全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
现代生物化学与分子生物学研究技术在
植物微生物生态学中的应用
左山 刘洋 邹媛媛 刘琳 刘家熙
(首都师范大学生命科学学院,北京 100048)
摘 要: 植物微生物生态学是研究植物微生态系统的一门学科 ,以植物组织细胞内微生物的组成、功能、演替, 以及微
生物之间和微生物与宿主之间的相互作用关系为研究对象。现代生物化学与分子生物学技术在植物微生物生态学研究领域
的作用日益明显。介绍了上述技术及其在植物微生物生态学研究领域的应用进展, 并对其在该领域的利用和发展进行了
展望。
关键词: 生物化学技术 分子生物学技术 植物微生物生态学
Application ofM odern Biochem istry andM olecular Biology Technology
in the Research ofM icrobial Ecology of Plants
Zuo Shan L iu Yang Zou Yuanyuan L iu L in L iu J iax i
(Co llege of Lif e Sciences, CapitalN ormal University, B eijing 100048)
Abstrac:t M icrob ia l eco logy of plants as a sub jec t to study m icroecosystem o f plants, w hich focused on composition, function,
success ion dynam ics of them icrobia l community w ithin the p lants tissue. The interactions am ong m icrobes and the ir hosts we re a lso in
cluded in the study. M odern biochem istry and mo lecu lar b io logy techno logy played an im po rtant ro les in the research ofm icrob ia l eco lo
gy o f plants. In this paper, the techno logy and its applica tion w ere introduced, and prospect o f the related bio chem istry and m olecu lar
b io logy techno logy in the resea rch field o fm icrob ia l eco logy o f plan ts w as proposed.
Key words: B iochem istry techno logy M olecu lar b io logy techno logy M icrob ia l eco logy of plants
收稿日期: 20091203
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30470106)
作者简介:左山,硕士研究生,研究方向:植物与微生物相互作用、植物细胞与发育生物学; Em ai:l zuosh andeyoux iang@ 126. com
通讯作者:刘家熙,副教授,硕士生导师, Em ai:l liu jiax@i 263. net;刘洋, Em ai:l ly81150@ 163. com
近年来随着人们对生态环境问题的日益关注,
微生物生态学的发展十分迅速, 20世纪 90年代分
子生物学研究技术的引入使得该领域的研究工作更
加深入 [ 1]。传统的分离方法所能鉴定的微生物只
占环境微生物总数的 0. 1% - 10% [ 2] , 已远不能满
