全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):222-227
大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）是一种名贵
的海洋经济鱼类，原产于英国。中国水产科学研究
院黄海水产研究所的雷霁霖院士于 1992 年 8 月首次
将其引入我国，并经过一系列关键养殖技术研究取
得成功，很快在我国北方沿海地区形成了大规模的
工厂集约化养殖生产［1］。近年来，随着养殖量的迅
速增大，尤其是集约化的高密度养殖生产，导致大
菱鲆疾病相继出现，特别是由某种病原微生物引起
的感染病（Infectious diseases）时有发生，并常常会
导致较大的经济损失［2］。
作者在对养殖鱼类感染病的病原研究中，从养
殖大菱鲆患病死亡及濒死鱼中经常分离到病原细菌，
其中尤以鳗弧菌（Vibrio anguillarum Bergeman 1909）
的分离频率较高，且分离菌株均具有较强的致病作
用，能引起不同日龄大菱鲆发生败血性感染病。本
研究对从自然发生的大菱鲆鳗弧菌感染病（死）鱼
苗分离的鳗弧菌菌株，进行了比较系统的检验与分
析，旨为对由鳗弧菌引起的大菱鲆弧菌病（Vibriosis）
的有效预防与控制。
1 材料与方法
1.1 材料
2012 年 5 月，河北某水产养殖场的大菱鲆鱼苗
大量死亡。主要表现为体表弥漫性出血，有的病鱼
收稿日期 ：2015-03-09
基金项目 ：河北省重点基础研究项目（11960503D），现代农业产业技术体系河北省创新团队建设（特色海产品疫病防控与质量安全）
作者简介 ：郭杨柳，女，硕士研究生，研究方向 ：病原微生物学 ；E-mail ：yangliuguo1991@163.com
通讯作者 ：房海，男，教授，硕士生导师，研究方向 ：动物病原微生物及生物学性状 ；E-mail ：fanghaihb@163.com
大菱鲆病原鳗弧菌的检验与分析
郭杨柳  吴楠  房海  陈翠珍  李艳云  王晓珊  卢会鹏  张东林 
（河北科技师范学院，秦皇岛 066600）
摘 要 ： 旨对从发病死亡的养殖大菱鲆鱼苗中分离的 10 株细菌进行检验与分析。运用表观分类学指征、16S rRNA 基因序列
与系统发育、免疫血清学、人工感染的致病作用等方法进行检验。经过检验，结果表明为弧菌属（Vibrio Pacini 1854）的鳗弧菌（Vibrio
anguillarum Bergeman 1909），对供试大菱鲆显示强致病性 ；与用不同来源的鳗弧菌制备的全菌体抗血清能够发生免疫血清学的强
凝集反应。
关键词 ： 大菱鲆 ；鳗弧菌 ；检验与分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.029
Examination and Analysis on Pathogenic Vibrio anguillarum from
Turbot Scophthalmus maximus
Guo Yangliu Wu Nan Fang Hai Chen Cuizhen Li Yanyun Wang Xiaoshan Lu Huipeng Zhang Donglin
（Hebei Normal University of Science and Technology，Qinhuangdao 066600）
Abstract: Ten strains isolated from died larve of cultured turbot were examined and analyzed. 10 strains were detected by phenotypic
information, detection and phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequence, serological, as well as pathogenic role of artificial model
infection. It was found that Vibrio anguillarum showed strong pathogenicity on turbot, which was tested with various sources Vibrio anguillarum
antiserum and occurred strong serological agglutination on immunity.
