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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
14-3-3 家族蛋白是一类在所有真核生物间高度
保守，分子量较小（27-32 kD）的酸性调控蛋白，
具有调控胁迫响应、细胞内信号转导、细胞周期、
程序细胞死亡及转录调控等功能［1，2］。由于 14-3-3
蛋白可以通过信号转导的方式来调节大量蛋白的活
性，尤其是逆境条件下其对特定蛋白代谢过程中信
号通路有调节作用，因此 14-3-3 蛋白的研究对探
讨物种对生物或非生物的胁迫响应机制具有重要意
义。现有的研究表明，14-3-3 蛋白在植物及动物的
收稿日期 ： 2013-04-26
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（81160204），贵州省科技厅基金项目（黔科合【2010】3160），高校博士点学科专项科研基金项目
（20105215120001）
作者简介 ：国果，女，博士，副教授，研究方向 ：昆虫分子免疫学 ；E-mail ：guoguojsc@163.com
家蝇 14-3-3 蛋白基因的 cDNA 克隆与序列分析
国果  吴沁怡  吴建伟  付萍  张勇
（贵阳医学院寄生虫学教研室，贵阳 550004）
摘 要 ： 从家蝇 cDNA 文库中筛选获得家蝇 14-3-3（MD14-3-3）基因 DNA 序列，以该基因的 cDNA 文库质粒为模板，PCR
方法对 MD14-3-3 基因进行扩增，以 pET 28a（+）为载体构建重组质粒。采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、
疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析。结果表明，MD14-3-3 基因 ORF 全长 771 bp，编码 257 个氨基酸，
理论分子量 29.35 kD ；等电点 5.78，属于亲水性的酸性蛋白，含有多种酶的结合位点，有 14-3-3 家族结构域和活性位点，定位于
细胞核中，二级结构以 α 螺旋和无规则卷曲为主。经 PCR、双酶切及 NDA 测序结果均表明 pET 28a（+）- MD14-3-3 重组质粒构建
成功。
关键词 ： 家蝇 14-3-3 基因克隆 生物信息学分析
cDNA Cloning and Bioinformatic Analysis of Musca domesitca 14-3-3
Guo Guo Wu Qinyi Wu Jianwei Fu Ping Zhang Yong
（Department of Parasitology，Guiyan Medical College，Guiyang 550004）
Abstract:  The aim of this study is to clone the cDNA sequence of Musca domestica 14-3-3（MD14-3-3），analysis the gene and
encoded protein sequnece of MD14-3-3 by the bioinformatics methods in the following aspects, such as general physical and chemical properties,
hydrophobicity, signal peptide, secondary structure and subcellular localization. Results showed that the open reading frame of the MD14-
3-3 was 771 bp that encoded a putative protein with 257 amino acids. The protein, with predicted molecular weight 29.35 kD and pI of 5.78,
had one active site of family 14-3-3, without signal peptide. It was a hydrophilicity acidic protein which was mainly located in cell nucleus
possible, containing many potential modified sites. The secondary structures were mainly composed of αcoiling and random coil. The gene
coding for MD14-3-3 was amplified by polymerase chain reaction（PCR）, then the PCR product was transformed into the E.coli DH5α through
being linked with pET 28a（+）vector. As demonstrated by PCR, double enzyme digestion and DNA sequencing, it was confirmed that the
recombinant expression plasmid was construction succeed.
