Boddy L, Randerson P F. Analysis of microbial community functional diversity using sole鄄carbon鄄source utilization profiles鄄a
critique. FEMS Microbiology Ecology, 2002, 42(1): 1鄄14.
[20] 摇 Morgan J A, Winstanley C. Microbial biomarkers椅van Elsas J D, Trevors J T, Wellington E M, eds. Modern Soil Microbiology. New York:
Dekker, 1997: 331鄄352.
[21] 摇 Findlay R. The use of phospholipid fatty acids to determine microbial community structure椅Akkermanns A D L, Elsas J D, van de Bruijn F, eds.
Molecular Microbial Ecology Manual. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1996: 1鄄17.
9244摇 14 期 摇 摇 摇 刘国华摇 等:土壤微生物群落多样性解析法:从培养到非培养 摇
http: / / www. ecologica. cn
[22]摇 Zelles L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and
Fertility of Soils, 1999, 29(2): 111鄄129.
[23] 摇 Hiraishi A. Respiratory quinone profiles as tools for identifying different bacterial populations in activated sludge. The Journal of General and
Applied Microbiology, 1988, 34(1): 39鄄56.
[24] 摇 Fujie K, Hu H Y, Tanaka H, Urano K, Saitou K, Katayama A. Analysis of respiratory quinones in soil for characterization of microbiota. Soil
Science and Plant Nutrition, 1998, 44(3): 393鄄404.
[25] 摇 Petersen S O, Klug M J. Effects of sieving, storage, and incubation temperature on the phospholipid fatty acid profile of a soil microbial
community. Applied and Environmental Microbiology, 1994, 60(7): 2421鄄2430.
[26] 摇 Vestal J R, White D C. Lipid analysis in microbial ecology: quantitative approaches to the study of microbial communities. Bioscience, 1989, 39
(8): 535鄄541.
[27] 摇 Murata T, Takagi K, Yokoyama K. Relationship between soil bacterial community structure based on composition of fatty acid methyl esters and the
amount of bacterial biomass in Japanese lowland rice fields. Soil Biology and Biochemistry, 2002, 34(6): 885鄄888.
[28] 摇 Keith鄄Roach M J, Bryan N D, Bardgett R D, Livens F R. Seasonal changes in the microbial community of a salt marsh, measured by phospholipid
fatty acid analysis. Biogeochemistry, 2002, 60(1): 77鄄96
[29] 摇 Zhang W J, Rui W Y, Tu C, Diab H G, Mueller J P, Creamer N, Bell M, wager M G, Hu S. Responses of soil microbial community structure
and diversity to agricultural deintensification. Pedosphere, 2005, 15(4): 440鄄447.
[30] 摇 Hu H Y, Tong Z H. Bacterial quinone profile for the study of microbial community structure in environmental samples. Microbiology, 2002, 29
(4): 95鄄98.
[31] 摇 Saitou K, Nagasaki K, Yamakawa H, Hu H Y, Fujie K, Katayama A, Hu H Y. Linear relation between the amount of respiratory quinones and the
microbial biomass in soil. Soil Science and Plant Nutrition, 1999, 45(3): 775鄄778.
[32] 摇 Uchida S, Tanaka H, Fujie K, Katayama A. Changes in microbial community structure in soil percolated with pentachlorophenol with reference to
respiratory quinone profile. Journal of Pesticide Science, 1999, 24(2): 186鄄188.
[33] 摇 Katayama A, Funasaka K, Fujie K. Changes in the respiratory quinone profile of a soil treated with pesticides. Biology and Fertility of Soils, 2001,
33(6): 454鄄459.
[34] 摇 Song D J, Katayama A. Monitoring microbial community in a subsurface soil contaminated with hydrocarbons by quinone profile. Chemosphere,
2005, 59(3): 305鄄314.
[35] 摇 Villanueva L, del Campo J, Guerrero R, Geyer R. Intact phospholipid and quinone biomarkers to assess microbial diversity and redox state in
microbial mats. Microbial Ecology, 2010, 60(1): 226鄄238.
[36] 摇 Woese C R. Bacterial evolution. Microbiological Reviews, 1987, 51(2): 221鄄271.
[37] 摇 Zhong W H, Wang W, Lin X G, Yin R, Shen W S. Application of nucleic acid鄄based methods in the study of soil microbial diversity. Acta
Pedologica Sinica, 2009, 46(2): 334鄄341.
[38] 摇 Torsvik V, Sorheim R, Goksoyr J. Total bacterial diversity in soil and sediment communities鄄a review. Journal of Industrial Microbiology and
Biotechnology, 1996, 17(3): 170鄄178.
