全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-12-06
基金项目:上海市重点学科建设项目(Y1101),上海市科委基础重大项目(06aj14003),上海市属高校自然科学研究重大项目(01H02)
作者简介:施志仪(1954-),男,理学博士,教授,博士生导师,主要从事水产动物生物技术,海洋药物研究,E-mail:zyshi@shfu.edu.cn
珍珠的价值与其大小、形状、光泽有关,8mm以上光泽度好的正圆珍珠在国内外市场十分关注,一般都以
颗论价[1,2]。珍珠生产中无核珍珠的培育大多产生不规则且小型珍珠,因此近年来淡水有核珍珠的培育随之发
展起来[1~6]。三角帆蚌(Hyriopsiscumingi)为我国主要淡水育珠蚌之一[3],其有核珍珠多采用外套膜内插核的方
法,但三角帆蚌外套膜比较薄,容易插破,不适宜于插大核来培育大颗粒的珍珠;然而三角帆蚌内脏团分布空
间很大[3],如果在三角帆蚌内脏团插核培育有核珍珠能成功,培育的产品可与大型的南洋珍珠相媲美。
三角帆蚌内脏团有核珍珠的培育与珍珠培育部位的组织结构及其生化环境有密切的关系。因此,拟对
内脏团珍珠培育部位组织结构及其与珍珠形成相关的生化环境特性进行研究,以期为三角帆蚌内脏团特
大型珍珠的插核培育提供基础性资料。
1 材料与方法
1.1 材料
所用三角帆蚌采自诸暨珍珠养殖场,为 3龄健壮、成熟的育珠蚌。
三角帆蚌内脏团珍珠培育部位的生物性状研究
施志仪 谢先中 何秀娟
(上海水产大学生物技术研究中心,上海 200090)
摘 要: 用光镜对三角帆蚌内脏团珍珠培育部位进行组织学观察,该部位组织结构随性腺发育在不同时期发生变
化:性腺发育前期,性腺滤泡萎缩,滤泡间充填丰富的结缔组织和平滑肌组织;发育后期,性腺滤泡丰满,滤泡间结缔组织
和平滑肌减少。生化分析显示钙、蛋白、碱性磷酸酶、碳酸脱水酶在内脏团珍珠培育部位均有分布,但钙的含量比常规外
套膜插核的部位少。研究结果说明内脏团具有珍珠生物矿化所需的生化条件,内脏团培育珍珠是可行的;但由于性腺组
织的发育及钙贮存的不足会影响内脏团内珍珠的培育。
关键词: 三角帆蚌 内脏团 生物性状 珍珠培育
StudyontheBiologicalCharacteristicofPartCulturingPealin
VisceralmassofHyriopsiscumingi
ShiZhiyiXieXianzhong HeXiujuan
(ResearchCenterBiotechnology,ShanghaiFisheriesUniversity,Shanghai200090)
Abstract: ThehistologyofvisceralmasofHyriopsiscumingiwerestudiedbyopticalmicroscopes.Withthe
developmentofgonad,thevisceralmashistologyocuretochang;inearlierdevelopmenticperiod,gonadfoliclebecomed
wither,inwhichabundanceconnectivetisuesandsmoothmusclehad.Inmaturation,thefoliclebecomedplentiful,and
theconnectivetisuesandsmoothmusclereduced.Thebiochemicalanalysisshowedthatthevisceralmas contained
calcium andproteinandalkalinephosphataseandcarbonicanhydrase,butalitlecalcium incomparisonwithmantlein
whichabundantcalcium.Theresearchshowedthatvisceralmas hadtheesentialbiochemicalconditionofbiological
mineralizationtoform pearl.Butbecausethedevelopmentofgonadtisuesandshortofcalcium invisceralmas,pearl
culturewasinfluenced.
