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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第7期
三 角 帆 蚌（Hypriosis cumingii） 隶 属 双 壳 纲
（Bivalvia）、蚌科（Unionidae）、帆蚌属（Hypriosis），
是我国重要的淡水育珠蚌，主要分布于洞庭湖、太
湖和鄱阳湖等大中型湖泊及其流域中［1］。自 1979 年
人工繁殖成功，三角帆蚌已成为我国最重要的经济
淡水珍珠蚌［2］。目前我国淡水珍珠年产量达 1 800
收稿日期 ：2013-01-02
基金项目 ：国家科技支撑计划课题（2012BAD26B04），上海市高校知识服务平台项目（ZF1206）
作者简介 ：林静云，女，硕士研究生，研究方向 ：水产动物遗传育种 ；E-mail ：ljy19890910@163.com
通讯作者 ：李家乐，男，教授，研究方向 ：水产动物种质资源与种苗工程 ；E-mail ：jlli2009@126.com
三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）Perlucin 蛋白原核表达
条件的优化及表达产物的鉴定
林静云  白志毅  李家乐
（上海海洋大学水产与生命学院 农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306）
摘 要 ： 采用 PCR 方法从三角帆蚌外套膜 cDNA 中扩增 perlucin 基因的开放阅读框，连接到 pET-28a 表达载体，转化大肠杆
菌 BL21（DE3），经 IPTG 诱导表达重组融合蛋白 pET-28a-Hcperlucin。通过优化培养温度、IPTG 浓度以及诱导时间，得出重组融
合蛋白的最佳表达条件分别为 ：37℃、0.1 mmol/L IPTG、6 h。重组融合蛋白主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE 和 Western blot 分
析结果表明，表达重组融合蛋白的相对分子量与预测值相符，约为 21 kD，并能与鼠抗 His-tag 单克隆抗体进行特异性结合，表明
重组融合蛋白构建成功。
关键词 ： 三角帆蚌 Perlucin 原核表达 Western blot 分析
Purification and Optimization of Prokaryotic Expression of Perlucin
Protein in the Freshwater Pearl Mussel，Hyriopsis cumingii
Lin Jingyun Bai Zhiyi Li Jiale
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources Certificated by Ministry of Agriculture，College of Fisheries and Life Science，
Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）
Abstract:  Perlucin was originally isolated from nacre of abalone inner shell and improved to promote calcium carbonate precipitation at
ambient conditions, nucleate the calcium carbonate crystallization and modify the morphology of calcium carbonate crystals. The open reading
frame（ORF）of the perlucin gene was amplified from the mantle cDNA of the freshwater pearl mussel, Hyriopsis cumingii. The ORF from this
species was ligated into the expression plasmid pET-28a. Following transfer of the recombinant plasmid into host bacteria, Escherichia coli BL21
（DE3）cells, the recombinant pET-28a-Hcperlucin protein was expressed by induction with isopropyl-β-thiogalactopyranoside（IPTG）. SDS-
PAGE analysis showed that inducing the cells at 37℃ in 0.1 mmol/L of IPTG for 6 h was the optimal conditions for expression of the recombinant
pET-28a-Hcperlucin protein. Inclusion body was the main existence form of the recombinant protein. The expression products were detected by
SDS-PAGE and Western blot. The results showed that the recombinant expression plasmid of pET-28a-Hcperlucin, expressing a 21 kD protein
that could be recognized by mouse anti-His-tag Mab, was successfully constructed.