[39] 摇 N俟sslein K, Tiedje J M. Soil bacterial community shift correlated with change from forest to pasture vegetation in a tropical soil. Applied and
Environmental Microbiology, 1999, 65(8): 3622鄄3626.
[40] 摇 Clegg C D, Ritz K, Griffiths B S. % G+C profiling and cross hybridisation of microbial DNA reveals great variation in below鄄ground community
structure in UK upland grasslands. Applied Soil Ecology, 2000, 14(2): 125鄄134.
[41] 摇 Theron J, Cloete T E. Molecular techniques for determining microbial diversity and community structure in natural environments. Critical Reviews
in Microbiology, 2000, 26(1): 37鄄57.
[42] 摇 Moter A, G觟bel U B. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. Journal of Microbiological Methods,
2000, 41(2): 85鄄112.
[43] 摇 Schramm A, Larsen L H, Revsbech N P, Ramsing N B, Amann R, Schleifer K H. Structure and function of a nitrifying biofilm as determined by
in situ hybridization and the use of microelectrodes. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(12): 4641鄄4647.
[44] 摇 DeLong E F, Wiekham G S, Pace N R. Phylogenatic stains: ribosomal RNA鄄based probes for the identification of single cells. Science, 1989, 243
(4896): 1360鄄1363.
[45] 摇 Llobet鄄Brossa E, Rossell佼鄄Mora R, Amann R. Microbial community composition of Wadden sea sediments as revealed by fluorescence in situ
hybridization. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(7): 2691鄄2696.
[46] 摇 Liebner S, Harder J, Wagner D. Bacterial diversity and community structure in polygonal tundra soils from Samoylov Island, Lena Delta, Siberia.
International Microbiology, 2008, 11(3): 195鄄202.
0344 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
http: / / www. ecologica. cn
[47]摇 Ye R W, Wang T, Bedzyk L, Croker K M. Applications of DNA microarrays in microbial systems. Journal of Microbiological Methods, 2001, 47
(3): 257鄄272.
[48] 摇 Zhou J Z, Thompson D K. Challenges in applying microarrays to environmental studies. Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13 (3):
204鄄207.
[49] 摇 Fodor S P, Read J L, Pirrung M C, Stryer L, Lu A T, Solas D. Light鄄directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science, 1991,
251(4995): 767鄄773.
[50] 摇 Zhou J Z. Microarrays for bacterial detection and microbial community analysis. Current Opinion in Microbiology, 2003, 6(3): 288鄄294.
[51] 摇 McGrath K C, Mondav R, Sintrajaya R, Slattery B, Schmidt S, Schenk P M. Development of an environmental functional gene microarray for soil
microbial communities. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(21): 7161鄄7170.
[52] 摇 Wu L Y, Thompson D K, Liu X D, Fields M W, Bagwell C E, Tiedje J M, Zhou J Z. Development and evaluation of microarray鄄based whole鄄
genome hybridization for detection of microorganisms within the context of environmental applications. Environmental Science and Technology,
2004, 38(24): 6775鄄6782.
[53] 摇 Yergeau E, Schoondermark鄄Stolk S A, Brodie E L, D佴jean S, DeSantis T Z, Gon觭alves O, Piceno Y M, Andersen G L, Kowalchuk G A.
Environmental microarray analyses of Antarctic soil microbial communities. The ISME Journal, 2009, 3(3): 340鄄351.
[54] 摇 Liang Y T, van Nostrand J D, Wang J, Zhang X, Zhou J Z, Li G H. Microarray鄄based functional gene analysis of soil microbial communities
during ozonation and biodegradation of crude oil. Chemosphere, 2009, 75(2): 193鄄199.
[55] 摇 Handelsman J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2004, 68(4):
669鄄685.
[56] 摇 Niu X G, Han M, Han X R. Metagenomics: new strategy for soil microbiology research. Microbiology, 2007, 34(3): 576鄄579.
[57] 摇 He J Z, Zhang L M, Shen J P, Zhu Y G. Advances and perspectives of metagenomics. Acta Scientiae Circumstantiae, 2008, 28(2): 209鄄218.
[58] 摇 Daniel R. The metagenomics of soil. Nature Reviews Microbiology, 2005, 3(6): 470鄄478.
[59] 摇 Ogram A, Sayler G S, Barkay T. The extraction and purification of microbial DNA from sediments. Journal of Microbiological Methods, 1987, 7
(2 / 3): 57鄄66.