足微生物生态学研究的需要。因此, 应用现代生物
化学和分子生物学技术方法,克服传统微生物生态
学研究技术的局限性, 获取更加丰富的微生物多样
性信息,从而为推动当今微生物生态学研究的进一
步发展具有重要的意义 [ 3]。
植物微生物生态学是研究植物微生态系统的一
门学科,研究植物组织细胞内微生物的组成、功能、
演替,以及微生物之间和微生物与宿主之间的相互
作用关系的生命科学分支 [ 4]。植物中微生物种类
也较为丰富,已有诸多研究表明植物的根、茎、叶、穗
中存在大量与植物有某种相互关系的微生物 [ 5] , 在
植物微生态系统中有着至关重要的作用。
目前, 应用于植物微生物生态学的现代生物化
学技术主要有脂质分析技术、B IOLOG技术及蛋白
质组学研究技术等;现代分子生物学技术主要包括
限制性片断长度多态性 ( RFLP)、扩增 rDNA限制性
分析 ( ARDRA )、16S rDNA克隆文库构建与系统发
育分析技术、变性梯度凝胶电泳 ( DGGE )及荧光原
位杂交 ( F ISH )技术等。这些现代技术方法对于与
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
植物联合的微生物的多样性及其在生态系统中作用
的研究越来越受到重视。
1 现代生物化学技术在植物微生物生态学
研究中的应用
1. 1 脂质分析技术及 B IOLOG技术
磷脂脂肪酸 ( PLFA )是活体微生物细胞膜恒定
组分, 不同种属之间微生物差异明显,且对于环境因
素较为敏感,利用特征 PLFA数量和不同脂肪酸之
间的比值可以反映微生物群落的结构和相对数量,
并可通过跟踪观察 PLFA的组成和量的变化, 揭示
植物微生物生态环境中微生物群落结构组成和变化
规律。目前 PLFA分析方法已广泛运用于环境微生
物研究领域 [ 6, 7 ]。B IOLOG微生物分析系统具有灵
敏度高、分辨力强、无需分离纯种微生物、操作简便
等优点 [ 810 ] , 可以对微生物群落进行生理图谱
( CLPPs)分析, 从而在生理代谢水平上对微生物群
落进行检测。
吴振斌等 [ 12]通过磷脂脂肪酸 ( PLFA )分析, 研
究了复合垂直流人工湿地基质剖面的微生物群落结
构及其分布特征,结果表明,特征脂肪酸的比例呈垂
直分布,基质中好氧原核微生物为优势种群,其次为
革兰氏阳性细菌及其它厌氧细菌, 真核微生物所占
比例最低, PLFA s的组成差异可反映人工湿地中不
同位点基质微生物群落结构的差异。李祖明等 [ 10]
采用磷脂脂肪酸 ( PLFA )分析方法评价了碱性果胶
酶对油菜叶际微生物群落的影响, 通过磷脂脂肪酸
主要成分分析表明,喷有酶活力为 10 /mL的碱性
果胶酶的样品与其他处理及对照样品的微生物群落
结构差异明显。谷立坤等 [ 11 ]利用磷脂脂肪酸 ( PL
FA)分析方法和利用 B IOLOG技术, 比较了北京通
州、顺义、昌平、延庆地区玉米叶际微生物的多样性,
并调查了通州地区玉米叶际微生物群落在不同生长
季节的变化情况。PLFA分析结果发现所有的监测
样品中,革兰氏阳性细菌生物量均高于革兰氏阴性
细菌生物量,聚类分析结果表明玉米叶际微生物群
落结构受到时空因素的影响,不同地点、不同生长季
节玉米叶际微生物群落结构有较大差异。 BIOLOG
分析结果表明 6、7月玉米叶际微生物碳源利用活性
较 8、9月份高,不同生长地点、生长时间的玉米叶际
微生物碳源代谢差别明显, 这项研究为玉米的种植
生产以及病虫害防治提供了必要的微生物学理论
知识。
1. 2 蛋白质组学 ( pro teom ics)研究技术
除环境因素外, 植物的生长发育还与微生物的
活动密切相关。但植物受到微生物共生、寄生和病
菌侵害时,将改变体内蛋白的表达来完成信号的感
应、传递, 引起植物相应的反应机制。因此,利用蛋
白质组学技术方法研究相关蛋白将有利于更好地了
解植物与微生物之间的相互作用机制 [ 13 ]。
K im等 [ 14 ]用水稻病原菌对水稻悬浮培养细胞
