全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
分子生物学技术在链霉菌分类中的应用
张楠1 张本峰2 于建2 刘训理2
(1山东农业大学生命科学学院，泰安 271018;2山东农业大学林学院，泰安 271018)
摘 要: 随着分子生物学的飞速发展，分子生物技术在链霉菌的分类方法中起到了越来越重要的作用，分子分类使链
霉菌的分类从传统的表型分类进入到各种基因型分类水平，基因型分类结合表型和系统发育的特征所组成的多相分类，能更
客观合理地反映生物间系统进化关系。分子分类研究主要包括(G + C)mol%测定、DNA 杂交、核酸结构分析、DNA 指纹图
谱分析和变性梯度凝胶电泳等。
关键词: 链霉菌 分子生物学技术 分子分类
Application of Molecular Biological Techniques in Streptomyces Taxonomy
Zhang Nan1 Zhang Benfeng2 Yu Jian2 Liu Xunli2
(1 College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Taian 271018;2 College of Forestry，
Shandong Agricultural University，Taian 271018)
Abstract: With the rapid development of molecular biology，molecular biological techniques play an important roles in the taxon-
omy of Streptomyces Molecular taxonomy makes the Streptomyces taxonomy into various genotypic classification standards from the tradi-
tional phenotypic classification Polyphasic taxonomy composed by genotypic classification combining with the characteristics of pheno-
type genotype and systematic growth can more objectively and reasonably reflect relations of biological evolution between the crea-
tures The methods of molecular taxonomy mainly include (G + C)mol%，DNA hybridization，DNA/RNA structure，DNA finger printing
and denaturing gradient gel electrophoresis
Key words: Streptomyces Molecular biological techniques Molecular taxonomy
收稿日期:2010-01-04
作者简介:张楠，在读博士，研究方向:环境微生物学;E-mail:nan25000@ 163 com
通讯作者:刘训理，教授，博士生导师，E-mail:xlliu@ sdau edu cn
链霉菌是一类细胞壁类型为 I 型、革兰氏阳性、
好气，G + C 摩尔百分比(mol%)为 69 － 78 的放线
菌。从 1943 年链霉菌建属以来，链霉菌属已成为细
菌域中种的数量最多的一个属。链霉菌是一种重要
的资源微生物，具有广泛的物种多样性和代谢多样
性，迄今发现的 12 000 余种微生物来源的新生理活
性物质中，有 55%以上的活性物质是由链霉菌产生
的［1］。为了寻找新的天然生物活性物质，大量的链
霉菌菌株被分离，但因国际上缺少可以接受的统一
的分类鉴定标准，导致了链霉菌分类的混乱局面。
1964 年开始启动的国际链霉菌计划(ISP)虽然构建
了链霉菌分类鉴定的模式，但并没有理清链霉菌种
的界限和种间亲缘关系。Williams 等［2］用 139 项表
型特征对包括 394 个链霉菌典型菌株在内的 475 株
菌进行了数值分类研究，减少了链霉菌种数。但这
并没有解决根本问题，且许多菌株并不与 Williams
构建的鉴别矩阵的参照菌株相符合。1981 年 Stack-
ebrandt等根据 16S rRNA 基因的相似性，核酸杂交
的结果，描绘了放线菌和其他生物之间的系统发育
树，标志着放线菌分类学分子分类(molecular taxon-