[60] 摇 Holben W E, Jansson J K, Chelm B K, Tiedje J M. DNA probe method for the detection of specific microorganisms in the soil bacterial
community. Applied and Environmental Microbiology, 1988, 54(3): 703鄄711.
[61] 摇 Gabor E M, de Vries E J, Janssen D B. Efficient recovery of environmental DNA for expression cloning by indirect extraction methods. FEMS
Microbiology Ecology, 2003, 44(2): 153鄄163.
[62] 摇 Courtois S, Frosteg覽rd 魡, G觟ransson P, Depret G, Jeannin P, Simonet P. Quantification of bacterial subgroups in soil: comparison of DNA
extracted directly from soil or from cells previously released by density gradient centrifugation. Environmental Microbiology, 2001, 3(7): 431鄄439.
[63] 摇 Yun J, Kang S, Park S, Yoon H, Kim M J, Heu S, Ryu S. Characterization of a novel amylolytic enzyme encoded by a gene from a soil鄄derived
metagenomic library. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(12): 7229鄄7235.
[64] 摇 Gabor E M, de Vries E J, Janssen D B. Construction, characterization, and use of small鄄insert gene banks of DNA isolated from soil and
enrichment cultures for the recovery of novel amidases. Environmental Microbiology, 2004, 6(9): 948鄄958.
[65] 摇 Quaiser, A, Ochsenreiter T, Klenk H P, Kletzin A, Treusch A H, Meurer G, Eck J, Sensen C W, Schleper C. First insight into the genome of an
uncultivated crenarchaeote from soil. Environmental Microbiology, 2002, 4(10): 603鄄611.
[66] 摇 Treusch A H, Kletzin A, Raddatz G, Ochsenreiter T, Quaiser A, Meurer G, Schuster S C, Schleper C. Characterization of large鄄insert DNA
libraries from soil for environmental genomic studies of Archaea. Environmental Microbiology, 2004, 6(9): 970鄄980.
[67] 摇 Liles M R, Manske B F, Bintrim S B, Handelsman J, Goodman R M. A census of rRNA genes and linked genomic sequences within a soil
metagenomic library. Applied and Environmental Microbiology,2003, 69(5): 2684鄄2691.
[68] 摇 Ferrer M, Martinez鄄Abarca F, Golyshin P N. Mining genomes and ‘metagenomes爷 for novel catalysts. Current Opinion Biotechnology, 2005, 16
(6): 588鄄593.
[69] 摇 Uchiyama T, Abe T, Ikemura T, Watanabe K. Substrate鄄induced gene expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of
catabolic genes. Nature Biotechnology, 2005, 23(1): 88鄄93.
[70] 摇 Rondon M R, August P R, Betterrnann A D, Brady S F, Grossman T H, Liles M R, Loiacono K A, Lynch B A, MacNeil I A, Minor C, Tiong C
L, Gilman M, Osburne M S, Clardy J, Handelsman J, Goodman R M. Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and
functional diversity of uncultured microorganisms. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(6): 2541鄄2547.
[71] 摇 Quaiser A, Ochsenreiter T, Lanz C, Schuster S C, Treusch A H, Eck J, Schleper C. Acidobacteria form a coherent but highly diverse group within
the bacterial domain: evidences from environmental genomics. Molecular Microbiology, 2003, 50(2): 563鄄575.
[72] 摇 Treusch A H, Kletzin A, Raddatz G, Ochsenreiter T, Quaiser A, Meurer G, Schuster S C, Schleper C. Characterization of large鄄insert DNA
1344摇 14 期 摇 摇 摇 刘国华摇 等:土壤微生物群落多样性解析法:从培养到非培养 摇
http: / / www. ecologica. cn
libraries from soil for environmental genomic studies of Archaea. Environmental Microbiology, 2004, 6(9): 970鄄980.
[73] 摇 Tiedje J M, Asuming鄄Brempong S, N俟sslein K, Marsh T L, Flynn S J. Opening the black box of soil microbial diversity. Applied Soil Ecology,
1999, 13(2): 109鄄122.
[74] 摇 Liu W T, Marsh T L, Cheng H, Forney L J. Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length
polymorphisms of genes encoding 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(11): 4516鄄4522.
[75] 摇 Fedi S, Tremaroli V, Scala D, Perez鄄Jimenez J R, Fava F, Young L, Zannoni D. T鄄RFLP analysis of bacterial communities in cyclodextrin鄄
amended bioreactors developed for biodegradation of polychlorinated biphenyls. Research in Microbiology, 2005, 156(2): 201鄄210.
