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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
大菱鲆 M C1R基因克隆与序列分析
郭忠宝　仇雪梅　白杨　刘洋　王秀利
(大连水产学院生命科学与技术学院 ,大连 116023)
　　摘 　要 : 　黑素皮质素受体 1 (melanocortin212recep tor,MC1R)是黑色素形成调控中的一个关键因子。M C1R通过调节色素
产生的数量和类型 ,决定皮肤表型。本研究根据鱼类的 M C1R基因保守区的核苷酸序列设计引物 ,利用 PCR技术扩增出大菱
鲆 M C1R基因部分片段 ,纯化后进行克隆测序。经生物软件拼接后 ,得到大菱鲆 M C1R基因编码区 951 bp片段。序列分析表
明 :此片段与 GenBank上公布的部分鱼类的 M C1R基因序列同源性较高 (97% ～86% )。本试验结果为进一步研究该基因的
结构与生物学功能奠定了基础。
关键词 : 　大菱鲆 　M C1R基因 　克隆 　序列分析 　进化树
Clon ing and Sequenc ing Analysis of M C1R Gene in Turbot
Guo Zhongbao　Q iu Xuemei　Bai Yang　L iu Yang　W ang Xiuli
( College of L ife Science and B iotechnology, Dalian F isheries University, Dalian 116023)
　　Abs trac t: 　 In this study, according to fish M C1R gene conservative region of nucleotide sequence and design p rimers, the turbot
M C1R gene fragment was amp lifide by PCR. It was made for cloning sequence after purifying. By using the bio2software sp licing, 951
bp coding region sequences of the turbotM C1R gene was obtained. The results of this sequence showed that this fragment has high ho2
mology (97% ～86% ) with part of the M C1R gene sequences published in GenBank. In addition, the consequences would be the
foundation for the p reparation of study the gene structure and biological functions.
Key wo rds: 　Turbot　M C1R gene　Cloning　Sequence analysis　Evolution tree
收稿日期 : 2009204207
基金项目 :辽宁省自然科学基金项目 (20062128)
作者简介 :郭忠宝 (19812) ,男 ,在读研究生 ,研究方向 :动物遗传育种与繁殖
通讯作者 :仇雪梅 (19642) ,女 ,博士 ,教授 ,研究方向 :水产动物基因工程 ; E2mail: xmqiu@dlfu. edu. cn
　　在动物的生长和发育过程中 ,动物的皮色和毛
色的发生及机理历来受到广泛关注 ,皮色和毛色是
动物品种的重要特征之一 ,其种类较多 ,且与动物的
生产性能和经济价值有直接的关系。在研究中发
现 ,动物的有色毛表型主要受黑素皮质素受体 1
(melanocortin recep tor 1,MC1R)位点的不同等位基
因调节 [ 1, 2 ]。MC1R, 又称促黑素细胞激素受体
(melanocytestim2ulating hormone recep tor,MSHR) ,是
由毛色扩展位点编码而成 [ 3 ] ,为 G蛋白耦合的受体
黑素皮质素受体 (MCR s)家族成员之一。MC1R与