omy)时期的开始，同时也为分类学研究注入了新的
活力。现在链霉菌分类学研究正发展成为把传统的
表型分类(形态和生理生化特征)、数值分类、化学
分类和分子分类等各种信息综合考虑，来确定菌株
的分类地位的多相分类(polyphasic taxonomy)。现
就链霉菌分子分类的常用方法和优缺点进行综述。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
1 DNA碱基组成分析
DNA碱基组成比例［(G + C)mol%］是典型的
基因指征之一，并且通常认为属于细菌分类群的标
准描述不可或缺的部分［3］。一般认为(G + C)
mol%在种内不超过 5%，在属内不超过 10%。链霉
菌属于高 G + C 含量的生物，放线菌的(G + C)
mol%变化最多不超过 30%。由于(G + C)mol%在
不同生物中都是比较恒定的，因此它确实可作为诸
多分类指征不可缺少的一个，常作为属的分类鉴定
标准之一。但值得注意的是(G + C)mol%含量的
分析主要用于分析不确定的分类单元，而不是用它
去建立一个新的分类单元［4］。
测定 DNA (G + C)mol%的方法主要有熔点法
(也叫热变性法或 Tm值法)、浮力密度法、高效液相
色谱法等［5］，熔点法是常用的测定(G + C)mol%的
方法。
2 核酸杂交的分析
2 1 DNA-DNA杂交
总基因组 DNA的 DNA-DNA杂交即将不同的生
物样品的基因组 DNA 变成单链 DNA 后再进行复性
并测定其复性值。DNA的杂交值可反映出两基因组
间序列的相似性，DNA-DNA杂交同源性≥70%或同
源和异源杂合体分子间熔点温度差(ΔTm)≤5℃的那
些菌株可界定为同一个种的菌株［6］。在放线菌的分
类中，DNA-DNA分子杂交已被确定为建立新种的必
要依据之一。Witt 等用 DNA-DNA 杂交方法对链霉
菌属水平进行研究，发现链霉菌属菌株间 DNA-DNA
杂交结果介于 15% －97%之间，而与链轮丝菌属菌株
间杂交结果介于 17% －25%之间，由此将链轮丝菌并
入链霉菌属。但 DNA-DNA 杂交仅是分类学研究中
的一个指标，仅 DNA-DNA杂交的结果不能确定种与
种群关系［7］。
目前，DNA-DNA 分子杂交的方法可分为固相
滤膜法、液相羟基磷灰石法、液相复性速率法、S1 核
酸酶法等。
2 2 DNA-rRNA杂交
rRNA是研究系统进化关系的最好材料，具有
“分子计时器”功能［8］。它广泛存在于真核和原核
生物细胞中，在进化过程中，功能几乎保持恒定，而
且其分子排列顺序在有些部位变化非常缓慢，保留
了祖先的一些序列，即 rRNA 序列比 DNA 更保守。
因此 DNA 同源程度很低的两种微生物在 DNA-
rRNA杂交中有时会表现出很高的同源性，这使得
rRNA在分类研究和系统发育上具有 DNA-DNA 杂
交所不可比拟的优越性。DNA-DNA 同源性可以揭
示种间和种内的亲缘关系，而 DNA-rRNA 杂交在属
和属以上水平上则会发挥更大的作用［4］。
总之，DNA-DNA 和 DNA-rRNA 分子杂交技术
在种属水平上研究细菌、放线菌分类地位是一个强
有力的手段，可以用来解决传统分类方法难以解决
的问题。但是分子杂交技术必须以形态和分子分类
特征的结果为基础，这样才有针对性。
3 核酸结构的分析
3 1 16S rRNA / rDNA基因序列的分析
16S rRNA基因既高度保守，同时在某些区域变
异幅度又较大，因此 rRNA 基因全序列或部分序列
分析已在放线菌属、种及菌株水平的分类研究中得
到广泛应用，成为放线菌分类研究特别有效的工具。
其中位于原核细胞核糖体小亚基上的 16S rRNA 长
约 1 500 bp，结构和碱基排列复杂度适中，较易于进
行序列测定和分析比较，因此被广泛用作细菌之间
种属鉴定的依据［9］。Lane 等首先用反转录酶和测
序引物对 16S rRNA 进行测序，一般能获得 90%的
序列。现在则采用 PCR 技术和合适的引物对其测
序。对 16S rRNA 基因序列采用 Cluster analysis 方
法进行数据处理，构建进化树，可进行系统发育和进
化关系的研究。当两菌的 16S rRNA 相差 3%以上
时，可以认为它们不是同种，若小于 3%，则不能肯
定，需结合其它方法来确认。
16S rDNA是细菌染色体上编码 16S rRNA相对
应的 DNA 序列，存在于所有染色体，染色质上能转
录出 16S rRNA的基因。通过双向引物对总 DNA进
行 16S rDNA特异性扩增，然后与特定的质粒连接
进行克隆测序或用 PCR 产物直接测序。16S rDNA