Key words: Scophthalmus maximus（turbot）；anguillarum ；examination and analysis
2015,31(11) 223郭杨柳等 ：大菱鲆病原鳗弧菌的检验与分析
腹部臌胀、腹内积液（充盈淡红色腹水），肝脏苍白
易碎。在 5 月 13 日的发病死亡高峰期，取发病后刚
刚死亡大菱鲆鱼苗进行病变特征检验后，分别以其
肝脏组织及腹水为材料，接种于普通营养琼脂、血
液（含 7% 家兔血液）营养琼脂培养基，置 28℃培
养 24-48 h ；对分离菌做纯培养并统一编号后，进行
检验与分析。
1.2 方法
1.2.1 分离菌株的表观分类学指征检验 对分离保
存的纯培养菌株，分别进行形态特征、培养特征、
生理生化特性等这些表观分类学指征的系统检验。
生理生化特性检验，采用法国 BioméRieux 细菌自动
鉴定仪（ATB1525-expression），并对一些项目内容
进行补充试验［3］。
1.2.2 分离菌株的 16S rRNA 基因序列测定与系统发
育学分析 择经表观分类学指征检验后的代表菌株，
进行 16S rRNA 基因序列测定与系统发育学分析。方
法是将供试菌株接种于 LB 肉汤培养基中，28℃（110
r/min）振荡培养 16 h 作为供试菌液，采用北京赛百
盛基因技术有限公司生产的树脂型 TM 基因组 DNA
提取试剂盒，参照相应的方法提取细菌 DNA 作为
PCR 模板。
以弧菌检验的通用引物，即对应于大肠埃希
氏菌（Escherichia coli）16S rRNA 基因第 8-27 个碱
基 位 置 的 5-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3
为 正 向 引 物、 对 应 于 大 肠 埃 希 氏 菌 16S rRNA 基
因 第 1492-1510 个 碱 基 位 置 的 5-TACGG（C/T）
TACCTTGTTACGACTT -3 为反向引物（1492R），按
常规方法对供试菌株进行 16S rRNA 基因序列的 PCR
扩增［4］；即在 50 μL 反应体系中含有 2×PCRmix 缓
冲液 25 μL、引物各 1 μL、DNA 模板 4 μL、无菌蒸
馏水 19 μL，PCR 反应条件为 ：95℃预变性 3 min ；
94℃变性 1 min，55℃复性 1 min，72℃延伸 2 min，
30 个循环 ；72℃温育 6 min。所扩增的 PCR 产物经
纯化后，提交上海生工生物工程股份有限公司进行
基因序列测定。
对所测定的基因序列，通过 NCBI 的 BLAST 检
索系统进行序列同源性分析，使用 DNASTAR 软件
与 GenBank 数据库存中获得的相似性较高的基因序
列进行多序列匹配排列（Multiple Alignment），采用
邻接法（Neighbor joining method）构建分支系统树。
1.2.3 免疫血清学检定 以用已知大菱鲆病原鳗弧
菌制备的全菌体抗原，经多次免疫家兔制备的相应
抗血清，分别对供试菌株做玻片凝集反应，进行血
清型的定性实验，以呈现明显凝集（++）判定为
阳性。同时，分别以大菱鲆病原迟钝爱德华氏菌
（Edwardsiella tarda）、正常健康家兔血清、无菌生理
盐水，作为阴性实验对照［4］。
1.2.4 菌株分类位置确定 根据细菌形态特征、理
化特性等表观分类学指征的检验结果，主要参照第
2 版《伯杰氏系统细菌学手册》（Bergey’s Manual
of Systematic Bacteriology）及有关资料，并结合 16S
rRNA 基因序列与系统发育学、免疫血清学的测定结
果，对供试菌株进行分类学的归类判定［3，5］。
1.2.5 人工感染实验 择经分类鉴定后的代表菌株，
以其纯培养物分别移接普通营养肉汤培养基，经
28℃培养 18 h 作为供试菌液。分别对体重 200-250
g/ 尾的健康大菱鲆，进行腹腔注射接种的感染实验
（0.1 mL/ 尾），以被感染发病、死亡，呈现出同自然
病（死）大菱鲆的发病和病变特征、并能从病变组
织中重新分离回收到原感染菌，作为致病作用的判
定指标 ；同时设立仅接种无菌普通营养肉汤的实验