Keywords: Hyriopsiscumingi Visceralmas Biologicalcharacteristic Culturepearl
2008年第3期
1.2 三角帆蚌内脏团珍珠培育部位组织学特征
三角帆蚌内脏团适合珍珠培育部位为唇瓣右下面、内脏背侧、斧足与内脏团交界处。对该珍珠培育部
位于 2006年 2月~2007年 2月逐月采样,Bouin氏液固定,石蜡包埋,H.E染色作组织学观察。
1.3 三角帆蚌内脏团珍珠培育部位钙的分布特征
取材于 4℃甲醛短时固定,恒冷切片。经 50%酒精 4~5min,入 60℃苏丹Ⅲ染色液中 15~30min,入 50%
酒精洗片刻;蒸馏水漂洗,纯甘油透明,树脂封片;光学显徽镜下观察,脂类呈深桔黄色。
常规石蜡切片经脱蜡下降至水。经蒸馏水冲洗后,移入 5%硝酸银中,暗处放置 1h后,在暗处用蒸馏水
冲洗 4次,移置光亮处 45min;再用蒸馏水洗净,脱水,1%伊红酒精复染 2s;二甲苯透明,树脂封片;光学显
徽镜下观察,钙呈黑色。
1.4 三角帆蚌内脏团与外套膜珍珠培育部位生化环境
1.4.1 三角帆蚌内脏团与外套膜珍珠培育部位钙含量的测定 在性腺发育休止期(2月份),对内脏团与
外套膜(蚌中后部背缘)珍珠培育部位分别取材 1g,每次 6只蚌,重复 2次,用 25ml浓盐酸消化 24h后于锥
形瓶中用双蒸水稀释至 1L左右。配钙标准曲线溶液钙含量分别为 0mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、
5mg/L和 6mg/L。分别用原子吸收光谱仪测样品与标品的吸光值,以测出的吸光度在标准曲线计算未知样
中的钙含量[7]。测定结果为 1g鲜组织中钙所含量。
1.4.2 三角帆蚌内脏团与外套膜珍珠培育部位总蛋白含量的测定 取材同上,按重量体积比加生理盐水制
备 10%组织匀浆。3000r/min离心 10min,然后取上清用生理盐水按 1:9稀释成 1%组织匀浆。采用南京建
成生物工程研究所总蛋白测试试剂盒进行测定[8,9]。加样操作为 0.05ml培养液(标准管加 0.536g/L标准蛋
白 0.05ml,空白管加双蒸水 0.05ml),各管加入考马斯亮兰显色剂 3ml。混匀,静置 10min,于 595nm波长,
1cm光径比色,测各管吸光度。计算公式:蛋白含量(g/L)=(测定管吸光度/标准管吸光度)×标准管浓度。测
定结果为 1%组织匀浆中蛋白所含量。
1.4.3 三角帆蚌内脏团与外套膜珍珠培育部位碱性磷酸酶活性的测定 取材同上,按重量体积比加生理盐
水制备 10%组织匀浆。3000r/min离心 10min,然后取上清用生理盐水按 1:9稀释成 1%组织匀浆。采用南
京建成生物工程研究所 AKP活性测试试剂盒进行测定[10]。测活体系为 0.03ml1%组织匀浆 0.03ml(标准管
加 0.1mg/ml酚标准液 0.03ml,空白管加双蒸水 0.03ml),0.5ml缓冲液,0.5ml基质液;充分混匀 37℃水浴
15min;各管加入显色剂 0.5ml,立刻混匀。520nm波长,1cm光径比色,测各管吸光度,酶活力单位指反应体
系每 15min产生 1mg酚为一单位。计算公式:碱性磷酸酶活性(U)=(测定管吸光度/标准管吸光度)×标准
管含酚的量÷取样量中的蛋白克数。测定结果为 1%组织匀浆中酶活性。
1.4.4 三角帆蚌内脏团与外套膜珍珠培育部位碳酸脱水酶活性的测定 取材同上,按重量体积比加生理
盐水制备 10%组织匀浆。3000r/min离心 10min,然后取上清用生理盐水按 1:9稀释成 1%组织匀浆。取适
量 1%组织匀浆液,通过测定在含有 0.5ml灭活或未灭活的酶液的测定液中注入 4.5ml冰冷的 CO2饱和缓
冲液后 pH下降的速度差异来计算[11]。to为灭活酶液加入体系后 pH值下降一个单位所需时间,tc为样品加
入体系后 pH值下降一个单所需时间[11]。计算公式:碳酸脱水酶活性(U)=(to-tc)/tc,测定结果为 1%组织匀
浆中酶活性。
2 结果
2.1 三角帆蚌内脏团珍珠培育部位组织学特征
三角帆蚌内脏团植核部位周围组织由疏松结缔组织、薄层肌肉组织、性腺脂肪组织 3种组织组成。成
体蚌性腺随季节发生周期变化,因此内脏团植核部位的组织结构在不同时期差异很大。在性腺发育前期
(休止期),滤泡萎缩,滤泡成椭圆型,体积小且数量很少。滤泡间间隙逐渐加大,间隙间充填着丰富的疏松
结缔组织,薄层平滑肌组织(图 1)。疏松结缔组织呈蜂窝状,纤维较少,排列稀疏;结缔组织细胞种类较多,
施志仪等:三角帆蚌内脏团珍珠培育部位的生物性状研究 179
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
多呈长梭形,胞核大,着色深(图 2)。滤泡内生殖细胞的发育处于原始生殖细胞阶段,数目少,分散分布于
滤泡壁上(图 3)。