Key words:  Musca domestic 14-3-3 Gene cloning Bioinformatics
抵御病原微生物过程中也起着重要的作用。水稻 14-
3-3 蛋白主要存在于叶片和愈伤组织中，在稻瘟病和
植物激素脱落酸（ABA）处理诱导后表达较多［3］。
Ulvila 等［4］采用 RNA 干扰技术，证实了果蝇和斑马
鱼的 14-3-3 基因在抵抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性
菌感染的过程中，起到了重要的防御作用。
家蝇（Musca domestica）是一种地球上分布广
泛的卫生昆虫，其幼虫和成虫常生活于病原菌滋生
的环境中，携带有害病原微生物 60 多种但其自身并
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期106
不染病［5］，其独特的免疫防御功能已成为当今研究
的一大热点。本课题组前期采用菌落活性染色法［6］，
对热胁迫的家蝇幼虫 cDNA 文库进行筛选，筛选到
一些具有抗菌功能的基因，经测序分析及 BLAST 比
对，提示其中一基因为 14-3-3 家族。目前，已有对
植物、鱼类、线虫等的 14-3-3 蛋白进行研究的报道，
但对昆虫体内的 14-3-3 蛋白却了解甚少。因此，本
研究克隆家蝇 14-3-3 蛋白的 cDNA 序列，并对其序
列进行生物信息学分析，旨为进一步揭示该基因在
家蝇免疫防御体系中的功能，挖掘新型的家蝇抗菌
功能基因奠定一定的试验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 文库、菌种及质粒 热诱导的家蝇三龄幼虫
cDNA 质粒文库由北京华大合作构建（具体诱导条
件及文库构建方法见课题组前期论文报道）［7］。原
核表达质粒 pET 28a（+）和大肠杆菌 BL21（DE3）
由中山大学病原生物学实验室馈赠。
1.1.2 主要试剂及工具酶 Ex Taq 酶（含 dNTP），
BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、T4 DNA 连 接 酶，DNA 标 准
（DL15 000，DL2 000）均购自大连宝生物工程公司 ；
异丙硫代 β-D 半乳糖苷（IPTG）购自美国 Promega
公司 ；DNA 凝胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒购自
广州铂尔生物。
1.1.3 引物合成和 DNA 测序 基因扩增引物合成和
重组质粒 DNA 测序由 Invitrogen 上海生物技术有限
公司完成。
1.2 方法
1.2.1 家蝇 cDNA 文库中抗菌功能基因的筛选 采
用菌落活性染色方法［6］。新鲜制备 LB 固体平板（直
径 150 mm），取一张灭菌后 150 mm 的微孔滤膜铺
在平板上。将 cDNA 文库菌液稀释后涂在膜上，约
1 000 个克隆的密度为宜，37℃培养箱中过夜。待
克隆长到肉眼可见时，将膜正面朝上转到另一含有
IPTG 终浓度为 1 mmol/L 的 LB 固体平板上，37℃继
续诱导培养 3-5 h，然后将膜正面向上转移到提前配
制好的 LB 固体染色平板上染色（含 0.005% 台盼蓝）。
30 min 后观察菌落大小及颜色，染色为蓝色且长得
小的克隆为阳性克隆。对获得的阳性克隆测序后进
行 Blastx 分析，从中筛选获得编码家蝇 14-3-3 蛋白
基因的文库质粒，命名为 MD14-3-3。
1.2.2 MD14-3-3 基因的生物信息学分析
1.2.2.1 理化性质分析 用 DNASTAR5.0 软件分析
cDNA 序列和开放阅读框 ；利用瑞士生物信息学研
究所的蛋白分析专家系统（Expert Protein Analysis
System，ExPASy）提供的生物信息学工具 Protparam，
分析预测蛋白质的氨基酸残基性质、分子量及理论
等电点等 ；ProtScale 分析蛋白质的疏水性质。采用
Signal P 分析信号肽序列。
1.2.2.2 结 构 及 功 能 预 测 利 用 Interpro 和
PREDICTPROTEIN 在线分析软件预测蛋白质中包
