全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):186-192
恶性黑色素瘤是发生在皮肤和黏膜之间且可转
移的一种高度恶性肿瘤，其发病率和死亡率呈逐年
上升趋势［1］。顺铂（Cislpatin，DDP）是临床上常用
化疗药物，广泛用于治疗各种癌症［2］，但具有耳毒
性、肾毒性等毒副作用且肿瘤易对其产生耐药性［3-5］，
使其临床应用受到限制。
收稿日期 ： 2015-05-27
基金项目 ：新疆维吾尔自治区科技支疆项目（20091129），新疆生物资源基因工程重点实验室开放基金项目（XJDX0201-2010-06）
作者简介 ：常晨晨，女，硕士研究生，研究方向 ：分子克隆与药物筛选 ；E-mail ：528193074@qq.com
通讯作者 ：孙素荣，女，教授，硕士生导师，研究方向 ：细胞工程与药物筛选 ；E-mail ：sr_sun2005@163.com
重组骆驼蓬脂转移蛋白与顺铂联合抑制黑色素瘤 B16
细胞增殖效应的研究
常晨晨  王燕  管珊  孙素荣
（新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046）
摘 要 ： 旨在探讨重组骆驼蓬脂转移蛋白（Recombinant Peganum harmala lipid transfer protein，rPhLTP）与顺铂（DDP）联
用对鼠黑色素瘤 B16 细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。MTT 法检测 rPhLTP、顺铂单独及联用后对鼠黑色素瘤 B16 细胞增殖的影响 ；
流式细胞术检测细胞凋亡，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和线粒体膜电位（Δψm）的变化情况。结果显示，rPhLTP 和
DDP 联用后细胞生长抑制率和凋亡率显著高于 DDP 单独处理组（P < 0.01）；而且胞内 ROS 升高的水平均高于单独处理组（P < 0.01），
胞内 Δψm 水平均低于单独处理组，但无显著性差异。rPhLTP 可增强顺铂对 B16 细胞的生长抑制并促进细胞凋亡，与顺铂具有协
同作用。
关键词 ： 重组骆驼蓬脂转移蛋白 ；顺铂 ；鼠黑色素瘤 B16 ；增殖抑制
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.027
The Synergistic Inhibitory Effects of Recombinant Peganum Harmala
Lipid Transfer Protein and Cisplatin on the Proliferation of Melanoma
B16 Cells in vitro
Chang Chenchen Wang Yan Guan Shan Sun Surong
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，
Urumqi 830046）
Abstract: This work is to explore how the combination of recombinant Peganum harmala lipid transfer protein（rPhLTP）and cisplatin
（DDP）inhibits the proliferation of melanoma B16 cells and induces the apoptosis of them. MTT assay was used to measure the effects of
individual rPhLTP and DDP and combination of them on the proliferation of melanoma B16 cells. The cell apoptosis rate, reactive oxygen species
（ROS）, and mitochondrial transmembrane potential（Δψm）level were measured using flow cytometry. The results showed that both inhibitory
rate and apoptosis rate by the combination of rPhLTP and DDP were significantly higher（P < 0.01）than by individual DDP or rPhLTP,
moreover also levels of ROS raised inside cells by the combination were higher than by individuals（P < 0.01）. However, the levels of Δψm
inside the cells by the combination were lower than those by individuals, but the differences between the combination and individuals were not
such significant. In conclusion, rPhLTP enhanced the inhibitory effect of DDP on the proliferation of B16 cells and promoted the cell apoptosis,
indicating that rPhLTP and DDP has synergistic antitumor effect on B16 cells.