[76] 摇 Hartmann M, Frey B, K觟lliker R, Widmer F. Semi鄄automated genetic analyses of soil microbial communities: comparison of T鄄RFLP and RISA
based on descriptive and discriminative statistical approaches. Journal of Microbiological Methods, 2005, 61(3): 349鄄360.
[77] 摇 Wang Y, Teng Q H, Cui Z L, Sun B, Cao H, Hu F. Diversity and spatial distribution of bacteria in non鄄tillage paddy fields. Acta Pedologica
Sinica, 2007, 44(1): 137鄄143.
[78] 摇 Ranjard L, Poly F, Combrisson J, Richaume A, Gourbi侉re F, Thioulouse J, Nazaret S. Heterogeneous cell density and genetic structure of
bacterial pools associated with various soil microenvironments as determined by enumeration and DNA fingerprinting approach (RISA). Microbial
Ecology, 2000, 39(4): 263鄄272.
[79] 摇 Wu S H, Zhang C G, Zhang Z Z. Application of RAPD in microbial biodiversity identification. Journal of Microbiology, 2000, 20(2): 44鄄47.
[80] 摇 Muyzer G, de Waal E C, Uitterlinden A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of
polymerase chain reaction鄄amplified genes coding for 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(3): 695鄄700.
[81] 摇 Felske A, Akkermans A D L. Spatial homogeneity of abundant bacterial 16S rRNA molecules in Grassland soils. Microbial Ecology, 1998, 36
(1): 31鄄36.
[82] 摇 Duineveld B M, Kowalchuk G A, Keijzer A, van Elsas J D, van Veen J A. Analysis of bacterial communities in the rhizosphere of chrysanthemum
via denaturing gradient gel electrophoresis of PCR鄄amplified 16S rRNA as well as DNA fragments coding for 16S rRNA. Applied and Environmental
Microbiology, 2001, 67(1): 172鄄178.
[83] 摇 Peixoto R S, da Costa Coutinho H L, Rumjanek N G, Macrae A, Rosado A S. Use of rpoB and 16S rRNA genes to analyse bacterial diversity of a
tropical soil using PCR and DGGE. Letters in Applied Microbiology, 2002, 35(4): 316鄄320.
[84] 摇 Knief C, Lipski A, Dunfield P F. Diversity and activity of methanotrophic bacteria in different upland soils. Applied and Environmental
Microbiology, 2003, 69(11): 6703鄄6714.
[85] 摇 Mart侏nez鄄Alonso M, Escolano J, Montesinos E, Gaju N. Diversity of the bacterial community in the surface soil of a pear orchard based on 16S
rRNA gene analysis. International Microbiology, 2010, 13(3): 123鄄134.
[86] 摇 Ben鄄David E A, Zaady E, Sher Y, Nejidat A. Assessment of the spatial distribution of soil microbial communities in patchy arid and semi鄄arid
landscapes of the Negev Desert using combined PLFA and DGGE analyses. FEMS Microbiology Ecology, 2011, 76(3): 492鄄503.
[87] 摇 Xing D F, Ren N Q. Common problems in the analyses of microbial community by denaturing gradient gel electrophoresis ( DGGE). Acta
Microbiologica Sinica, 2006, 46(2): 331鄄335.
[88] 摇 Wartell R M, Hosseini S H, Moran C P Jr. Detecting base pair substitutions in DNA fragments by temperature鄄gradient gel electrophoresis. Nucleic
Acids Research, 1990, 18(9): 2699鄄2705.
[89] 摇 Yoshino K, Nishigaki K, Husimi Y. Temperature sweep gel electrophoresis: a simple method to detect point mutations. Nucleic Acids Research,
1991, 19(11): 3153.
[90] 摇 Chen T J, Boles R G, Wong L J C. Detection of mitochondrial DNA mutations by temporal temperature gradient gel electrophoresis. Clinical
Chemistry, 1999, 45(8): 1162鄄1167.
[91] 摇 Orita M, Suzuki Y, Sekiya T, Hayashi K. A rapid and sensitive detection of point mutations and genetic polymorphisms using polymerase chain
reaction. Genomics, 1989, 5(4): 874鄄 879.
[92] 摇 Markoff A, Savov A, Vladimirov V, Bogdanova N, Kremensky I, Ganev V. Optimization of single鄄strand conformation polymorphism analysis in
the presence of polyethylene glycol. Clinical Chemistry, 1997, 43(1): 30鄄33.
[93] 摇 Schwieger F, Tebbe C C. A new approach to utilize PCR鄄single鄄strand鄄conformation polymorphism for 16S rRNA gene鄄based microbial community
analysis. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(12): 4870鄄4876.