含的结构域和氨基酸功能位点 ；利用 PHD sec 在线
服 务 器（（http ：//www.predictprotein.org/） 和 SWISS
MODEL 在线预测网站预测蛋白质的二级结构和三级
结构。利用 PSORT Ⅱ在线分析网站分析蛋白质在细
胞内的定位。
1.2.3 MD14-3-3 基因的扩增 根据已获得的 MD14-
3-3 编码序列，利用 DNA Club 和 Primer5.0 设计引物。
上 游 引 物 ：5-CGCGGATCCATGTCGACAGTCGATA-
AAGAGG-3（下划线为 BamH Ⅰ酶切位点）；下游
引 物 ：5-CGCCTCGAGTTAAAAAGGAAACAATTTA-
GTTTGGG - 3（下划线为 Xho Ⅰ酶切位点）。
以筛选到的家蝇三龄幼虫 cDNA 文库中 MD14-
3-3 基因的质粒为模板，94℃预变性 5 min 后，热循
环参数为 94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min，共
35 个循环，最后 72℃延伸 10 min。PCR 产物 1% 琼
脂糖凝胶电泳回收。
1.2.4 重 组 原 核 表 达 质 粒（pET 28a（+）- MD14-
3-3）的构建及鉴定 将 PCR 产物和原核表达载体
pET 28a（+） 分 别 进 行 BamH Ⅰ、Xho Ⅰ 双 酶 切，
将获得的 MD14-3-3 基因和载体酶切产物相连接，构
建重组表达质粒，转入大肠杆菌 BL-21/DE3 感受态
细胞中，卡那霉素筛选阳性克隆，对阳性克隆提取
质粒进行 PCR，双酶切鉴定后，送上海生物工程技
术服务有限公司测序。
2 结果
2.1 MD14-3-3基因编码蛋白的理化性质
MD14-3-3 基因编码的蛋白与刺舌蝇（Glossina
morsitans morsitand）、黑腹果蝇（Drosophila ananas-
2013年第9期 107国果等 ：家蝇 14-3-3 蛋白基因的 cDNA 克隆与序列分析
sae）14-3-3 蛋白的相似性分别为 100%、99%，从比
对的高同源性判断该基因是家蝇的 14-3-3 蛋白，也
表 明 家 蝇 的 14-3-3 蛋 白 极 度 保 守。ORF 全 长 771
bp，编码 257 个氨基酸（图 1），预测分子量为 29.35
kD，理论等电点（pI 值）4.87，含酸性氨基酸（DE）
16.7%，碱性氨基酸（KR）12.9%，亲水性氨基酸
（AILFWV）、极性氨基酸（NCQSTY）和带电氨基酸
（RKHYCDE）分别为 31.9%、29.6%、35.9%。可见，
MD14-3-3 属于亲水性的酸性蛋白。
MotifScan（模序）分析显示，MD14-3-3 含有 2
个 N-糖基化位点，1 个蛋白激酶磷酸化位点 ；10 个
酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点 ；3 个 N-肉豆蔻酰化位点，
4 个蛋白激酶 C 磷酸化位点 ；2 个酪氨酸激酶磷酸化
位点 ；含有 2 个 14-3-3 蛋白信号位点 ；Signal P 3.0
预测该蛋白 N 端没有信号肽，属于非分泌蛋白。
根据氨基酸分值越底亲水性越强和分值越高疏
水性越强的规律可知，MD14-3-3 基因编码的蛋白
多肽链第 87 位具有最低的分值 -2.778（最强的亲水
性），第 100 为具有最高的分值 1.933（最强的疏水
性）（图 2）。整个多肽链表现为亲水性。该结果与
DNASTAR 软件分析结果一致。
MD14-3-3 基因编码蛋白的亚细胞定位分析结果
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1
图 1 MD 14-3-3 蛋白开放阅读框 cDNA 序列及对应编码的氨基酸序列
显示，其分布在细胞核的可能性为 56.5 %，分布在
细胞质的可能性为 21.7 %，分布在线粒体的可能性
为 17.4 %，分布在细胞骨架的可能性为 4.3 %。
2.2 MD14-3-3的二级结构与保守结构域特征
MD14-3-3 蛋白有一个跨膜区位于 172-180 aa，