序列分析已经成为研究细菌系统发育的自然分类系
统的主要依据之一［10］。例如，16S rDNA 作为对链
霉菌系统分类、探讨生物进化比较理想的材料，已被
广泛接受并应用。
值得注意的是，16S rRNA / rDNA 基因序列分
析在鉴定菌种时也存在着一定的局限性，仅根据该
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2010 年第 6 期 张楠等:分子生物学技术在链霉菌分类中的应用
指标并不能确定菌株的种属，必须结合其他的分类
指标。
3 2 看家基因序列分析
为弥补 16S rRNA /rDNA基因的缺点，人们开始
尝试使用其他不同的看家基因(gyrB、recA、ecfX、
hsp65、parE 基因等)进行原核生物的系统发育分
析［11］。蛋白质编码基因的分子进化，主要受到维持
氨基酸序列的保守性的限制，而由于遗传密码子在
第三位核苷酸上所具有的简并性使得 DNA 序列可
以发生较多替换而不改变其氨基酸序列。因此，在
属以下分类单元的系统发育分析和分类中，编码蛋
白质基因被认为是一种比 16S rRNA 基因更好的分
子靶标。但看家基因在微生物系统发育分析中的缺
点也同时存在，高度的变异性直接导致了 PCR引物
通用性的减低，进而导致各类看家基因在不同类群
中的可操作性降低［12］。
3 3 转录间隔区序列的分析
转录间隔区(intergenic spacer regions，ISR)序列
是指 rRNA操纵子中位于 16S rRNA和 23S rRNA以
及 23S rRNA和 5S rRNA之间的序列。人们发现不
同菌种 16S rRNA － 23S rRNA 间隔区两端(即 16S
的 3′端和 23S 的 5′端)均具有保守的碱基序列。
16S rRNA －23S rRNA 转录间隔区序列的进化速率
比 16S rRNA大 10 倍，同一菌种不同菌株的 ISR 是
不同的，因此 ISR 可用于菌株的鉴别［13］，是 16S
rRNA基因分析很好的补充。但是 16S rRNA － 23S
rRNA的不同拷贝之间大小比较相近且不易区分，
需要采取有效的手段，以确保能够扩增出所有的拷
贝。目前在链霉菌分类学中该项技术应用于种以下
分类单元的鉴定［14］。
3 4 RNA二级结构的分析
人们对 RNA二级结构作了大量比较研究，发现
RNA二级结构内具有丰富的可用于分类和系统发
育分析的信息如茎环结构等，比较典型的是 16S
rRNA。首先，16S rRNA 的二级结构比一级结构更
为保守，甚至在古细菌和真核生物之间区别也很小，
因此二级结构的不同可能暗示着系统发育的多样
性;其次，16S rRNA 二级结构具有很多一级结构无
法体现出来的特征，这些特征具有特殊而重要的生
物学意义，并且表现出种属特异性。Chen 等［15］利
用 16S rRNA二级结构的 6、10、12 螺旋区结构特征
信息对水生栖热菌进行了种的水平上的分类，成功
地将 38 株水生栖热菌划分到 18 个种内。Ishikawa
利用 16S rRNA V6 区作为 Marinilactibacillus 区别于
与之相近属的一个重要依据，建立了一个新属。近
来，5S rRNA 的二级结构越来越被人们重视起来，
Vijai等［16］利用 5S rRNA的二级结构模拟分析对原
核生物系统发育进化进行了研究，结果显示，RNA
二级结构可能会进一步促进了解细菌进化的复杂
性，5S rRNA的基因区域自由能有助于预测细菌进
化的过程。但由于 RNA 二级结构模型仍不是十分
完善，该项指征在链霉菌分类学领域还没有得到普
遍推广，随着相关研究的不断深入，16S rRNA 和 5S
rRNA二级结构作为一个新的分类指标，将成为系
统分类的一个重要补充。
4 基于 DNA指纹图谱的分析
4 1 rep-PCR指纹分析技术
重复片段 PCR 基因指纹分析(repetitive-ele-
ment PCR genomic fingerprinting，rep-PCR)是一种以
DNA为基础的分型方法，目前应用于 PCR的重复序
列主要是 BOX 片段，大小为 154 bp，是由保守性不
同的亚序列组成。按照 BOX 片段中亚单位设计的
寡核苷酸引物进行 PCR，使得位于重复序列之间的
不同基因区域得以选择性扩增，得到大小不等的
DNA扩增片段，通过对 PCR产物进行电泳图谱分析
获得分类学信息，即可实现种及以下水平的分类和
快速鉴定，尤其适用于分析大量的菌株或分离株。
张建丽等［17］对 150 株链霉菌典型菌株进行了 rep-
PCR基因指纹分析，在种及菌株水平上反映出链霉
菌属的基因型、系统发育和分类关系，在一定程度上
与 16S rDNA序列比较结果相一致。