[94] 摇 Kleinsteuber S, Riis V, Fetzer I, Harms H, M俟ller S. Population dynamics within a microbial consortium during growth on diesel fuel in saline
environments. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(5): 3531鄄3542.
[95] 摇 Smalla K, Oros鄄Sichler M, Milling A, Heuer H, Baumgarte S, Becker R, Neuber G, Kropf S, Ulrich A, Tebbe C C. Bacterial diversity of soils
assessed by DGGE, T鄄RFLP and SSCP fingerprints of PCR鄄amplified 16S rRNA gene fragments: do the different methods provide similar results?.
Journal of Microbiological Methods, 2007, 69(3): 470鄄479.
2344 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
http: / / www. ecologica. cn
[96]摇 Vivas A, Moreno B, del Val C, Macci C, Masciandaro G, Benitez E. Metabolic and bacterial diversity in soils historically contaminated by heavy
metals and hydrocarbons. Journal of Environmental Monitoring, 2008, 10(11): 1287鄄1296.
[97] 摇 Liu G H, Harada T, Amemiya T, Itoh K. Novel two鄄dimensional DNA gel electrophoresis mapping for characterizing complex bacterial communities
in environmental samples. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2009, 107(6): 646鄄651.
[98] 摇 Fischer S G, Lerman L S. Length鄄independent separation of DNA restriction fragments in two鄄dimensional gel electrophoresis. Cell, 1979, 16(1):
191鄄200.
[99] 摇 Isshi T, Rajendran N, Amemiya T, Itoh K. Development of a two鄄dimensional electrophoresis method to study soil bacterial diversity. Soil Science
and Plant Nutrition, 2006, 52(5): 601鄄609.
[100] 摇 Liu G H, Amemiya T, Itoh K. Two鄄dimensional DNA gel electrophoresis mapping: a novel approach to diversity analysis of bacterial communities
in environmental soil. Journal of Bioscience Bioengineering, 2008, 105(2): 127鄄133.
[101] 摇 Liu G H, Rajendran N, Amemiya T, Itoh K. Bacterial community structure analysis of sediment in the Sagami River, Japan using a rapid
approach based on two鄄dimensional DNA gel electrophoresis mapping with selective primer pairs. Environmental Monitoring and Assessment,
2010, doi: 10. 1007 / s10661鄄010鄄1868鄄7.
[102] 摇 Liu G H, Nakamura T, Rajendran N, Amemiya T, Itoh K. Analysis of bacterial populations in the environment using two鄄dimensional gel
electrophoresis of genomic DNA and complementary DNA. Microbes and Environments, 2011, 26(2): 184鄄187.
[103] 摇 Jones C M, Thies J E. Soil microbial community analysis using two鄄dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of the bacterial ribosomal
internal transcribed spacer regions. Journal of Microbiological Methods, 2007, 69(2): 256鄄269.
[104] 摇 Li G, Zhao J N, Wen Du R L, Yang D L. Bacterial diversity in rhizosphere soil of soybean: a comparison of RISA, DGGE, and 2D鄄PAGE
techniques. Chinese Journal of Ecology, 2011, 30(1): 87鄄92.
[105] 摇 Ellis R J, Morgan P, Weightman A J, Fry J C. Cultivation鄄dependent and 鄄independent approaches for determining bacterial diversity in heavy鄄
metal鄄contaminated soil. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(6): 3223鄄3230.
[106] 摇 Enwall K, Hallin S. Comparison of T鄄RFLP and DGGE techniques to assess denitrifier community composition in soil. Letters in Applied
Microbiology, 2009, 48(1): 145鄄148.
[107] 摇 Rosenberg K, Bertaux J, Krome K, Hartmann A, Scheu S, Bonkowski M. Soil amoebae rapidly change bacterial community composition in the
rhizosphere of Arabidopsis thaliana. The ISME Journal, 2009, 3(6): 675鄄684.
[108] 摇 Voget S, Leggewie C, Uesbeck A, Raasch C, Jaeger K E, Streit W R. Prospecting for novel biocatalysts in a soil metagenome. Applied and
Environmental Microbiology, 2003, 69(10): 6235鄄6242.
[109] 摇 Kaeberlein T, Lewis K, Epstein S S. Isolating “uncultivable冶 microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science, 2002,
296(5570): 1127鄄1129.
[110] 摇 Joseph S J, Hugenholtz P, Sangwan P, Osborne C A, Janssen P H. Laboratory cultivation of widespread and previously uncultured soil bacteria.
Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(12): 7210鄄7215.
[111] 摇 Sebat J L, Colwell F S, Crawford R L. Metagenomic profiling: microarray analysis of an environmental genomic library. Applied and
Environmental Microbiology, 2003, 69(8): 4927鄄4934.
参考文献:
[ 6 ]摇 姚槐应, 黄昌勇. 土壤微生物生态学及其实验技术. 北京: 科学出版社, 2006: 7鄄17.
[15] 摇 郑华, 欧阳志云, 方治国, 赵同谦. BIOLOG在土壤微生物群落功能多样性研究中的应用. 土壤学报, 2004, 41(3): 456鄄461.
[18] 摇 李云, 孙波, 李忠佩. 气候对旱地紫色土微生物功能多样性的长期影响. 土壤, 2009, 41(2): 230鄄235.
[30] 摇 胡洪营, 童中华. 微生物醌指纹法在环境微生物群体组成研究中的应用. 微生物学通报, 2002, 29(4): 95鄄98.
[37] 摇 钟文辉, 王薇, 林先贵, 尹睿, 申卫收. 核酸分析方法在土壤微生物多样性研究中的应用. 土壤学报, 2009, 46(2): 334鄄341.
[56] 摇 钮旭光, 韩梅, 韩晓日. 宏基因组学: 土壤微生物研究的新策略. 微生物学通报, 2007, 34(3): 576鄄579.
[57] 摇 贺纪正, 张丽梅, 沈菊培, 朱永官. 宏基因组学 (Metagenomics) 的研究现状和发展趋势. 环境科学学报, 2008, 28(2): 209鄄218.
[77] 摇 王英, 滕齐辉, 崔中利, 孙波, 曹慧, 胡锋. 免耕水稻土壤中细菌多样性及其空间分布的研究. 土壤学报, 2007, 44(1): 137鄄143.
[79] 摇 吴少慧, 张成刚, 张忠泽. RAPD 技术在微生物生物多样鉴定中的应用. 微生物学杂志, 2000, 20(2): 44鄄47.
[87] 摇 邢德峰, 任南琪. 应用 DGGE研究微生物群落时的常见问题分析. 微生物学报, 2006, 46(2): 331鄄335.
[104] 摇 李刚, 赵建宁, 文都日乐, 杨殿林. RISA、DGGE和 2D鄄PAGE技术对大豆根际土壤细菌多样性分析的比较. 生态学杂志, 2011, 30(1):
87鄄92.
3344摇 14 期 摇 摇 摇 刘国华摇 等:土壤微生物群落多样性解析法:从培养到非培养 摇
ACTA ECOLOGICA SINICA Vol. 32,No. 14 July,2012(Semimonthly)
CONTENTS
Growth and physiological adaptation of Messerschmidia sibirica to sand burial on coastal sandy
WANG Jin,ZHOU Ruilian, ZHAO Halin,et al (4291)
…………………………………………
……………………………………………………………………………
Alleviation effect and mechanism of exogenous potassium nitrate and salicylic acid on the growth inhibition of Pinus tabulaeformis
seedlings induced by deicing salts ZHANG Ying, LI Fayun, YAN Xia, et al (4300)……………………………………………
Influence of different spatial鄄scale factors on stream macroinvertebrate assemblages in the middle section of Qiantang River Basin
ZHANG Yong,LIU Shuoru,YU Haiyan,et al (4309)
……
………………………………………………………………………………
Species diversity and distribution pattern of non鄄volant small mammals along the elevational gradient on eastern slope of Gongga
Mountain WU Yongjie, YANG Qisen, XIA Lin, et al (4318)……………………………………………………………………
A patch鄄based method for mechanism analysis on spatial dynamics of mangrove distribution
LI Chungan,LIU Suqing,FAN Huangqing,et al (4329)
……………………………………………
……………………………………………………………………………
Nutrient heterogeneity in fine roots of six subtropical natural tree species
XIONG Decheng,HUANG Jinxue,YANG Zhijie,et al (4343)
………………………………………………………………
………………………………………………………………………
Variation of vegetation NDVI and its response to climate change in Zhejiang Province
HE Yue, FAN Gaofeng, ZHANG Xiaowei, et al (4352)
…………………………………………………
……………………………………………………………………………
Heterogeneity in fine root respiration of six subtropical tree species
ZHENG Jinxing, XIONG Decheng, HUANG Jinxue, et al (4363)
……………………………………………………………………
…………………………………………………………………
Characteristics of ammonia鄄oxidizing bacteria and ammonia鄄oxidizing archaea abundance in soil organic layer under the subalpine /
alpine forest WANG Ao, WU Fuzhong, HE Zhenhua, et al (4371)………………………………………………………………
Effect of tillage systems on light fraction carbon in a purple paddy soil
ZHANG Junke, JIANG Changsheng,HAO Qingju,et al (4379)
…………………………………………………………………
……………………………………………………………………
Effects of prescribed fire on carbon sequestration of long鄄term grazing鄄excluded grasslands in Inner Mongolia
HE Nianpeng, HAN Xingguo, YU Guirui, et al (4388)
…………………………
……………………………………………………………………………
Stoichiometry of carbon dioxide and methane emissions in Minjiang River estuarine tidal wetland
WANG Weiqi, ZENG Congsheng, TONG Chuan, et al (4396)
……………………………………
……………………………………………………………………
Distribution and sources of particulate organic carbon in the Pearl River Estuary in summer 2010