进行处理,对诱导产生的病原相关蛋白 OsPR10, 异
黄酮还原酶类似蛋白 OsPR10和 葡聚糖酶等蛋白
等进行了首次报道。 Chen等 [ 15]利用双向电泳技
术, 分析水稻抗虫材料、感虫材料受虫害与未受虫害
的秧苗蛋白质的变化,找到一个分子量为 40 kD、等
电点为 6. 3的差显蛋白质 P40,推测 P40与水稻受
褐飞虱虫害后引起的应答反应相关。
为了解水稻黄斑驳病毒 ( RYMV )对水稻产量的
影响, V ente lonDebout等 [ 16]对两个水稻品种 IR64
(对该病毒敏感 )和 A zucena(相对不敏感 )的悬浮培
养细胞蛋白质组的研究表明, 病毒感染后两者分别
有 40和 24个蛋白点表达有明显变化, 有些只在
IR64中表达, 如 HSP70、PR10a、乙烯诱导蛋白等,
有些只在后者中存在,如 Chaperon in CPN602等, 而
与糖酵解有关的酶在两个品种中都有变化。
Campo等 [ 17]在研究玉米萌发种胚对真菌侵染
后的防御反应时发现,有 9个蛋白在真菌侵染后上
调表达,它们主要参与植物组织抗氧化合解毒、蛋白
质的合成和折叠。特别是翻译起始因子 eIF5A表
达量提高,暗示它可能与植物防御反应直接有关。
此外,还有报道通过 2DE分离分析水稻在稻瘟病
侵染条件下叶片蛋白的表达变化及小麦在条锈菌、
镰刀菌侵染时其根组织及叶片蛋白质组的表达
变化 [ 1820 ]。
在豆科植物和固氮根瘤菌间的共生结合形成的
根瘤中,类菌体周隙 ( peribactero id space, PS)是类菌
体周膜 ( peribacteroid membrane, PBM )与细菌质膜
之间的间隙,是共生体成员之间交换代谢产物的媒
介。 Saa lbach等 [ 21]用蛋白质组学分析方法, 鉴定了
PBM与 PS中的蛋白, 结果表明 PS甚至 PBM 的制
70
2010年第 4期 左山等:现代生物化学与分子生物学研究技术在植物微生物生态学中的应用
备物中含有大量的类菌体蛋白。 Panter等 [ 22 ]从大
豆根瘤中分离出环行细菌的 PBM蛋白, 并对其进行
N端测序。共获得了 17个 PBM 蛋白的蛋白质数
据,其中 6个蛋白质是已知功能的同源蛋白质, 并首
次证明 HSP60和 HSP70两种同源蛋白在共生体中
作为细胞质蛋白质翻译时和翻译后转运的分子物质
基础。此外, Sarma等 [ 23]研究大豆和土壤细菌间的
共生固氮过程, 2DE分离类菌体蛋白证明类菌体在
氮、碳代谢中表达了一个主要的、精细的蛋白网络,
但缺乏脂肪酸和核酸代谢, 几个蛋白参与了细胞解
毒、胁迫调节和信号传达。这些研究对于深入了解
农作物与根瘤固氮菌的互利共生关系及其相关分子
机制具有重要的意义。
目前, 本课题组在多年研究与植物相联合的细
菌的工作基础上,着手以与水稻根面相联合的细菌
生物膜外膜蛋白为研究切入点, 以从水稻品种 越
光 !根面分离得到的一株植物促生细菌肺炎克雷伯
氏菌 NG14为材料, 利用蛋白质组学技术研究其生
物膜形成前后外膜蛋白变化情况, 发现若干种蛋白
表达量发生变化, 其中外膜蛋白 OmpC的前体蛋白
在 NG14形成生物膜后明显上调表达 (数据尚未发
表 ) ,为研究与植物联合的细菌生物膜形成相关因
子提供了依据 [ 24] ,进而对深入了解植物与微生物相
互作用关系及进一步改善植物微生物生态系统具有
重要的参考价值。
2 现代分子生物学技术在植物微生物生态
学研究中的应用
2. 1 限制性片段长度多态性 ( RFLP)
限制性片段长度多态性 ( restriction fragment
length po lymorphism, RFLP)是一种 DNA分子水平上
的多态性检测技术,它是限制性内切酶、核酸电泳、印
迹技术、探针 -杂交技术的综合应用。该技术也已广
泛用于微生物群落的研究。 PCRRFLP可以检测出
碱基发生突变、插入、缺失的位点。限制性内切酶能
识别并切割特异核苷酸序列。由于不同来源的 DNA