Key words: recombinant peganum harmala lipid transfer protein ；cisplatin ；melanoma B16 cells ；proliferation inhibition
2015,31(12) 187常晨晨等：重组骆驼蓬脂转移蛋白与顺铂联合抑制黑色素瘤 B16 细胞增殖效应的研究
植 物 非 特 异 性 脂 转 移 蛋 白（Non-specific lipid
transfer proteins，nsLTPs）是一类普遍存在于植物
体内的小分子、多功能、碱性可溶性的蛋白［6］，因
对脂质分子具有广泛亲和力［7］，在体外可将磷脂等
脂质体从表面转运至线粒体中而得名［8］，具有转
脂［9-11］、抗菌及抑制肿瘤［12］等作用。Lin 等［13］从
甘蓝中分离的 LTP 可抑制肝癌 Hep G2 细胞和乳腺
癌 MCF 7 细胞的增殖，其 IC50 为 5.8 和 1.6 μmol/L。
此外，Tousheh 等［14］研究发现水稻 nsLTPs，在细胞
内还可作为抗癌药物载体。脂转移蛋白所具有的多
种生物活性，目前已受到科学界广泛关注。
骆驼蓬（Peganum harmala）是蒺藜科（Zygop-
hyllaceae）骆驼蓬属（Peganum）的一种多年生草本
植物，具有止咳平喘、消寒助阳的作用，其生物碱
具有杀虫、抗菌、镇痛、抗癌的作用［15］。本课题
组在前期研究中发现，从传统维药骆驼蓬种子中分
离出的骆驼蓬脂转移蛋白（Peganum harmala Lipid
transfer protein，PhLTP）， 在 体 外 对 多 种 肿 瘤 细 胞
具有抑制生长作用，且对正常细胞毒性较小［16］。
通过基因工程手段获得的重组骆驼蓬脂转移蛋白
（rPhLTP）在体内具抑瘤作用［17］。本研究旨在探讨
重组 PhLTP 和 DDP 联合应用对黑色素瘤 B16 细胞
增殖和凋亡是否有协同效应。
1 材料与方法
1.1 材料
16 细胞为鼠黑色素瘤细胞，为本实验室保存。
重组骆驼蓬脂转移蛋白 rPhLTP 为本课题组诱导表达
纯化。顺铂购自齐鲁制药有限公司，1640 培养基及
胎牛血清（美国 Gibco 公司），MTT 及 DMSO（美国
sigma 公司），Annexin V-FITC/PI apoptosis kit（联科
生物公司），DCFH-DA、DiOC6（3）（美国 Sigma 公
司），胰酶，3423 型二氧化碳培养箱（美国 Thermo
公司），流式细胞仪（美国 BD 公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和实验分组 细胞培养于含质量分
数 为 10 g/L FBS 的 1640 培 养 基，37℃，5% CO2 饱
和湿度的恒温培养箱中孵育。实验分组为 ：空白对
照组、rPhLTP 组、DDP 组、rPhLTP 与 DDP 联合组。
rPhLTP 的 终 浓 度 梯 度 为 10 μg/mL、20 μg/mL、40
μg/mL，80 μg/mL，DDP 的终浓度梯度为 2.5 μg/mL、
5 μg/mL 和 10 μg/mL 及两药协同（rPhLTP 10 μg/mL、
20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL + DDP 2.5 μg/mL、5
μg/mL、10 μg/mL），rPhLTP 及 DDP 用 1640 培 养 基
配制。
1.2.2 MTT 法检测药物对细胞生长的抑制作用 将
5×104 个 / mL 细胞接种于 96 孔板，每孔 100 μL，
待细胞贴壁后分别加入药物作用 24 h 后，吸弃废
培养液，每孔加入 20 μL 的 MTT（5 mg/mL）和 80
μL 培养基，作用 4 h 后吸弃上清，每孔加入 150 μL
DMSO，避光震荡 15 min 后在 490 nm 处检测吸光值。
根据公式，细胞生长抑制率 =［1-（实验组 OD 值 - 空白
组 OD 值）/（对照组 OD 值 - 空白组 OD 值）］× 100 ％，
计算抑制率。rPhLTP 和 DDP 的联合作用效果根据
两药作用系数（Coefficient of drug interaction，CDI）
计算，CDI=AB/（A×B），AB 为两药联合作用的 OD
值与对照组 OD 值的比值，A 或 B 为单药处理组 OD
值与对照组 OD 值的比值。当 CDI < 1 时，表明两药