对照，须在实验观察期内健康存活。供试大菱鲆在
实验前统一养殖于水温 19-21℃的实验水族箱中，
养殖观察 7 d 且健康才可用于实验。
2 结果
2.1 菌株与编号
取发病后刚刚死亡大菱鲆鱼苗 10 尾进行细菌
分离，从其肝脏组织及腹水中，均分离到了多量且
纯一的同种细菌。从每尾大菱鲆鱼苗的分离菌，各
取 1 个菌落移接于普通营养琼脂斜面培养基，置
28℃培养 24 h 作为纯培养菌，于 4℃普通冰箱保藏
供实验用。菌株编号系按分离地与日期，依次为
HC120513-1 至 HC120513-10。
2.2 形态与培养特征
2.2.1 形态特征 取保藏的 10 株纯培养菌，分别移
接于普通营养琼脂斜面培养基，置 28℃培养 24 h 后
做涂片标本进行革兰氏染色检查，均为革兰氏染色
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11224
阴性、杆状及短杆状（多数菌体稍弯曲）、一端或两
端钝圆（有的一端或两端稍尖）、散在（个别成双）、
无芽孢、大小多在 0.3-0.7 μm×1.0-2.2 μm。进行负
染色的透射电子显微镜标本观察发现，菌体弯曲、
表面光滑，但不平整、有微泡（Micorovesicale）、端
生单鞭毛（图 1）。
常表现轻微下陷（菌落长入培养基中），刮下菌落后
可见长入培养基中留下的菌落痕迹（图 4）。
图 1 鳗弧菌透射电子显微镜照片（×4 000）
2.2.2 生长情况与菌落特征 取保藏的 10 株纯培养
菌，分别移接于普通营养琼脂、血液（含 7% 家兔血液）
营养琼脂、硫代硫酸钠柠檬酸钠胆酸钠蔗糖琼脂
（Thiosulfate citrate bile salt sucrose agar，TCBS）培养
基，置 28℃培养 24-48 h 培养后检查生长情况及菌
落特征。结果在普通营养琼脂、血液（含 7% 家兔
血液）营养琼脂培养基上，与用此两种培养基从病
死大菱鲆鱼苗所分离的一致，表现为在普通营养琼
脂培养基上，培养 24 h 检查菌落呈圆型光滑、边缘
整齐、较隆起、浅橘黄色、不透明、直径多在 0.8-
1.0 mm（培养 48 h 的多在 1.5-1.8 mm），生长较丰盛
（图 2）；在血液（含 7% 家兔血液）营养琼脂培养基
上，生长情况与菌落特征基本同在普通营养琼脂上
的，培养 24 h 的菌落直径多在 1.0-1.2 mm（培养 48
h 的多在 1.5-2.0 mm），β-溶血（图 3）；在 TCBS 培
养基上，培养 24 h 检查不见明显生长或仅形成直径
多在 0.3 mm 左右的小菌落（培养 48 h 的可达 1.2-
1.5 mm），菌落圆形光滑、边缘整齐、较隆起、黄色，
常表现是仅在做划线接种的起始部长出菌苔及少数
菌落，菌落（苔）黏稠不易乳化，菌落周围培养基
图 3 鳗弧菌在血液营养琼脂培养基中 28℃培养 48 h 的菌
落形态
图 2 鳗弧菌在营养琼脂培养基中 28℃培养 48 h 的菌落形态
2.2.3 适宜生长的温度 取保藏的 10 株纯培养菌，
分别移接于普通营养琼脂斜面培养基，置 37℃培养
24-48 h 检查，表现在 37℃培养呈微弱生长，但比
在 28℃培养的表现生长缓慢。
2.3 理化特性
供试 10 株纯培养菌，对所测项目的结果表现一
致。均可还原硝酸盐，对 O/129 敏感，剩余项目如
表 1 所示。
2.4 16S rRNA基因序列与系统发育
择经表观分类学指征检验后的 HC120513-1 作
为代表菌株，进行的 16S rRNA 基因序列测定与系统
发育学分析，结果得到了长度为 1 450 bp 的基因序
列。将此菌株的 16S rRNA 序列在 NCBI 上进行同源
性检索发现，其与弧菌属（Vibrio Pacini 1854）细菌
的 16S rRNA 基因序列自然聚类 ；在检索出的弧菌属
2015,31(11) 225郭杨柳等 ：大菱鲆病原鳗弧菌的检验与分析
细菌序列中，此菌株与它们的同源性都在 99%。选
取 20 株弧菌属细菌的 16S rRNA 基因序列进行系统
发育学分析，此菌株与编号为 KC884632 的鳗弧菌
聚为一个分支（图 2）。
2.5 血清学凝集实验
以 10 株纯培养菌的普通营养琼脂培养基、28℃