rep-PCR方法因其操作简单、快速、灵敏、同一
实验室内重复性高，在遗传多样性研究及鉴定同源
性很近的菌株时是一个有效的方法。该技术已用于
链霉菌有关属的分析并获得了较好结果［18］。但因
在不同的实验室之间，rep-PCR的重复性不是很好，
难以代替 16S rDNA序列分析来确定新分离微生物
在大量已存在的微生物中的位置。rep-PCR 方法分
辨能力虽然低一些，但在不经过微生物分离培养的
原位微生物多样性的研究中仍具有重要的作用。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
4 2 RAPD分析
随机扩增多态性 DNA 分析(random amplifica-
tion polymorphic DNA，RAPD)是 1990 年由Willianms
发明的一种分子生物学方法。用一系列不同的随机
排列的寡聚核酸单链为引物，对于所研究的基因组
DNA进行扩增。RAPD 可对链霉菌进行快速、简便
聚类和鉴别分析，但随机引物序列对结果的影响较
大。Huddleston 在用 RAPD 对微黄白色链霉菌种群
进行研究时证明当 RAPD 条件优化后，可用于链霉
菌种水平的研究。
RAPD技术优点是可以在对于所研究的物种没
有任何分子生物学基础的情况下，对其进行 DNA的
多态性分析。该方法可以简单快速地对菌株进行聚
类分析，但是反应条件需进行严格控制，以确保结果
的可比性。随机引物序列对结果的影响较大，已经
证实即使当引物中只有 1 个碱基取代也会导致指纹
图谱的变化。
4 3 PCR-RFLP分析
限制性片段长度多态性(restriction fragment length
polymorphism，RFLP)是 Botstein 等于 1980 年首先提
出来的一种 DNA分析技术，它的原理是基于 DNA序
列的变化引起酶切位点的改变，从而使两个酶切位点
间的 DNA片段长度发生变化。人们将 PCR 技术与
RFLP分析结合，即利用 PCR技术扩增普遍存在于菌
株中的保守基因区域，再用特异的限制性内切酶对得
到的基因片段进行酶切、电泳和图谱分析。
目前 16S rDNA PCR-RFLP已是放线菌分类中应
用最广的快速分群方法，张海涛等［19］曾用该法对海
绵中放线菌进行了种属分群，并取得不错的结果。该
法的结果与 16S rDNA序列分析具有很好的一致性，
且避免了序列测定等步骤，在普通实验室即可进行。
其缺点是 DNA酶切片段组分往往较复杂，难以比较
遗传学关系较近的菌株。
4 4 AFLP指纹分析技术
扩增性片段长度多型性分析(amplified fragment
length polymorphism，AFLP)技术是由荷兰的 Zabeau
发现的，并由 Vos发展起来的一种检测 DNA多态性
的新方法。该技术采用一对限制性内切酶消化
DNA，产生一系列 DNA 限制性内切酶片段，以此为
模板，用选择性引物进行扩增，得到 AFLP 指纹图
谱。利用该方法在不需要预先知道 DNA 序列信息
的情况下就可以同时进行多数 DNA 酶切片段的
PCR扩增。目前，该技术在微生物的分类鉴定上得
到了广泛的应用。Lanoot等［20］曾采用 AFLP技术对
链霉菌的原始菌株和突变菌株进行分析，能够很好
的将他们区分开来，并证明 AFLP 技术在链霉菌菌
种鉴定上是一种方便有效的工具。
AFLP的特点主要表现在它结合了 RFLP 和
RAPD的优点，方便快速，只需要极少量 DNA 材料，
不需要 Southern杂交，试验结果稳定可靠，可以快速
获得大量的信息;而且再现性高，重复性好，因而适
合指纹图谱的绘制，遗传连锁图的构建及遗传多样
性的研究。但 ALFP 操作比较繁琐，加之其检测基
于基因组上酶切位点的变化，制约了其在相关领域
的应用。
4 5 PCR-DGGE技术
变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel elec-
trophoresis，DGGE)是由 Fischer 和 Lerman 于 1979
年最先提出的用于检测 DNA突变的一种电泳技术。
其原理是在碱基序列上存在差异的不同 DNA 双链
解链时需要不同的变性剂浓度，DNA 双链一旦解
链，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下
降，可以在凝胶上呈现分开的条带［21］。张宝良
等［22］利用 PCR-DGGE技术对油污土壤中微生物种
群动态进行分析，结果显示在石油污染土壤中主要
存在的放线菌为链霉菌属。
PCR-DGGE有分辨率高、加样量小、重复性好、