具有协同作用，当 CDI < 0.75 时，表明协同作用极
显著［18］。
1.2.3 流 式 细 胞 术 检 测 细 胞 凋 亡 率 将 4×105
个 /mL 细胞接种于 6 孔板中，总体积为 2 mL。细胞
贴壁后分别加入不同浓度的药物作用 24 h 后，收集
各处理组细胞，分别按 AnnexinV-FITC/PI apoptosis
kit 试剂盒说明书说明书操作，用 FACSCalibur 流式
细胞仪检测。
1.2.4 胞内活性氧（ROS）的检测 将 4×105 个 /mL
细胞接种于 6 孔板，每孔 2 mL，待细胞贴壁后分别
加入药物作用 24 h 后收集细胞，沉淀加 1.5 μmol/L
DCFH-DA，37℃孵育 15 min。收集细胞使用流式细
胞仪进行检测。
1.2.5 线 粒 体 膜 电 位（Δψm） 的 检 测 将 4×105
个 /mL 细胞接种于 6 孔板，每孔 2 mL，待细胞贴壁
后分别加入药物作用 24 h 后，收集细胞，离心，沉
淀加 4 nmol/L 的 DiOC6（3），37℃避光 15 min 后离
心，PBS 重悬，流式细胞仪检测（激发波长 484 nm，
吸收波长 501 nm）的荧光强度，Cell Quest 软件分析
结果。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12188
1.3 统计学分析
各组实验均重复 3 次，用 Prism 5 软件对数据
进行统计处理，采用双因素方差分析进行检验分析，
P<0.05 为有显著性差异。
2 结果
2.1 rPhLTP、DDP单独或联用对细胞生长抑制的
影响
MTT 结 果 显 示（ 表 1）， 当 用 10 μg/mL、20
μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL 的 rPhLTP 处 理 细 胞
后，检测到对 B16 细胞的增殖抑制率分别为（23.36
± 0.043）%、（36.59 ± 0.076）%、（47.13 ±
0.059）%、（83.58 ± 0.062）%，2.5 μg/mL、5 μg/mL
和 10 μg/mL 的 DDP 处理细胞后发现其对细胞的增
殖 抑 制 率 分 别 为（16.68 ± 0.098）%、（29.46 ±
0.108）% 和（34.98 ± 0.044）%。结果表明不同浓
度的 rPhLTP 或 DDP 单药处理 B16 细胞后，与空白
对照组相比，浓度为 20 μg/mL、40 μg/mL 的 rPhLTP
以及浓度为 5 μg/mL、10 μg/mL 的 DDP 具有显著性
差异（P < 0.05），浓度为 80 μg/mL 的 rPhLTP 具有
极显著性差异（P < 0.01），rPhLTP 和 DDP 单独作用
对 B16 细胞的增殖抑制具浓度依赖性。当不同浓度
的 rPhLTP、DDP 共同作用后对 B16 细胞的增殖抑制
作用均高于单药处理组，且 40 μg/mL rPhLTP 与 2.5
μg/mL DDP 协同作用后，对 B16 细胞的增殖抑制率
为（59.51 ± 0.185）%，显著高于高浓度的 DDP（10
μg/mL）处理后细胞的增殖抑制率，同时也显著高于
40 μg/mL rPhLTP 处理后对细胞的增殖抑制率（P <
0.01）。通过计算两药联合作用指数 CDI，发现不同
浓度的 rPhLTP 与不同浓度的 DDP 联合作用后，CDI
均小于 1，说明 rPhLTP 可增强 DDP 对 B16 细胞的
增殖抑制作用，具有协同效应。
2.2 rPhLTP与DDP联合应用对细胞凋亡的影响
Annexin V-FITC/PI 双染检测结果（图 1，表 2）
显示，不同浓度的 rPhLTP 处理 B16 细胞 24 h 后，
检测到凋亡率分别为（3.33 ± 0.034）%、（4.21 ±
0.78）%、（6.17 ± 0.19）% 和（9.32 ± 0.15）%，
与对照组相比均具有显著性差异（P < 0.05）；不同
浓度的 DDP 处理后检测到其凋亡率分别为（2.15 ±
0.27）%、（3.03 ± 0.19）% 和（4.42 ± 0.11）%，
与对照组相比浓度为 5 μg/mL 和 10 μg/mL 的 DDP 具
有显著性差异（P < 0.05），表明不同浓度的 rPhLTP
与 DDP 可以浓度依赖性的方式诱导 B16 细胞发生