LIU Qingxia, HUANG Xiaoping,ZHANG Xia, et al (4403)
……………………………………
………………………………………………………………………
The glucose鄄utilizing bacterial diversity in the cold spring sediment of Shawan, Xinjiang, based on stable isotope probing
CHU Min, WANG Yun,ZENG Jun, et al (4413)
……………
…………………………………………………………………………………
Culture鄄dependent and culture鄄independent approaches to studying soil microbial diversity
LIU Guohua, YE Zhengfang, WU Weizhong (4421)
……………………………………………
………………………………………………………………………………
The classification of plant functional types based on the dominant herbaceous species in the riparian zone ecosystems in the Yiluo
River GUO Yili, LU Xunling, DING Shengyan (4434)……………………………………………………………………………
Genetic diversity of different eco鄄geographical populations in endangered plant Prunus mongolica by ISSR Markers
ZHANG Jie, WANG Jia, LI Haoyu, ZHANG Huirong, et al (4443)
…………………
………………………………………………………………
Ecophysiological characteristics of higher鄄latitude transplanted mangrove Kandelia candel in strong tidal range area
ZHENG Chunfang, QIU Jianbiao, LIU Weicheng, et al (4453)
…………………
……………………………………………………………………
The effect of artificial warming during winter on white clover (Trifolium repens Linn): overwintering and adaptation to coldness
in late spring ZHOU Ruilian, ZHAO Mei, WANG Jin, et al (4462)……………………………………………………………
Estimating fine root production and mortality in subtropical Altingia grlilipes and Castanopsis carlesii forests
HUANG Jinxue, LING Hua, YANG Zhijie, et al (4472)
…………………………
…………………………………………………………………………
The cloning and expression of WUE鄄related gene (PdEPF1) in Populus deltoides伊Populus nigra
GUO Peng, JIN Hua, YIN Weilun,et al (4481)
……………………………………
……………………………………………………………………………………
The allelopathy of aquatic rhizome and root extract of Thalia dealbata to seedling of several aquatic plants
MIAO Lihua, WANG Yuan, GAO Yan,et al (4488)
……………………………
………………………………………………………………………………
Effect of the avirulent strain of Ralstonia solanacearum on the ecological characteristics of microorganism fatty acids in the rhizosphere
of tobacco ZHENG Xuefang, LIU Bo, LAN Jianglin, et al (4496)………………………………………………………………
Coupling remotely sensed information with a rice growth model by combining updating and assimilation strategies
WANG Hang, ZHU Yan, MA Mengli, et al (4505)
……………………
………………………………………………………………………………
Effects of water temperature and body weight on metabolic rates of Yellowtail clownfish Amphiprion clarkii (Pisces: Perciformes)
during larval developmen YE Le, YANG Shengyun, LIU Min, et al (4516)………………………………………………………
The distribution of chlorophyll a in the Southwestern Indian Ocean in summer
HONG Lisha, WANG Chunsheng, ZHOU Yadong, et al (4525)
…………………………………………………………
…………………………………………………………………
Evaluation of the effects of ecological remediation on the water quality and biological toxicity of Dagu Drainage River in Tianjin
WANG Min, TANG Jingchun, ZHU Wenying, et al (4535)
……
………………………………………………………………………
Quantitative dynamics of adult population and 3鄄D spatial pattern of Ceoporus variabilis (Baly)
WANG Wenjun, LIN Xuefei, ZOU Yunding, et al (4544)
………………………………………
…………………………………………………………………………
Review and Monograph
Studies on urban heat island from a landscape pattern view: a review CHEN Ailian,SUN Ranhao,CHEN Liding (4553)……………
Sediment quality triad and its application in coastal ecosystems in recent years WU Bin,SONG Jinming,LI Xuegang,et al (4566)…
Discussion
Food waste management in China: status, problems and solutions HU Xinjun, ZHANG Min, YU Junfeng, et al (4575)……………
Scientific Note
Effects of microchemical substances in anaerobic fermented liquid from rice straw and cyanobacteria on Fusaruim oxysporum f. sp.