性腺发育中期(增殖期,生长期),滤泡不断发育,数量增多,体积增大,多呈圆形或椭圆形。滤泡间结缔
组织,薄层平滑肌组织减少。原始生殖细胞开始分化并分裂增殖,形成较多的卵原或精原细胞(图 4)。
性腺发育后期(成熟期)滤泡为全年最丰满时期,滤泡形状不规则,滤泡体积大,数量多,占据了整个内脏
团的大部分。滤泡间的空隙基本消失,肌肉组织、疏松结缔组织分布很少(图5)。此期滤泡腔扩张至最大状态,
并且腔内很少留有空隙,滤泡壁充分伸展而变得很薄。随着性腺发育,滤泡腔逐渐充满成熟的性细胞(图6)。
图1 性腺发育前期内脏团珍珠培育部位组织结构 图2 内脏团结缔组织;肌肉组织结构 图 3 性腺发育前期性腺滤泡
及原始生殖细胞 图4 性腺发育中期滤泡 图5 性腺发育后期性腺滤泡 图6 性腺发育后期性腺滤泡及性细胞
F.滤泡;C.结缔组织;M.平滑肌组织;G.生殖原细胞(↑);S.性细胞(↑)
2.2 三角帆蚌内脏团珍珠培育部位组织化学特征
苏丹Ⅲ法示脂类,内脏团整个性腺滤泡呈深桔黄色(图 7)。表明性腺组织中含有大量的脂肪类物质成
分。
硝酸银染色显示,内脏团性腺滤泡组织中的钙质较多,疏松结缔组织呈网状分布;而内脏外膜和其下
的肌肉层钙质分布较少(图 8)。
图 7 苏丹Ⅲ法显示内脏团脂肪类物质
图 8 硝酸银染色显示内脏团钙的分布
EN,外表皮(↑) C,结缔组织 G,性腺组织
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2008年第3期
2.3 三角帆蚌内脏团与外套膜珍珠培育部位生化环境
分别测定内脏团与外套膜珍珠培育部位钙含量、总蛋白含量、碱性磷酸酶(AKP)和碳酸脱水酶(CA)活
性。计量资料数据以 x±s表示,计量
资料两组间比较用 Student-t检验。
数据经生物学统计分析,结果如下
表。
钙、蛋白、碱性磷酸酶,碳酸脱水酶在内脏团珍珠培育部位均有分布,但其中内脏团珍珠培育部位钙含
量(t<0.01),碱性磷酸酶(t<0.01)比外套膜珍珠培育部位少。
3 讨论
钙盐、蛋白、碱性磷酸酶和碳酸脱水酶在珍珠的生物矿化过程中起着重要作用。珍珠囊分泌的钙[14,15]
可通过碳酸脱水酶与蚌代谢的二氧化碳结合沉淀为碳酸钙[16,17]。然后碳酸钙在蚌分泌的蛋白上面沉积,由
蛋白质指导晶核形成、决定晶体空间取向及晶体类型[18~20]。碱性磷酸酶与珍珠质的形成也有关系,碱性磷
酸酶对水中钙质的吸收、蛋白质分泌,磷酸钙的形成均具有重要作用[21~24]。生化分析表明以上生化成分在
三角帆蚌内脏团珍珠培育部位均有分布,为珍珠培育部位珍珠的生物矿化提供了基本的生化条件。
目前我国部分地区已经开始了内脏团插核育珠的尝试,但内脏团内培育珍珠尚无大面积展开,其关键
存在着两方面的问题:1)内脏团内珍珠囊形成难,珍珠囊包被不完整;2)珍珠形成慢,育珠周期长。
内脏团与外套膜珍珠培育部位结构不同,外套膜珍珠培育部位周围为结缔组织、肌肉纤维,而内脏团
珍珠培育部位周围除了结缔组织、肌肉组织还分布着性腺脂肪组织,特别是随着性腺发育,珍珠培育部位
将充满大量性腺脂肪组织。已有的生产经验表明结缔组织是珍珠培育的主要部位,而性腺组织是不利于内
脏团内珍珠囊形成的。如海水贝类在内脏团插核育珠之前要进行术前处理,排放精卵,以降低性腺的发育
程度[25,26]。
组织化学结果显示钙盐在内脏团外膜中分布很少,钙盐主要分布在疏松结缔组织和性腺脂肪组织中,
这表明三角帆蚌内脏团中钙的吸收途径与外套膜不同:外套膜可通过内侧上表皮主动吸收水中的钙盐,而
内脏团外表皮不具有吸收钙的功能,主要通过肠道吸收而渗透到周围的内脏团结缔组织。然而,淡水水体
中钙本身浓度低,肠道与钙接触吸收的面积相比较外套膜要小,对水体中钙的吸收转运有限。钙是珍珠的
主要成分之一,育珠蚌体内钙的吸收、转运和沉积与珍珠的形成有密切关系[27]。内脏团吸收贮存钙的不足,
内脏团珍珠培育部位钙含量明显比外套膜珍珠培育部位少,所以内脏内珍珠形成慢,生长周期长。
内脏团珍珠培育部位性腺组织不利于珍珠囊的形成,因此在内脏团培育珍珠应选择适宜的插核时期。
性腺发育前期(休止期),性腺滤泡体积小且数量少,所占空间小,滤泡间隙充填着丰富的结缔组织和薄层
平滑肌组织,此时最适合在内脏团插核培育珍珠。在其它时期插核培育也可以采用海水贝类术前处理方
法,降低性腺成熟度然后进行插核。针对内脏团内珍珠囊难以形成的问题,也可采用细胞植入的方法[6]进
行内脏团有核珍珠的培育。同时,为了缩短内脏团育珠周期,促进内脏团内珍珠的生长,可在池塘里施钙
肥,以提高养殖水体环境中的钙浓度。
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(下转第189页)
表 1 内脏团与外套膜珍珠培育部位生化环境
施志仪等:三角帆蚌内脏团珍珠培育部位的生物性状研究 181
2008年第3期
(上接第181页)
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