Key words:  Hyriopsis cumingii Perlucin Prokaryotic expression Western blot analysis
多吨，占世界淡水珍珠总产量的 95% 以上，占我国
珍珠总产量的 98% 以上［3］，其中超过 90% 的淡水
珍珠产自于三角帆蚌［4］，但产值仅占世界 10%。这
种产量与产值强烈反差的现象主要是由我国珍珠质
量不高所致［5］，从而严重制约了产业的健康发展。
因此寻找提高珍珠质量的新措施，尤其是运用生物
2013年第7期 115林静云等 ：三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）Perlucin 蛋白原核表达条件的优化及表达产物的鉴定
学技术手段，是珍珠产业发展的迫切需求。而建立
提高珍珠质量的新的生物学措施则必须阐明珍珠的
形成机理，目前对于珍珠形成机理的研究主要集中
在贝壳上，这是因为贝壳和珍珠在微观结构和化学
组成上被认为是相同的物质［6］。
贝壳由大约 95% 的文石和 5% 的有机大分子复
合而成，其中有机大分子包括基质蛋白和其他的一
些生物高聚物［7］。基质蛋白虽然所占组分很少，但
它不仅能够参与有机珍珠层框架的构建，决定碳酸
钙晶体的多型构象，还控制着文石晶体的成核与生
长［8，9］。基质蛋白在外套膜中的表达与其在贝壳中
的分布相对应，具有区域化的特点。外套膜边缘分
泌的基质蛋白参与了棱柱层的形成，为棱柱层基质
蛋白 ；外套膜中央分泌的基质蛋白主要参与珍珠层
的形成，为珍珠层基质蛋白。根据基质蛋白在贝壳
中的分布和外套膜中表达的区域性的特点，可以明
确所发现的基质蛋白的分类和功能。例如，MSI60
在外套膜中部特异性地表达，是贝壳珍珠层基质蛋
白，参与珍珠层的形成 ；MSI31 特异性地表达在外
套膜的边缘，是棱柱层基质蛋白，参与棱柱层的形
成［10］；nacrein 基因在外套膜的中部与边缘均有表达，
属于两者共有的基质蛋白［11］。
Perlucin 基质蛋白是从鲍的珍珠层中最先分离
得到的，属于珍珠层基质蛋白，具有提高碳酸钙
晶体形成速度，修饰晶体形态等功能。它不仅是
珍珠层的组成部分，也是对贝壳和珍珠的形成具
有重要功能的大分子［12，13］。然而在淡水珍珠蚌中
对于 perlucin 基因的研究却未见报道，为了进一步
了解 Perlucin 蛋白对珍珠形成的作用，本试验构建
Perlucin 蛋白原核表达质粒，优化该表达质粒的诱导
条件，并通过 Western blot 技术进行鉴定。以期为进
一步研究三角帆蚌 Perlucin 蛋白的生理功能、结构
特点和作用原理提供基础理论。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞 DH5α、
BL21（DE3）、 异 丙 基 -β-D-硫 代 半 乳 糖 苷（IPTG）
和硫酸卡纳霉素购自上海天根生化科技公司。限制
性核酸内切酶 BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和 T4 DNA 连接酶
购自 NEB 公司。NC 膜购自 Bio-Rad 公司。鼠抗 His-
tag 单抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 IgG 及
DAB 显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
pMD19-T Vector 与其他常规生化试剂均购自大连宝
生物工程有限公司。原核表达载体 pET-28a 为本实
验室保存。PCR 引物均由上海生工生物技术有限公
司合成。
1.2 方法
1.2.1 perlucin 基因 ORF 的克隆及重组表达质粒 pET-
28a-Hcperlucin 的构建 根据本实验室已克隆得到
的三角帆蚌 perlucin 基因全长 cDNA 序列（GenBank
登录号 ：KC436008），利用 Primer Premier 5 软件设
计一对特异性引物。其中上游引物 PerF 为 ：5-CG-
GGATCCATGGATTTCTCATTGATATTCGT-3（ 下 划
线 为 BamH Ⅰ 酶 切 位 点 ）， 下 游 引 物 PerR 为 ：5-
CGCGAATTCCTAAGACCGTGCCTGACAGAT-3（下划