niveum growth LIU Aimin, XU Shuangsuo, CAI Xin, et al (4585)………………………………………………………………
Ecological benefit鄄loss analysis of agricultural ecosystem in Foshan City, China
YE Yanqiong, ZHANG Jiaen, QIN Zhong, et al (4593)
………………………………………………………
……………………………………………………………………………
《生态学报》2012 年征订启事
《生态学报》是中国生态学学会主办的自然科学高级学术期刊,创刊于 1981 年。 主要报道生态学研究原
始创新性科研成果,特别欢迎能反映现代生态学发展方向的优秀综述性文章;研究简报;生态学新理论、新方
法、新技术介绍;新书评介和学术、科研动态及开放实验室介绍等。
《生态学报》为半月刊,大 16 开本,280 页,国内定价 70 元 /册,全年定价 1680 元。
国内邮发代号:82鄄7摇 国外邮发代号:M670摇 标准刊号:ISSN 1000鄄0933摇 CN 11鄄2031 / Q
全国各地邮局均可订阅,也可直接与编辑部联系购买。 欢迎广大科技工作者、科研单位、高等院校、图书
馆等订阅。
通讯地址: 100085 北京海淀区双清路 18 号摇 电摇 摇 话: (010)62941099; 62843362
E鄄mail: shengtaixuebao@ rcees. ac. cn摇 网摇 摇 址: www. ecologica. cn
摇 摇 编辑部主任摇 孔红梅摇 摇 摇 执行编辑摇 刘天星摇 段摇 靖
生摇 态摇 学摇 报
(SHENGTAI摇 XUEBAO)
(半月刊摇 1981 年 3 月创刊)
第 32 卷摇 第 14 期摇 (2012 年 7 月)
ACTA ECOLOGICA SINICA
摇
(Semimonthly,Started in 1981)
摇
Vol郾 32摇 No郾 14 (July, 2012)
编摇 摇 辑摇 《生态学报》编辑部
地址:北京海淀区双清路 18 号
邮政编码:100085
电话:(010)62941099
www. ecologica. cn
shengtaixuebao@ rcees. ac. cn
主摇 摇 编摇 冯宗炜
主摇 摇 管摇 中国科学技术协会
主摇 摇 办摇 中国生态学学会
中国科学院生态环境研究中心
地址:北京海淀区双清路 18 号
邮政编码:100085
出摇 摇 版摇
摇 摇 摇 摇 摇 地址:北京东黄城根北街 16 号
邮政编码:1R00717
印摇 摇 刷摇 北京北林印刷厂
发 行摇
地址:东黄城根北街 16 号
邮政编码:100717
电话:(010)64034563
E鄄mail:journal@ cspg. net
订摇 摇 购摇 全国各地邮局
国外发行摇 中国国际图书贸易总公司
地址:北京 399 信箱
邮政编码:100044
广告经营
许 可 证摇 京海工商广字第 8013 号
Edited by摇 Editorial board of
ACTA ECOLOGICA SINICA
Add:18,Shuangqing Street,Haidian,Beijing 100085,China
Tel:(010)62941099
www. ecologica. cn
Shengtaixuebao@ rcees. ac. cn
Editor鄄in鄄chief摇 FENG Zong鄄Wei
Supervised by摇 China Association for Science and Technology
Sponsored by摇 Ecological Society of China
Research Center for Eco鄄environmental Sciences, CAS
Add:18,Shuangqing Street,Haidian,Beijing 100085,China
Published by摇 Science Press
Add:16 Donghuangchenggen North Street,
Beijing摇 100717,China
Printed by摇 Beijing Bei Lin Printing House,
Beijing 100083,China
Distributed by摇 Science Press
Add:16 Donghuangchenggen North
Street,Beijing 100717,China
Tel:(010)64034563
E鄄mail:journal@ cspg. net
Domestic 摇 摇 All Local Post Offices in China
Foreign 摇 摇 China International Book Trading
Corporation
Add:P. O. Box 399 Beijing 100044,China
摇 ISSN 1000鄄0933
CN 11鄄2031 / Q
国内外公开发行 国内邮发代号 82鄄7 国外发行代号 M670 定价 70郾 00 元摇