配体α2促黑素细胞激素 (α2MSH )及肾上腺皮质激
素 ( adrenocorticotrop ic hormone , ACTH )相互作用 ,
经由 G蛋白耦合的 cAMP信号通路 ,引起 cAMP水
平的提高 ,调节黑色素细胞内的一系列级联反应 ,最
终激发酪氨酸酶水平的提高 ,导致真黑色素的形
成 [ 4 ]。从而实现了对毛色的调控 ,使动物呈现不同
的毛皮颜色。
大菱鲆 ( Scoph tha lm us m ax im us L. )原产欧洲北
海、波罗的海和地中海沿岸 ,属硬骨鱼纲、鲽形目、鲽
亚目、鲆科、菱鲆属 [ 5 ]。大菱鲆生长迅速、肉味鲜
美。在我国北方沿海养殖得到了迅速发展 ,产生了
巨大的经济效益。但在大规模人工养殖过程中 ,色
素的异常会导致幼鱼存活率降低 ,这已成为规模化
养殖的主要障碍 [ 6 ]。色素细胞的发育或色素的生
成出现异常 ,这可能是一种色素合成基因错误。本
研究首次选 M C1R基因 ,对其进行克隆与分析 ,为今
后对大菱鲆 M C1R 基因的作用的深入研究奠定
基础。
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
1　材料与方法
111　材料
11111　大菱鲆 　大菱鲆购于大连双龙海产有限公
司大菱鲆养殖场。
11112　菌株及试剂 　大肠杆菌 E. coli DH5α和
pMD192T克隆载体试剂盒、Taq聚合酶 , dNTPs、X2
Gal、IPTG、DNA凝胶回收纯化试剂盒均购于宝生物
工程 (大连 )有限公司 ;琼脂糖 (B iowest Agarose) ;琼
脂粉、胰蛋白胨、酵母浸出粉均为国产。
11113　引物的设计与合成 　根据 NCB I收录的斑
马鱼 (AY161847) M C1R 基因序列 ,使用 Primer 5. 0
软件设计一对引物 Z1: 5′2TGAGGTGGAGGAAGAAC
G23′, Z2: 5′2TGTGGCAATCATCAAGAA23′。依据条
斑星鲽 (AB287974) M C1R 基因序列又设计两对引
物 Q1: 5′2ATGAACAGCAACAGGTCCCA23′, Q2: 5′2G
ATGACGTTGTCCAGGTGGC23′;引物 H1: 5′2CCACC
ACGATGATGGCGATG23′, H2: 5′2GCCCTTTCTTCCT
CCACCTC23′。引物由宝生物工程 (大连 )有限公司
合成。
112　方法
11211　大菱鲆基因组 DNA的提取 　以大菱鲆肌肉
组织为材料 ,采用酚一氯仿法提取基因组 DNA [ 7 ]。
通过 0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测完整性 ,紫外分光
光度仪测定 DNA的纯度 ,并计算 DNA的浓度。
11212　大菱鲆 M C1R基因的 PCR扩增 　在 PCR管
中依次加入 10 ×PCR Buffer 2. 5μl, dNTP M ixture
(各 2. 5 mmol/L ) 2μl,上下游引物各 1μl,模板 1
μl,灭菌超纯水 17. 3μl, Taq DNA聚合酶 0. 2μl,总
体积为 25 μl,混匀后短暂离心 ,进行 PCR 反应。
PCR反应条件 : 95℃预变性 5 m in; 94℃变性 30 s,
55℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 30个循环后 , 72℃再
延伸 7 m in, 4℃保存。PCR结束后产物以 1%琼脂
糖凝胶电泳检测分析。
11213　大菱鲆 M C1R 基因的克隆 　将特异性片段
采用胶回收试剂盒回收后 ,与 pMD192T克隆载体连
接 ,于 16℃连接过夜 ,并转化至大肠杆菌 E. coli
DH5α感受态细胞中 ,转化产物于 37℃ 100 r/m in
培养 60 m in,涂于含有 Amp、X2Gal、IPTG的 LB固体
培养基上 , 37℃培养 16 ～18 h。在固体 LB培养基
上挑取白色阳性菌落 ,接种于含有 Amp的 LB液体
培养基中 , 225 r/m in过夜培养。通过菌液 PCR对
所获得的大肠杆菌鉴定为阳性的菌落送至宝生物工
程 (大连 )有限公司测序。