线为 EcoR Ⅰ酶切位点，斜体为终止密码子）。以
三角帆蚌 cDNA 第一条链为模板，用包含酶切位
点的特异性引物 PerF、PerR 扩增三角帆蚌 perlucin
基因 ORF 的全长。PCR 反应条件为 ：94℃预变性
3 min ；94℃ 30 s，59℃ 1 min，72℃ 1 min，共 30 个
循环 ；最后 72℃延伸 10 min。PCR 产物纯化后连接
到 pMD19-T Vector 后转化 E. coli 感受态细胞 DH5α，
摇菌提取质粒，用限制性酶 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ分
别双酶切处理带有目的片段的 pMD19-T 和 pET-28a。
酶切片段与线性化质粒 pET-28a 连接并转化 E. coli
感受态细胞 BL21（DE3）。使用菌落 PCR 筛选阳性
克隆，进一步通过双酶切鉴定。同时将阳性克隆测
序鉴定，以确定插入序列正确。
1.2.2 细菌培养及重组蛋白表达 将经过鉴定过的
工程菌接种于 4 mL LB 液体培养基（含硫酸卡那霉
素 50 μg/mL）中，37℃振荡培养过夜。按 1∶50 的
比例扩大培养，至 OD600 介于 0.4-0.6，加入终浓度
1 mmol/L IPTG 37℃诱导表达 4 h，取 20 mL 菌液离
心收集菌体，超声破碎，离心后取上清，沉淀用 8
mol/L 的尿素溶解，以 SDS-PAGE（浓缩胶浓度 50
mg/mL，分离胶浓度 12 mg/mL）分析重组蛋白表达
情况。同时设置未诱导的工程菌作为阴性对照。
1.2.3 最佳诱导温度试验 取过夜培养的转化菌
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期116
液 BL21 按 1∶50 的 比 例 扩 大 培 养， 至 OD600 介 于
0.4-0.6，加入终浓度为 1 mmol/L IPTG 诱导表达。在
30℃、37℃和 42℃条件下诱导 4 h 后各取 20 mL 菌
液离心收集菌体，超声破碎，对离心后的沉淀以
SDS-PAGE 分析目的蛋白表达的最佳温度条件。
1.2.4 最佳诱导时间试验 细菌培养方法同上，当
OD600 介 于 0.4-0.6 时， 在“1.2.3” 确 定 的 目 的 蛋
白表达的最佳温度条件下加入终浓度为 1 mmol/L
IPTG，分别于诱导 0、2、4、6、8、10 和 12 h 后各
取 20 mL 菌液，以 SDS-PAGE 分析目的蛋白的表达量，
确定目的蛋白表达的最佳诱导时间。
1.2.5 最佳诱导剂浓度试验 细菌培养方法同上，
在“1.2.3”和“1.2.4”确定的最佳诱导温度和诱导
时间条件下，加入不同浓度的 IPTG，使其终浓度分
别为 0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5 和 2.0 mmol/L 7 个
浓度梯度，以 SDS-PAGE 分析目的蛋白的表达量，
确定目的蛋白表达的最佳 IPTG 诱导浓度。
1.2.6 Western blot 分析鉴定 重组融合蛋白经 SDS-
PAGE 电泳后转至 NC 膜上。NC 膜浸泡于封闭液中
于室温放置 1 h 后，用鼠抗 His-tag 单抗与之于 4℃
条件下反应过夜，二抗为辣根过氧化物酶标记的
山羊抗鼠 IgG，各步骤之间用含体积分数 0.1% 的
Tween-20 的磷酸缓冲液（TTBS）洗膜 4 次，每次 10
min，最后用二氨基联苯胺（3，3-diaminobenzidine，
DAB）显色液显色至有清晰的目的条带出现并拍照。
2 结果
2.1 perlucin基因原核表达载体的构建与鉴定
PCR 扩增到约 483 bp 的基因片段。将回收纯
化的目的片段转入 pMD19-T Vector 后，构建 pMD-
19T-Hcperlucin 重组质粒，对该质粒进行 BamH Ⅰ和
EcoR Ⅰ双酶切，将酶切产物中的目的片段与表达载
体 pET-28a 连接，并转化至大肠杆菌 BL21 感受态细
胞，构建 pET-28a-Hcperlucin 重组表达质粒，菌落
PCR 扩增出与预期结果 483 bp 大小一致的特异性条
带（图 1-A）。对该重组表达质粒进行双酶切鉴定，
也得到一条长约 483 bp 的条带（图 1-B），与预期大