具有不同的限制性内切酶酶切位点的分布,每一种
DNA限制性酶组合所产生的片段是特异的,从而产
生多态性,所以它能作为某一 DNA的特有指纹。切
割产生的不同片段通过特定探针杂交进行检测,从
而可比较出不同品种的 DNA水平的差异 (即多态
性 )。多个探针的比较可以确立生物的进化和分类
关系,该方法检测结果不受环境因素的影响。但是
该技术所用限制酶的选择通常凭经验,正常情况下
必须使用多种酶。因为一种酶可能在两种 DNA片
段的同一位置进行切割。为了克服 RFLP技术上的
缺陷,将 PCR技术和荧光标记技术与之结合, 发展
出了 ARDRA技术及 TRFLP技术 [ 25]。
2. 2 扩增 rDNA限制性分析 ( ARDRA )
扩增 rDNA限制性分析 ( amplified ribosomal DNA
restriction ana lysis, ARDRA )是 16S rDNAPCR技术
与 RFLP技术相结合而发展起来的分子微生物生态
学研究技术, 该方法不受菌株是否纯培养的限制,不
受宿主的干扰,具有特异性强,效率高的特点,因此广
泛适用于研究各种环境中的微生物多样性和系统发
育关系。ARDRA技术原理是利用 PCR选择性扩增
DNA片段,在对 PCR产物进行限制性酶切片段多态
性分析 ( RFLP)。当用限制性内切酶对 16S rDNA片
段酶切时,会产生多态性的片段, 可用于对微生物进
行鉴定及多样性分析。ARDRA技术目前主要是应
用于细菌的鉴定及克隆文库的分析, 群落中的每一
种微生物的 rDNA序列不同,其 rDNA指纹图谱也就
各不相同,因此可用于混合微生物群落的研究 [ 26]。
本研究组近年来在对高产杂交水稻金优 611种子固
有细菌群落多样性探究过程中,利用 ARDRA技术
对培养方法所分离得到的 91株细菌进行分型,确立
不同的分类操作单元 ( operationa l taxonomy un i,t
OTU )后进行 16S rDNA系统发育分析,结果显示上
述 91株细菌分属为 10个属 16个种 [ 27]。ARDRA
技术的缺点是工作量大, 目前应用该方法进行微生
物群落结构分析,尚未设置重复性试验。
2. 3 16S rRNA基因克隆文库
构建 16S rRNA基因克隆文库是微生物生态学
中常用的研究方法之一 [ 28 ]。构建 16S rRNA基因文
库主要是将环境样品的基因组总 DNA进行 16S rD
NA PCR扩增,得到样品中不同微生物的 16S rDNA
的混合物,通过构建克隆文库分离不同的序列,再通
过测序与 GenBank数据库中已知菌种的 16S rDNA
序列进行比对, 从而该菌株的分类地位, 通过分析
rDNA片段的类型和出现频率, 可反映环境微生物
群落结构和多样性的信息 [ 29 ]。所构建的文库只要
71
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
库容足够大,就能充分反映环境中微生物的种类和
数量, 使得对所研究的样品中微生物群落结构有一
个全面客观的认识。该方法的缺点是工作量大,且
不利于对样品进行动态变化的观察。
本课题组在多年来利用 16S rRNA基因克隆文
库研究植物微生物生态学的基础上, 报道了基于
16S rDNA的系统发育分析在微生物进化关系中的
应用策略 [ 30] ,对系统发育树的构建进行了详细地介
绍,并对其在微生物进化研究中的具体应用进行了
阐述。
2. 4 变性梯度凝胶电泳 ( DGGE )
在现代分子生物学技术中, 变性梯度凝胶电泳
( denaturing grad ient gel electrophoresis, DGGE )技术
已经发展成为研究环境微生物群落组成及其亲缘关
系的主要分子工具 [ 31, 32] , 广泛用于比较微生物多样
性和种群的动态监视。目前 PCRDGGE技术已深
入到各个研究领域, 广泛应用于研究湖泊 [ 33 ]、海
洋 [ 34]、活性污泥 [ 35 ]、发酵食品 [ 36]及各种土壤 [ 37 ]等