培养 24 h 的培养物为全菌体抗原，进行的血清学凝
集反应实验，结果均与供试鳗弧菌全菌体抗血清呈
现强阳性反应（++++），与正常健康家兔血清、无
菌生理盐水均为阴性。对照用的迟钝爱德华氏菌，
与供试鳗弧菌全菌体抗血清、正常健康家兔血清、
无菌生理盐水均为阴性（图 5）。
2.6 菌种判定
根据对 10 株供试菌表观分类学指征的检验、
16S rRNA 基因序列与系统发育学分析、免疫血清学
凝集反应检定结果，综合分析判定为弧菌属的鳗弧
菌。参考菌株 ：HC120513-1。
2.7 致病作用
将 16 尾供试大菱鲆，分为每组 8 尾的两组隔离
养殖于两个实验用水族箱中 ；其中的 1 组接种供试
菌株 HC120513-1 的菌液为感染实验组，另外 1 组接
种普通营养肉汤为实验对照组，分别养殖观察。结
果如表 2 所示，实验组的 8 尾于接种感染后 48 h 内
均表现发病且死亡 6 尾（死亡率 75.0%）；对照组 8 尾，
养殖观察 7 d 仍正常存活。
死亡 6 尾大菱鲆，均呈现出了同自然发病的出
血、腹水等病变。取其肝脏组织及腹水为材料，接
种于普通营养琼脂、血液（含 7% 家兔血液）营养
琼脂培养基，置 28℃培养 48 h，均分离到了大量纯
一的同种细菌 ；经做纯培养后进行的主要理化特性
检验，表明为原感染用的鳗弧菌。
3 讨论
从发生大量死亡的养殖大菱鲆鱼苗中分离的 10
株细菌，通过普通细菌学方法检测为革兰氏阴性菌，
杆状及短杆状（多数菌体稍弯曲），端生单鞭毛，氧
化酶反应呈阳性，能够还原硝酸盐，对弧菌抑制剂
O/129 敏感等，这些都符合弧菌属的典型特征。这
10 株细菌还能够利用柠檬酸盐、丙二酸盐和酒石酸
盐 ；分解阿拉伯糖、纤维二糖、半乳糖、麦芽糖、
甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖和甘油产酸，不分
解阿东醇、甜醇、赤藓糖醇、肌醇、乳糖、蜜二糖、
棉子糖、鼠李糖、水杨苷和木糖 ；过氧化氢酶、吲
图 4 鳗弧菌在 TCBS 培养基上 28℃培养 48 h 的菌落形态
图 5 实验菌株与对照菌株的玻片凝集实验
ᇎ傼㧼Ṛ ሩ➗㧼Ṛ
表 1 供试菌株的理化特征
鉴定项目 鉴定结果 鉴定项目 鉴定结果
氧化酶 + 纤维二糖 +
过氧化氢酶 + 半乳糖 +
吲哚 + 麦芽糖 +
V-P 反应 + 甘露醇 +
明胶酶 + 山梨醇 +
DNA 酶 + 蔗糖 +
β-半乳糖苷酶 + 海藻糖 +
精氨酸双水解酶 + 甘油 +
H2S 产生 - 阿东醇 -
赖氨酸 - 甜醇 -
鸟氨酸脱羧酶 - 赤藓糖醇 -
苯丙氨酸脱羧酶 - 肌醇 -
尿素酶 - 乳糖 -
甲基红试验 - 蜜二糖 -
柠檬酸盐 + 棉子糖 -
丙二酸盐 + 鼠李糖 -
酒石酸盐 + 水杨苷 -
阿拉伯糖 + 木糖 -
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11226
哚产生、V-P 反应、明胶酶、DNA 酶、β-半乳糖苷
酶和精氨酸双水解酶阳性 ；H2S 产生、赖氨酸及鸟
氨酸脱羧酶、苯丙氨酸脱氨酶、尿素酶、甲基红试
验阴性 ；这是一些主要具有鉴别意义的项目，能够
在弧菌属中有效区分鳗弧菌。由此，从生理生化鉴
定看，实验菌株接近于鳗弧菌。
后续对 10 株细菌进行了 DNA 的提取，扩增了
通用片段 16S rRNA，并建立了系统进化树，结果表
明菌株与鳗弧菌 KC884632 聚为一支，相似度最高
达到 99.9%，而与霍乱弧菌 X74696 遗传距离较远一
些，相似度只能达到 93.9%，偏低。所以，从系统
发育学和序列相似度上来看，实验用菌株与鳗弧菌
较近一些。
随后分别又对回归感染试验分离出的细菌和原
分离于病死成年大菱鲆病原鳗弧菌为抗原制备抗血
清，能够发生强凝集反应，这不仅对鳗弧菌的检验
具有重要意义［6］，也初步显示了在这些不同来源菌
株间的血清型同源性 ；人工感染大菱鲆的实验结果，
显示具有强致病作用。进一步说明尽管鳗弧菌虽属
于水环境微生物区系正常菌群的一种弧菌，但更是
海水养殖鱼类的一种常见的重要病原菌。据此，可
考虑将此菌列为养殖用海水清洁度及弧菌病暴发的
监测菌。
已有的研究报告显示，在水温以及盐度和有机