小一致。对酶切鉴定正确的阳性克隆进行测序，序
列比对结果正确，表明原核表达载体 pET-28a-Hcpe-
rlucin 已构建成功。
2.2 三角帆蚌perlucin重组融合蛋白在大肠杆菌中
的表达及表达条件优化
2.2.1 重组融合蛋白表达 收集的工程菌经超声破
碎，分离上清和沉淀，进行 SDS-PAGE 电泳分析。
与未经诱导的工程菌相比，经过 IPTG 诱导后，菌体
蛋白沉淀泳道处多出 1 条明显条带，其大小与预测
的重组蛋白分子量相近，约 21 kD，而上清泳道则
无相应的条带（图 2），表明重组融合蛋白主要以包
涵体形式存在。
2500
1000
483
bpbpbp 1 M1 1 M2
750
500483
250
100
A B
2500
15000
bp
10000
5000
7500
2000
1000
750
500
250
100
M1 ：DL2000 DNA Marker ；1 ：pET-28a-Hcperlucin 阳性克隆 ；M2 ：DL15000
DNA Marker ；2 ：pET-28a-Hcperlucin BamH I 和 EcoR I 双酶切
图 1 重组质粒 pET-28a-Hcperlucin 菌液 PCR 鉴定（A）
及双酶切鉴定（B）
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kD M 1 2 3 4 5 6 7 8
60
45
27
18
Perlucin䟽㓴㶽ਸ㳻ⲭ
M ：蛋白分子量标准 ；1，2 ：pET-28a-Hcperlucin 未诱导裂解后上清和沉淀 ；
3，4 ：pET-28a-Hcperlucin 诱导裂解后上清和沉淀 ；5，6 ：pET-28a 未诱导
裂解后上清和沉淀 ；7，8 ：pET-28a 诱导裂解后上清和沉淀
图 2 pET-28a-Hcperlucin 重组蛋白的表达分析
2.2.2 最佳诱导温度 在其他条件一致的情况下，
不同诱导温度下重组融合蛋白的表达量的结果（图
3）表明，37℃条件下蛋白表达量明显高于 42℃下
的表达量，而 30℃条件下的表达量很低。所以该重
组融合蛋白的最佳诱导温度是 37℃，并且以包涵体
形式表达。
2.2.3 最佳诱导时间 诱导时间是影响重组融合蛋
白表达量的重要因素之一，在其他条件一致的情况
2013年第7期 117林静云等 ：三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）Perlucin 蛋白原核表达条件的优化及表达产物的鉴定
下，经不同时间（0-12 h）诱导后，诱导时间在６h
以内，重组融合蛋白的表达量随着时间的延长而增
高，但是随着诱导时间的延长，重组融合蛋白表达
量呈现下降趋势（图 4）。这表明长时间诱导不但不
能提高重组蛋白表达量，还使表达量下降，故该重
组融合蛋白的最佳诱导时间是 6 h。
3 讨论
由于大肠杆菌具有易于培养、繁殖快、表达量高、
成本低、易纯化、遗传背景清楚等优点，因此以大
肠杆菌为载体的原核表达系统目前被广泛采用，成
为高效表达研究的首选体系，其中 BL21 是应用最
广的宿主菌［14］。pET-28a 载体的 N、C 端带有 His-
tag，有利于表达蛋白纯化和鉴定，且不影响重组融
合蛋白的结构和功能，是抗原蛋白表达常用载体。
因此本研究选用 pET-28a 为原核表达载体，将三角
帆蚌 perlucin 基因的 ORF 序列连接到载体上，导入
大肠杆菌 BL21 中，成功获得 pET-28a-Hcperlucin 重
组质粒，并通过对诱导温度、诱导时间和诱导剂浓
度的优化，提高了蛋白的表达量。同时根据载体上
的 6 个 His 标记，通过与 His-tag 单克隆抗体结合进
行 Western blot 鉴定蛋白，确认所得蛋白为目的蛋白。
试验结果表明，重组融合蛋白在 37℃、诱导 6
h、IPTG 浓度为 0.1 mmol/L 的条件下能大量表达目
的蛋白，但主要以包涵体的形式存在。重组大肠杆
菌在 30℃时为最适表达温度，37℃为最适的细菌生
长温度［15］。然而，在本试验中，重组蛋白在 30℃
的时候表达产物量远远低于 37℃，而盘鲍中该重组
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Perlucin䟽㓴㶽ਸ㳻ⲭ