生态环境中的微生态研究中,近年来随着植物相关
细菌研究的深入进行 [ 4] , 微生物生态学的研究领域
又深入到植物微生物生态学领域。
DGGE技术在植物微生物群落多样性及群落动
态变化的国内外研究进展以及引起 DGGE偏差的
因素及其解决方法本课题组已作过报道 [ 3]。此外,
本课题组利用 PCRDGGE技术研究两种基因型水
稻种子萌发过程 12- 96 h不同时间框架内种子际
( spermosphere)细菌群落动态变化情况。通过对
DGGE图谱中主要条带的序列分析结果显示,水稻
种子际细菌群落中均有两类细菌存在, 种子萌发过
程中来源于种子内生细菌的种子际细菌群落结构受
种子基因型、萌发时间等因素的影响。与母本相比,
杂交子代种子萌发过程中,种子萌发出芽时间较短,
种子分泌物较母本混浊, 种子际细菌群落结构更为
复杂, 细菌群落多样性更为丰富 (数据尚未发表 )。
2. 5 荧光原位杂交 ( F ISH )
上述分子生物学技术虽然能够快速、精确地揭
示植物微生物生态系统中微生物的种类和多样性,
然而这些方法无法提供微生物形态学、空间分布和
生物体细胞环境等信息,并且 PCR对环境样品分析
存在一定的偏差 [ 38]。荧光原位杂交 ( fluorescence in
situ hybridizat ion, FISH )技术是一种分子细胞遗传
学分析技术, 问世于 20世纪 70年代后期。它可用
于鉴定和定量分析特异微生物、测定不可培养微生
物的形态特征及丰度、诊断微生物群落空间结构与
群落动态;结合其他手段还可用于研究复杂环境中
的原位基因表达, 如启动子诱导及其表达的时序金
进程、生物膜上微生物的空间分布、混合菌群中特定
生物的代谢活性 [ 39]。
FISH技术可以再现微环境中完整细胞的景象
信息,具有更好的精确性,不需要额外的抽提和扩增
等, 被广泛应用于植物微生物多样性的研究工作中。
W att等 [ 40]用 FISH技术分析了小麦根系的固有细菌
及丝状菌的量及分布状况。空间分析表明细菌在根
部表面周围 11 m之内处于稳定状态, 40%在根部
丛生。定量分析表明在小麦根系细菌平均细胞量为
15. 4 ∀ 105 cell/mm3,丝状菌的量占总菌数的 4%。
近几年来, F ISH技术逐渐向生态学领域尤其是
微生物生态学领域渗透, 利用此技术已经在微生物
生态学研究中取得了一系列重大成果。但是, F ISH
技术也有其不足之处,样品自身产生的荧光,以及探
针的特异性都会影响试验的结果 [ 41]。随着技术的
不断进步, F ISH的准确性和灵敏度将进一步提高,
必将在植物微生物生态学研究领域得到更加充分的
应用。
3 结语与展望
现代生物化学与分子生物学技术在植物微生物
生态学研究中克服了微生物培养技术的限制, 可以
对样品进行较客观的分析, 较精确地揭示微生物的
种类和遗传多样性。随着生物化学与分子生物学技
术的发展,其中的一些技术方法已被广泛应用到了
植物微生物生态学的研究当中, 从而能够真实的反
应微生物的存在状态,给该领域的研究带来的光明
的前影。
但在实际的解决问题过程中,各种技术方法所
能解决的问题各有侧重, 如 F ISH 技术可以测定微
生物群落中特定种类的丰度及分布, 指纹图谱技术
可以分析微生物群落结构, rRNA序列分析可以在
基因水平鉴定微生物群落的组成。因此,只有将各
种方法综合利用, 才能够更加全面地提供植物微生
物生态系统中微生物群落组成及其变化方面的
72
2010年第 4期 左山等:现代生物化学与分子生物学研究技术在植物微生物生态学中的应用
信息。
总之, 现代生物化学与分子生物学技术和研究
策略已成为揭示植物微生物生态系统中微生物多样
性的真实水平及其物种组成,进行植物微生物生态
学各项研究的基础和核心。其发展将对进一步推动
微生物群落特征及其理论研究的发展具有重要的现
实意义。
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