物含量较高的养殖环境，鳗弧菌的数量急剧增加 ；
养殖密度的增大、养殖水体中溶氧量的降低、养殖
水温的骤变等因素，可使鱼类处于应激状态并导致
免疫机能下降，更容易引起鳗弧菌的感染［7］。显然，
在诸多养殖技术难以规范的实际情况下，应用鳗弧
菌疫苗进行免疫接种的方法，可能会构成最为有效
的途径之一 ；但要做到这一点，对病原鳗弧菌的广
泛分离与检验是一个重要方面的内容，其中尤以血
清学检验确定血清型别是最为需要的。但作为免疫
原性来讲，还需要明确在抗原表达、免疫保护效果
图 6 鳗弧菌 16S rRNA 基因序列系统发生树
表 2 供试菌株对大菱鲆的回归感染实验结果
供试菌株 尾数 / 尾 注射剂量 /（mL·尾-1） 注射后 48 h 注射后 7 d 死亡率 /%
HC120513-1 8 0.3 6 6 75
对照组 8 0.3 0 0 0
Nucleotide Substitutionsx100 03.5 2
V.aestuarianusAF172840
V.splendidusZ31657
V.splendidusX74724
V.aestuarianusX74689
V.metschnikoviiX74711
V.fluvialisX74703
V.fluvialisX76335
V.furnisiiX74704
V.orientalisZ21731
V.vulnificusX74727
HC120513-1
V.anguillarumKC884632
V.anguillarumEF467287
Listonella anguillarumAY662304
Listonella sp.DQ328951
V.ordaliiX70641
V.ordaliiX74781
V.diazotrophicusX74701
V.diazotrophicusX56577
V.choleraeX74694
V.choleraeX74696
2015,31(11) 227郭杨柳等 ：大菱鲆病原鳗弧菌的检验与分析
方面的应用价值。对这些方面的内容，我们还在进
一步的研究中 ；也期望能为鱼类免疫预防的实践应
用，提供具有可行性的基础资料。
4 结论
本次报告分离于大菱鲆鱼苗的 10 株病原细菌，
经过一系列形态特征和菌落特征观察、生理生化鉴
定、16S r RNA 系统学发育分析鉴定是鳗弧菌，并对
大菱鲆进行了回归感染试验，最终可得出这 10 株病
原菌确实是导致大菱鲆致病的鳗弧菌。
参 考 文 献
［1］ 雷霁霖 . 大菱鲆养殖技术［M］. 上海 ：上海科学技术出版社 ,
2003 ：1-7.
［2］ 雷霁霖 , 马爱军 , 陈超 , 等 . 大菱鲆＆ Scophthalmus maximus
（L.）养殖现状与可持续发展［J］. 中国工程科学 , 2005, 7（5）：
30-34.
［3］ 杨正时 , 房海 . 人及动物病原细菌学［M］. 石家庄 ：河北科学
技术出版社 , 2003 ：1523-1643.
［4］ Martin F, Pol Z, Collen M Cavanaugh. Bias in template-to-product
ratios in multitemplate PCR［J］. Appl Environ Microbiol, 1998,
64（10）：3724-3730.
［5］ Garrity GM. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Second
Edition［J］. Volume 2. Part B. Springer, New York, 2005 ：494-
546.
［6］ 邹玉霞 , 张培军 , 莫照兰 , 等 . 大菱鲆出血症病原菌的分离和
鉴定［J］. 高技术通讯 , 2004, 14（4）：89-93.
［7］ Villamil L, Figueras A, Novoa B. Immunomodulatory effects of nisin
in turbot（Scophthalmus maximus L. ）［J］. Fish ＆ Shellfish
Immunology, 2003, 14 ：157-169.
（责任编辑 狄艳红）