M ：蛋白分子量标准 ；1-3 分别为 30℃、37℃和 42℃超声裂解的沉淀
图 3 不同温度诱导表达的 SDS-PAGE 分析
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kDM1 2 3 4 5 6 7
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Perlucin䟽㓴㶽ਸ㳻ⲭ
M ：蛋白分子量标准 ；1-7 ：分别为诱导 0、2、4、6、8、10 和 12 h 后的超
声裂解的沉淀
图 4 不同时间诱导表达的 SDS-PAGE 分析
2.2.4 最佳诱导浓度 在其他条件一致的情况下，
不同浓度的 IPTG（0.1-2.0 mmol/L）均可明显诱导
重 组 融 合 蛋 白 的 表 达。 浓 度 在 0.1-1.0 mmol/L 的
IPTG 诱导的重组融合蛋白表达量变化不大，但在 1.5
mmol/L 和 2.0 mmol/L 的浓度下，表达量明显下降（图
5）。由于高浓度 IPTG 不利于细菌生长，因此该重组
融合蛋白的 IPTG 最佳诱导浓度是 0.1 mmol/L。
2.3 重组融合蛋白的Western blot鉴定
在优化的表达条件下，对重组融合蛋白进行
Western blot 分析（图 6）显示，重组融合蛋白可与
His-tag 单克隆抗体结合，表现出与重组融合蛋白大
小一致的条带，结合 pET-28a-perlucin 质粒的测序结
果可推断，已成功表达三角帆蚌 Perlucin 蛋白。
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kD
M 1 2 3 4 5 6 7 8
60
45
27
18
Perlucin䟽㓴㶽ਸ㳻ⲭ
M ：蛋白分子量标准 ；1-8 ：分别为 0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5 和 2.0
mmol/L IPTG 诱导后超声裂解的沉淀
图 5 不同 IPTG 浓度诱导表达的 SDS-PAGE 分析
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kD M 1
Perlucin䟽㓴㶽ਸ㳻ⲭ
60
45
27
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M ：预染蛋白分子量 ；1 ：37℃、6 h、0.1 mmol/L IPTG 诱导后超声裂解的沉淀
图 6 用 His-tag 单克隆抗体进行 Western blot 分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期118
蛋白在 37℃同样能够得到较好的表达［16］，这说明
重组蛋白最佳诱导温度可能受到插入目的基因的影
响。诱导剂 IPTG 会阻遏蛋白不能与操纵基因结合，
使外源基因大量表达，但高浓度的 IPTG 诱导会阻碍
蛋白的表达［17］。本试验的诱导结果同时说明长时间
的诱导并不能进一步提高蛋白的表达量。而 IPTG 的
浓度在 1.0 mmol/L 的范围内也不会对重组融合蛋白
表达产生较大影响。IPTG 虽然对细胞没有毒害作用，
但可以通过改变培养基的酸碱度，从而抑制细菌生
长［18］。因此，在表达量相差不大的情况下，应选
用浓度较低的 IPTG 进行诱导。Western blot 结果显
示，重组融合蛋白 pET-28a-Hcperlucin 可与鼠抗 His-
tag 单抗特异性结合，说明本研究获得了 pET-28a-
Hcperlucin 表达产物。这为抗体制备、体外结晶试验、
进一步探究 Perlucin 蛋白的生理功能、结构特点和
作用原理提供了研究基础。
4 结论
将三角帆蚌 perlucin 基因序列连接到表达载体
pET-28a 中，IPTG 诱导重组融合蛋白 pET-28a-Hcpe-
rlucin 在大肠杆菌中表达。重组融合蛋白 pET-28a-
Hcperlucin 的最优表达条件为 37℃、诱导 6 h、IPTG
浓度为 0.1 mmol/L。通过与鼠抗 His-tag 单克隆抗体
结合进行 Western blot 鉴定，确认所得为目的蛋白。
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（责任编辑 马鑫）