凋 亡。 当 rPhLTP 与 DDP 联 合 作 用 作 用 B16 细 胞
后，检测到其凋亡率均高于单药处理组细胞的凋亡
率，且当不同浓度的 rPhLTP 与 10 μg/mL 的 DDP 联
用后，检测到其凋亡率均显著高于高浓度的 DDP
（10 μg/mL）处理后细胞的凋亡率（4.42 ± 0.11）%
（P < 0.05），当高浓度的 rPhLTP（40 μg/mL）与 2.5
μg/mL 的 DDP 联 合 后 其 对 细 胞 的 凋 亡 率（6.69 ±
0.69）% 显著高于高浓度的 DDP（10 μg/mL）处理
后细胞的凋亡率（4.42 ± 0.11）%（P < 0.01）。
2.3 胞内活性氧（ROS）的检测
当细胞受到外界物质刺激而发生凋亡时，细
胞内的 ROS 水平会发生变化。为了检测 rPhLTP 与
DDP 单独及联合作用是否对 B16 细胞 ROS 产生影
响，采用 DCFH-DA 荧光染料对处理的细胞进行染
色。结果（表 3）表明，当用 10 μg/mL、20 μg/mL、
40 μg/mL 和 80 μg/mL 的 rPhLTP 处理细胞后，检测
表 1 rPhLTP 与 DDP 单独及联合作用对 B16 细胞的增殖
抑制
药物 浓度 /（μg·mL-1） 抑制率 /% CDI
rPhLTP 0 6.25±0.313
10 23.36 ± 0.043
20 36.59 ± 0.076*
40 47.13 ± 0.059*
80 83.58 ± 0.062**
DDP 2.5 16.68 ± 0.098
5 29.46 ± 0.108*
10 34.98 ± 0.044*
rPhLTP+DDP 10+2.5 26.37 ± 0.022 0.992
20+2.5 40.18 ± 0.106* 0.859
40+2.5 59.51 ± 0.185** 0.77
80+2.5 83.95 ± 0.079** 0.984
10+5 39.52 ± 0.037 0.446
20+5 45.24 ± 0.079* 0.98
40+5 61.26 ± 0.049** 0.92
80+5 83.05 ± 0.054** 0.706
10+10 42.11 ± 0.039 0.996
20+10 59.07 ± 0.121* 0.886
40+10 78.65 ± 0.044** 0.574
80+10 91.97 ± 0.046** 0.847
*P<0.05，vs. Control ；**P<0.01，vs.Control
2015,31(12) 189常晨晨等：重组骆驼蓬脂转移蛋白与顺铂联合抑制黑色素瘤 B16 细胞增殖效应的研究
到 ROS 的平均荧光强度（MIF）分别为（143.66 ±
5.98）%、（230.44 ± 1.12）%、（290.05 ± 1.66）%、
（310.55 ± 1.59）%， 用 2.5 μg/mL、5 μg/mL 和 10
μg/mL 的 DDP 处理细胞后检测到 ROS 的 MIF 分别
为（169.28 ± 4.01）%、（245.67 ± 3.09）% 和（268.25
± 3.80）%。说明随着 rPhLTP 或 DDP 浓度的增加，
胞内 ROS 的水平也呈上升的趋势，与对照组相比浓
度 大 于 40 μg/mL 的 rPhLTP 以 及 浓 度 大 于 5 μg/mL
的 DDP 均具有显著性差异（P < 0.05）。rPhLTP 与
DDP 联合作用后检测到 ROS 的 MIF 均高于 rPhLTP、
DDP 单独处理细胞后胞内的 ROS 水平，且 20 μg/mL
rPhLTP 与低浓度的 DDP（2.5 μg/mL）联合作用胞内
的 ROS 为（308.87 ± 8.92）%，显著高于高浓度的
DDP（10 μg/mL）单独处理细胞后胞内的 ROS（268.25
± 3.8）% 水平，同时也显著高于 20 μg/mL rPhLTP
单独处理细胞后胞内 ROS（230.44 ± 1.12）% 的水
平（P < 0.01）。结果提示 rPhLTP 与 DDP 联合作用
B16 细胞后，可使胞内的 ROS 水平发生变化，说明
100
100 101
Annexin V FITC
Pr
op
id
iu
m
lo
di
de
102
1.33%
103 104
101
102
103
104
control
A
100
100 101
Annexin V FITC
Pr
op
id
iu
m
lo
di
de
102
6.53%