节约时间和操作简便快速等特点。但 PCR-DGGE
也有一定的局限性，如 DNA的片段不能太大等。因
此，PCR-DGGE技术与其他生物技术相结合，将能
更实际地反映微生物群落的结构、功能和动态变化，
提供微生物的空间分布、群落演替、原位生理
等信息。
4 6 PCR-SSCP技术
单链构象多态性(single-strand conformation pol-
ymorphism，SSCP)由日本科学家 Orita 于 1989 年建
立。该技术是指单链 DNA依靠单链内碱基配对，分
子内相互作用而呈现复杂的立体构象，等长的 DNA
片段因其序列中核苷酸的组成和排列顺序不同，形
成的构象不同，在进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
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2010 年第 6 期 张楠等:分子生物学技术在链霉菌分类中的应用
时，表现出不同的迁移率，得到不同带型。王爱杰
等［23］利用 PCR-SSCP 技术对活性污泥微生物群落
结构进行分析，能够快速、简便地获得功能微生物及
其与非功能微生物之间关系的有效信息。Zhou［24］
利用 PCR-SSCP技术鉴定出两株新的菌株。
PCR-SSCP的优点在于操作简单、成本较低和
周期短等。但该技术不能识别突变位置且检测存在
假阴性。目前，PCR-SSCP仍不十分成熟，限制其普
遍性的应用。
4 7 其他的 DNA指纹图谱技术
其他的 DNA指纹图谱技术有属特异引物的扩
增(genus-specific primer PCR)［25］和对一些功能基
因进行定位 PCR 分析等，这些技术均具有操作简
单，鉴定迅速，重复性好等特点，提高了鉴定的准确
性，因此在国外已被应用于微生物分类学研究。
5 结语
链霉菌分类学的研究已经从表观现象到基因
本质逐步深入，分子生物学技术在链霉菌分类学
中起着越来越重要的作用。目前，一些已经完善
的分子生物学技术，如核酸序列测定，核酸杂交等
已成为链霉菌分类研究的基本方法。相信随着理
论研究的不断深入和相关技术的不断发展，会有
更多的分子生物学技术，如 RNA 二级结构测定等
将在分类学领域发挥更大的作用。这些新兴的方
法与传统的分类方法相结合，互相交叉，彼此补
充，必将促进链霉菌分类学的不断发展，使链霉菌
分类体系日臻完善。
参 考 文 献
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98
2010 年第 6 期 姜大刚等:转基因水稻外源基因的漂移研究
其他不育系。本研究中外源基因漂移的频率明显高
于 Jia 等的结果，原因应为水稻开花期的高温保证
了培矮 64S稳定的雄性不育(在可能接受外来花粉
的条件下，其结实率仍低于 10%) ，以至更容易接受
来自转基因供体的花粉。
刁立平等［8］用传统形态性状标记的方法检测
了正常育性水稻的异交率，发现水稻的异交率在
1% － 2%之间。不同品种的水稻具有不同的异交
率。因此，花粉受体的异交率可能是影响水稻基因
漂移频率的主要的限制因子之一，在其他因素都固
定的情况下，如果花粉受体的异交率较高，那么该受
体的基因漂移频率也相对较高。对于常规品种华航
1 号而言，其漂移频率基本都在 2 0%以下，这与文
中讲到的水稻的异交率在 1% －2%之间一致。
分析本研究三造的数据，可见随着距离的增加，
外源基因漂移的频率逐渐下降，这是因为随着与转
基因花粉源距离的增大，空气中的花粉密度逐渐降
低［9］。而同时，在转基因水稻周围存在非转基因水
稻，不同来源花粉此消彼长的结果导致了转基因漂
移频率的迅速下降。从试验结果可以得出，距离隔
离可以非常有效地降低转基因水稻向非转基因水稻
的基因漂移频率;而且，向不育系的漂移频率远远高
于常规稻。可以认为，种植转基因水稻地区的周围
应尽量不种植水稻雄性不育系，或者通过物理隔离、
错开花期等手段，以减少乃至防止混杂或漂移的
发生。
本研究的几次试验中，在 4 m 处漂移频率均存
在一个高峰值，高于其相邻距离的漂移频率，可能是
由于花粉的运动规律造成的，花粉的运动受花粉颗
粒的沉降速度、风速和垂直扩散系数等一系列复杂
的因子影响。本试验中可能在间隔 4 m 时，花粉落
下的概率比在 3 m 和 5 m 处均相对较高，这就造成
了在这 3 个相邻的距离中，4 m 处所得到的转基因
漂移频率高从而形成一个峰值，该结论与其他研究
者的数据基本一致［4］。
致谢:感谢华南农业大学农学院王慧老师提供培矮 64S
和华航 1 号水稻种子。
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