11214　序列分析 　对测序结果采用 DNAStar软件
分析 ,将 3个测序结果使用 SepMang功能进行序列
的拼接 ,得到 951 bp的大菱鲆 M C1R基因序列。在
GenBank中检索条斑星鲽 ,牙鲆 ,花斑剑尾鱼 ,莫桑
比克罗非鱼 ,红鳍东方鲀、斑马鱼等的核苷酸序列 ,
采用生物软件对这些物种进行同源性比对和进化树
分析。
2　结果与分析
211　大菱鲆基因组 DNA的检测
取溶解的大菱鲆基因组在含 EB的 0. 8%琼脂
糖凝胶电泳检测。在凝胶成像仪上观察结果并扫
描 ,结果见图 1。大菱鲆基因组条带清晰 ,经紫外分
光光度仪测定 ,所提取的 DNA纯度较好。计算后浓
度适当。
M.λH indⅢ; 1, 2, 3. 为大菱鲆基因组
图 1　基因组 D NA的检测
212　大菱鲆 M C1R基因的 PCR扩增
以大菱鲆 DNA为模板 ,使用 Q1, Q2引物 ,进行
PCR扩增 ,将扩增所得 PCR产物以 1%琼脂糖凝胶
电泳分析 ,在约 300 bp处得到一条特异性清晰条
带 ;同理使用 Z1, Z2引物和 H1, H2引物 , PCR扩增
产物 ,经 1%琼脂糖凝胶电泳后也分别在约 600 bp
和 430 bp处得到单一清晰条带。3条 PCR扩增产
物与设计引物时预期所得片段大小一致 (图 2)。
213　大菱鲆 M C1R基因的克隆
连接产物转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞后
37℃培养过夜出现蓝白分明的菌落。挑取 10个单
菌落培养 12 h,然后进行菌落 PCR检测鉴定。电泳
011
2009年第 7期 郭忠宝等 :大菱鲆 M C1R基因克隆与序列分析
M. DL2000 DNA分子量标准 ; Y. 阴性对照 ; 1. Q1, Q2为引物 PCR扩增产物 ; 2. Z1, Z2为引物 PCR扩增产物 ; 3. H1, H2为引物 PCR扩增产物
图 2　M C IR基因的 PCR扩增
后均得到特异性条带 ,可以确定目的基因已经插入
T载体 ,得到阳性克隆 ,与预期结果完全相同。然后
将菌液质送宝生物工程 (大连 )有限公司测序。
214　序列分析
21411　同源性比较 　测序得到的大菱鲆 M C1R
序列与预期片段大小一致 ,采用 DNAStar软件中
的 SepM ang,对 3条序列片段进行拼接 ,拼接后得
到 951 bp的新序列。将该序列提交 GenBank,获
得的登录号为 FJ605360。使用 NCB I中的 BLAST
和 ClustalX 软件 , 对 GenBank 中已发表的牙鲆
( EU365367 ) , 条 斑 星 鲽 ( AB287974 ) , 孔 雀 鱼
( FJ200251) ,红鳍东方鲀 (AY161854) ,花斑剑尾鱼
(DQ866828) ,黑青斑河豚 (AY332238) ,莫桑比克罗
非鱼 (AJ871147)等 8种鱼类的 M C1R 基因序列进
行同源性分析。结果显示 ,大菱鲆 M C1R基因核甘
酸序与它们的同源性分别为 97% , 93% , 89% ,
88% , 87% , 87% , 86%。
21412　系统进化树的构建及系统发育分析 　利用
GenBank数据库搜索到以下 8种生物 M C1R的核苷
酸序列 :斑马鱼 (D anio rerio)、牙鲆 ( Para lich thys oli2
vaceus)、条斑星鲽 (Verasper m oseri)、孔雀鱼 ( Poecilia
reticu la ta)、红鳍东方鲀 ( Takifugu rubripes)、花斑剑
尾鱼 ( X iphophorus m acu la tus)、黑青斑河豚 ( Tetra2
odon n igrovirid is )、莫桑比克罗非鱼 ( O reochrom is
m ossam bicus)。用 ClustalX 1. 8进行序列比对 ,再用
Mega 4构建系统进化树 (图 3)。从构建的系统进化
树中可见 : 9个物种又明显的分为两大类 ,一类包括
大菱鲆、牙鲆、条斑星鲽、莫桑比克罗非鱼、红鳍东方
鲀、黑青斑河豚、花斑剑尾鱼、孔雀鱼 ;斑马鱼单独聚
为一类。这种系统发育关系与传统的分类基本一
致。由进化树可以看出 ,大菱鲆 (S coph tha lm us)与牙