103 104
101
102
103
104
10 μg/mLB
100
100 101
Annexin V FITC
Pr
op
id
iu
m
lo
di
de
102
12.16%
103 104
101
102
103
104
20 μg/mLC
100
100 101
Annexin V FITC
Pr
op
id
iu
m
lo
di
de
102
16.46%
103 104
101
102
103
104
40 μg/mLD
A ：control ；B ：10 μg/mL DDP + 10 μg/mL rPhLTP ；C ：10 μg/mL DDP + 20 μg/mL rPhLTP ；D ：10 μg/mL DDP+40 μg/mL rPhLTP
图 1 流式细胞术检测 B16 细胞凋亡率
表 2 rPhLTP 与 DDP 联合作用对 B16 细胞凋亡率的影响
DDP/（μg·mL-1）
rPhLTP/（μg·mL-1）
0 10 20 40 80
0 1.32 ± 0.13 3.33 ± 0.034* 4.21 ± 0.78* 6.17 ± 0.19* 9.32 ± 0.15*
2.5 2.15 ± 0.27 3.46 ± 0.13* 4.87 ± 0.56* 6.69 ± 0.69* 10.07 ± 0.32*
5 3.03 ± 0.19* 4.13 ± 0.02** 6.24 ± 0.05** 9.97 ± 0.61** 12.13 ± 0.44**
10 4.42 ± 0.11* 6.69 ± 0.18** 11.22 ± 0.57** 15.86 ± 0.56** 18.92 ± 0.58**
*P<0.05，vs. Control ；**P<0.01，vs.Control
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12190
二者联合诱导细胞发生凋亡可能与 ROS 的升高相关。
2.4 线粒体膜电位（Δψm）的检测
在凋亡的细胞中，由于线粒体会受到损失而使
横跨线粒体的膜电位下降或消失。在本实验中，通
过 DiOC6（3） 荧 光 染 料 检 测 rPhLTP、DDP 单 独
及联用后 B16 细胞中线粒体膜电位（Δψm）的变
化。 结 果 见 图 2 和 表 4， 当 10 μg/mL、20 μg/mL、
40 μg/mL 和 80 μg/mL 的 rPhLTP 处 理 细 胞 后 其 胞
内 Δψm 的 MIF 分别为（95.04±086）%、（94.38 ±
0.10）%、（90.13 ± 1.20）% 和（83.63 ± 1.20）%，
2.5 μg/mL、5 μg/mL 及 10 μg/mL 的 DDP 处理后检测
Δψm 的 MIF 分 别 为（93.75 ± 0.65）%、（90.19 ±
0.34）% 和（85.67 ± 0.93）%，表明 rPhLTP、DDP
单独作用 B16 细胞后，胞内 Δψm 的水平以浓度依赖
性的方式降低。rPhLTP 与 DDP 联用后，Δψm 降低
的水平较单药处理组细胞高。
表 3 rPhLTP 与 DDP 联合作用对 B16 细胞 ROS 的影响
DDP/（μg·mL-1）
rPhLTP/（μg·mL-1）
0 10 20 40 80
0 139.25 ± 1.15 143.66 ± 5.98 230.44 ± 1.12 290.05 ± 1.66* 310.55 ± 1.59*
2.5 169.28 ± 4.01 177.22 ± 7.70 308.87 ± 8.92* 326.87 ± 9.46* 349.17 ± 1.53**
5 245.67 ± 3.09* 259.73 ± 6.24 326.12 ± 6.34* 379.08 ± 4.01** 441.34 ± 9.72**
10 268.25 ± 3.80* 289.25 ± 1.32* 338.34 ± 4.72* 407.51 ± 3.32** 450.51 ± 1.15**
**P<0.01 vs control，*P<0.05，vs. Control
100
0
40
80
120
C
ou
nt
s
160
200
A
95.64%
101 102
FL1-H
103 104 100
0
40
80
120
C
ou
nt
s
160
200
B
95.08%
101 102
FL1-H
103 104
100
0
40
80
120
C
ou
nt
s
160