Sec 预测组成 MD14-3-3 多肽链的二级结构有 3 种类
型，α 螺 旋（H）、β 折 叠（E） 和 无 规 则 卷 曲（L）
的比例是 ：62.65∶8.71∶29.18，以 α 螺旋为主，β
折叠较少。
对其保守结构域分析显示，MD14-3-3 中含有
14-3-3 的功能域（6-238 aa），两个保守位点分别位
于 44-54 aa，214-233 aa，属于 MD14-3-3 家族。
2.3 MD14-3-3基因扩增及原核重组质粒的鉴定
MD14-3-3 基因经 PCR 扩增后，获得了 780 bp
左右的特异条带（图 3， 泳道 1）。将重组质粒进行
双酶切鉴定，产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳。电泳
结果（图 3，泳道 3）显示，重组质粒双酶切后，在
780 bp 左右有一清晰的条带，与目的基因的大小基
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本相符，提示重组质粒构建成功。将挑选的阳性克
隆子送 Invitrogen 公司，进一步以 pET 28a（+）的通
用引物对重组质粒测序，结果表明相应的插入序列
与目的基因 cDNA 序列一致，证明 MD14-3-3 基因原
核表达重组质粒构建成功。
蛋白可能是家蝇强大的免疫系统中有效的防御性活
性分子之一。
昆 虫 免 疫 防 御 物 质 种 类 繁 多。 目 前， 从 蚊
体内发现了 230 多个免疫相关基因，双翅目果蝇
（Drosophila）体内已发现了 7 种不同类型的抗菌肽，
鳞翅目家蚕（Bombyx mori）体内也发现了 8 种不同
的抗菌肽［12］，从家蝇体内得到的抗菌肽也有 10 多
种［13，14］。我们从热诱导的家蝇幼虫 cDNA 文库中筛
选到了具有抗菌功能的 14-3-3 基因，克隆了 MD14-
3-3 基因的 cDNA。生物信息学分析显示该蛋白能与
多种蛋白激酶、蛋白磷酸酶等多种信号蛋白结合，
在信号转导中可能发挥重要作用。本研究为进一步
探讨 MD14-3-3 在家蝇免御体系中的功能，丰富家蝇
免疫防御的机制奠定了一定的试验基础。
4 结论
克隆了家蝇 MD14-3-3 基因，其完整阅读框含
有 771 bp，编码 257 个氨基酸。该基因编码的蛋白
具有 14-3-3 家族的保守功能域，与刺舌蝇、黑腹果
蝇 14-3-3 蛋白的相似性分别为 100%、99%，具有保
守的功能结构域。成功构建了 pET-28a（+）- MD14-
3-3 原核表达重组质粒，为后续 MD14-3-3 的功能研
究奠定基础。
参 考 文 献
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2.0
1.0
0
0.5
-0.5
-1.0
-1.5
-2.5
-2.0
-3.0
500 150 250200100
1.5
࠶٬
≘ส䞨ս⛩
图 2 MD 14-3-3 基因编码蛋白疏水性分析
2000
bp
M 1 2 3
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker DL 2000 ；1 ：MD14-3-3 PCR 扩增产物 ；2 ：pET 28a（+）双
酶切产物 ；3 pET 28a（+）- MD14-3-3 重组质粒双酶切产物
图 3 重组质粒的双酶切鉴定图
3 讨论
自 1994 年 Morrison 和 Muslin 发 现 14-3-3 蛋 白
能够特异地结合到含有磷酸化丝氨酸和苏氨酸的肽
段上以来，其作为第一个特异地结合磷酸化丝氨酸
和苏氨酸的信号转导分子，引起了人们的普遍关注，
而丝氨酸 / 苏氨酸激酶（STK）基因在植物中已被证
明是具有广谱抗病作用的基因之一［8］。现有研究表
明，14-3-3 蛋白调控机制的紊乱是许多疾病发生的
重要的原因之一，如许多恶性肿瘤、朊病毒疾病的
发生都与 14-3-3 蛋白相关［9-11］。我们推测，14-3-3
2013年第9期 109国果等 ：家蝇 14-3-3 蛋白基因的 cDNA 克隆与序列分析
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（责任编辑 李楠）