鲆 ( Pa ra lich thys)、条斑星鲽 (Verasper) M C1R 基因分
子进化距离最近 ,亲缘关系最密切。
图 3　不同物种的 M C1R基因构建
的系统进化树 (数值表示置信度 )
3　讨论
在哺乳动物、鱼类、两栖类和鸟类中都有白化个
体的出现。研究结果表明 ,鱼类的白化要复杂的多。
弄清某些基因的结构及其在调控过程中所起到的作
用 ,将会对鱼类白化现象有更清楚的解释。在鱼类
中 ,黑素皮质素 (MC)与载黑素细胞同 M C1R 相结
合作用 ,使得色素沉积 [ 8 ]。色素的合成、转运等又
是由大量的酶、结构蛋白、调节蛋白、转运载体、受体
及其配体等活性成分的参与完成的 ,其中是一重要
的调节因子 [ 9 ]。因此 , M C1R 基因的研究具有相当
重要的意义。
黑素皮质素受体 (melanocortin recep tors,MCR s)
家族是目前所知的最小的 G蛋白偶联受体亚家族 ,
是一系列小基因的产物。它们的基因都仅含有一个
外显子 ,所有 MCR s之间高度同源 ,具有共同的分子
结构特点。说明这个基因簇是古老的 ,并且是通过
发生于脊椎动物进化早期的基因局部复制形成 [ 10 ]。
111
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
M C1R为 MCR s家族成员之一 ,长度一般 310多个
氨基酸 ,例如人类是 317个、鸡是 314个。 van der
Salm等 [ 11 ]克隆得到莫桑比克罗非鱼 M C1R基因 ,编
码区翻译得到氨基酸为 325个 , Selz等 [ 12 ]克隆得到
花斑剑尾鱼 M C1R 基因 ,其氨基酸为 323个。本试
验通过 PCR扩增的方法 ,获得一条 951 bp核苷酸序
列 ,编码 317个氨基酸 ,与前面学者的研究结果大致
相符。经 NCB I中的 BLAST进行对比发现 ,与 NCB I
提交的 M C1R基因的编码区同源性较高 ,证明本实
验所得到的目的基因片段是目前尚未见报道大菱鲆
的 M C1R基因的编码区序列。进化树分析表明 ,在
漫长的物种进化过程中 , M C1R 基因的进化过程的
远近 ,也决定了物种的亲缘关系的远近。这说明不
同物种相对保守的 M C1R基因在物种进化过程中起
着重要的作用。本试验得获大菱鲆的 M C1R基因的
编码区大部分序列 ,为进一步研究该基因的结构和
功能奠定了基础。
参 考 文 献
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12　Selz Y, B raasch I, Hoffmann C, et al. J Gene, 2007, 401 (1～2) : 114
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稿件书写规范
　　1　作者在对某一专题、或是某一研究领域进行综述时 ,需要对收集的参考文献及其他相关资料进行归
纳、整理 ,明晰文章论点 ,并对选题做系统、全面、深入的论述、分析。最后 ,在全面、深入地分析、评价现有研
究的基础之上 ,对该研究领域未来的发展趋势进行科学、合理化预测 ,且提出严谨、有价值的建议。综述是本
刊的重点栏目之一 ,作者在投综述类文章时 ,需要对专题的发展过程 ,或是前人研究历史做清晰、有条理的论
述 ,避免大量参考文献的堆砌。此外 ,文中所引用的文献资料最好是近 5年国内外公开发表的文章。
2　针对“研究报告 ”类文章 ,试验结果除了以图、表的形式展示外 ,还需附以文字对重点内容加以描述、
说明。此外 ,图表中的指示性数字、符号等所代表的具体内容要在图下加注解释 (例如 ,琼脂糖凝胶电泳泳
道 M , 1, 2, 3. . . . . 分别是哪种物质 )。
3　参考文献按照文中引用的顺序进行编码 ,未公开发表的文献请勿引用 ,来自网络等的资料如引用 ,需
标明年月日及网址 (最好保留网页 )。
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本刊编辑部 　　
2009年 6月 　　
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