200
C
90.49%
101 102
FL1-H
103 104 100
0
40
80
120
C
ou
nt
s
160
200
D
81.24%
101 102
FL1-H
103 104
A ：10 μg/mL rPhLTP ；B ：20 μg/mL rPhLTP ；C ：40 μg/mL rPhLTP ；D ：80 μg/mL rPhLTP
图 2 不同浓度的 rPhLTP 作用后 B16 细胞线粒体膜电位的改变
2015,31(12) 191常晨晨等：重组骆驼蓬脂转移蛋白与顺铂联合抑制黑色素瘤 B16 细胞增殖效应的研究
3 讨论
恶性黑素瘤在体内的自然凋亡率比其它肿瘤要
低，具有抵抗药物诱导凋亡特性，且其预后差［1］，
因此有必要研究探讨治疗恶性黑素瘤的有效方法。
顺铂（DDP）被用于治疗多种肿瘤，其机制涉及
DNA 损伤和诱导线粒体凋亡从而激活肿瘤细胞凋亡
信号发挥作用［2，19］，但 DDP 毒副作用大［3-7］，因此
需要寻找一种药物与其联用以减轻其不良反应。植
物脂转移蛋白可以抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋
亡［12-14］。本课题组前期研究发现重组骆驼蓬脂转移
蛋白及重组真核质粒均能抑制体内黑色素瘤细胞的
生长［17，20］，预示骆驼蓬脂转移蛋白在治疗黑色素瘤
中具有潜在应用价值。
本 实 验 应 用 MTT 法 检 测 了 rPhLTP 合 用 DDP
时对 B16 细胞增殖的影响，结果表明当 40 μg/mL
rPhLTP 与 2.5 μg/mL DDP 共同作用后，对 B16 细胞
的增殖抑制率显著高于单药处理组（P < 0.01），两
药 联 合 作 用 指 数 CDI 均 <1， 说 明 rPhLTP 可 增 强
DDP 对 B16 细胞的增殖抑制效应，对 B16 细胞有
化疗增敏作用。用流式细胞仪检测二者合用对 B16
细胞凋亡的影响，结果发现不同浓度的 rPhLTP 与
DDP 可以浓度依赖性的方式诱导 B16 细胞发生凋亡，
当 rPhLTP 与 DDP 联合作用 B16 细胞后，检测到其
凋亡率均高于单药处理组细胞的凋亡率，且当 40
μg/mL 的 rPhLTP 与 2.5 μg/mL 的 DDP 联合后其对细
胞的凋亡率显著高于高浓度的 DDP（10 μg/mL）处
理后细胞的凋亡率。推测 rPhLTP 协同 DDP 对 B16
细胞的增殖抑制作用可能与诱导细胞凋亡有关。
据文献报道，ROS 是细胞凋亡的早期信号，促
使线粒体膜通透性改变，使线粒体膜电位下降，还
能 与 caspase-9 前 体、ATP/dATP 形 成 凋 亡 体， 诱
导细胞凋亡［21］。当细胞受到凋亡诱导信号的刺激
后，胞内的 ROS 会升高，可上调自噬以杀伤肿瘤细
胞［22］。梁晓松等［23］研究表明大黄素可提高肿瘤细
胞内 ROS 水平，从而提高癌细胞对化疗药物的敏感
性。本研究发现 rPhLTP 与 DDP 联用胞内的 ROS 水
平均高于 rPhLTP、DDP 单独处理组，提示两药联用
诱导 B16 细胞发生凋亡可能依赖于胞内 ROS 放大信
号的作用，通过线粒体途径诱导细胞凋亡。
许多研究结果表明线粒体是细胞凋亡的核心，
线粒体膜电位对维持线粒体正常功能是十分必要的，
大多抗癌药物在诱导各种类型细胞凋亡均伴随线粒
体膜电位的下降，一旦线粒体膜电位崩溃，细胞凋
亡不可逆转［24］。如刘浩等［25］研究表明白藜芦醇可
通过降低黑色素瘤细胞的线粒体膜电位，诱导细胞
凋亡。本研究发现 rPhLTP、DDP 单独作用细胞后胞
内 Δψm 随药物浓度的升高而降低，且两药联用后胞
内 Δψm 水平均低于 rPhLTP、DDP 单独处理后胞内
Δψm 水平，但无显著性差异。提示 rPhLTP 与 DDP
可能协同作用于线粒体，通过降低线粒体膜电位，
破坏线粒体稳定性，使诱导凋亡的因子释放到细胞
质中诱导细胞凋亡，从而提高抗肿瘤效果。但二者
联合应用诱导细胞凋亡的作用机制及可能的作用靶
点有待于进一步研究。
4 结论
rPhLTP 与顺铂有协同作用，可增强顺铂对 B16
细胞的增殖抑制作用，并以浓度依赖性的方式促进
B16 细胞发生凋亡。
参 考 文 献
［1］ Little EG, Eide MJ. Update on the current state of melanoma incide-
nce［J］. Dermatol Clin, 2012, 30（3）：355-361.
［2］ Galluzzi L, Senovilla L, Vitale I, et al. Molecular mechanisms of
cisplatin resistance［J］. Oncogene, 2012, 31 ：1869-1883.
表 4 rPhLTP 与 DDP 联合作用对 B16 细胞 Δψm 的影响
DDP/（μg·mL-1）
rPhLTP/（μg·mL-1）
0 10 20 40 80
0 95.79 ± 0.96 95.04 ± 0.86 94.38 ± 0.10 90.13 ± 1.20 83.63 ± 1.20*
2.5 93.75 ± 0.65 91.97 ± 0.36 89.86 ± 0.89 89.15 ± 0.27 84.01 ± 1.41*
5 90.19 ± 0.34 88.93 ± 0.16 86.79 ± 1.14 85.76 ± 0.81 82.10 ± 1.23*
10 85.67 ± 0.93 83.71 ± 0.75* 82.68 ± 0.91* 81.84 ± 0.85* 77.26 ± 1.02*
*P<0.05，vs. Control
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12192
［3］张蕾 , 陈露 , 李蒙蒙 , 等 . 丹参酮 I 抑制小鼠 B16 黑色素瘤细胞
研究［J］. 浙江林业科技 , 2014, 3（34）：14-18.
［4］王肇炎 , 王尔兵 . 奈达铂 ：一种铂类抗癌新药［J］. 药学进展 ,
2002, 26（4）：223-226.
［5］丁大连 , 亓卫东 , 张梅 , 等 . 顺铂及其耳毒性［J］. 中华耳科学
杂志 , 2008, 6（2）：125-133.
［6］刘芳 , 卢长明 . 植物非特异脂质转运蛋白研究现状与展望［J］.
遗传 , 2013, 35（3）：307-314.
［7］汪少芸 , 叶秀云 , 饶平凡 . 植物非特异脂转移蛋白的研究［J］.
生物学通报 , 2004, 39（9）：11-12.
［8］金大伟 , 杨军 , 李锋 , 等 . 烟草非特异性脂质转移蛋白基因的克
隆与表达分析［J］. 烟草科技 , 2015, 48（1）：12-20.
［9］Gincel E, Simorre JP, Caille A. et al. Three dimensional structures
in solution of a wheat lipid-transfer protein from multidimensional
H-NMR date［J］. Eur Biochem, 1994, 226 ：413-422.
［10］ Borges JP, Jauneau A, Brulé C, et al. The lipid transfer proteins
（LTP）essentially concentrate in the skin of Rosaceae fruits
as cell surface exposed allergens［J］. Plant Physiology and
Biochemistry, 2006, 44 ：535-542.
［11］ Kim TH, Kim MC, Park JH, et al. Differential expression of rice
lipid transfer protein gene（LTP）classes in response to abscisic
acid, salt, salicylic acid, and the fungal pathogen Magnaporthe
grisea［J］. Journal of Plant Biology, 2006, 49（5）：371-375.
［12］Linda SM, Li T, Su MX, et al. Isolation, characterization, molecular
cloning and modeling of a new lipid transfer protein with antiviral
and anti-proliferative activities from Narcissus tazetta［J］.
Peptides, 2008, 29 ：2101-2109.
［13］Lin P, Xia LX, Wong JH, et al. Lipid transfer proteins from
Brassica campestris and mung bean surpass mung bean chitinase
in exploitability［J］. Journal of Peptide Science, 2007, 13 ：642-
648.
［14］Tousheh M, Darvishi FZ, Miroliaei M. A novel biological role for
nsLTP2 from Oriza sativa ：potential incorporation with anticancer
agents, nucleosides and their analogues［J］. Computational
Biology and Chemistry, 2015, 58 ：9-18.
［15］赵婷 , 王长虹 , 王峥涛 . 骆驼蓬属植物中生物碱类化学成分及
其药理活性研究进展［J］. 国际药学研究杂志 , 2010, 37（5）：
333-345.
［16］马晓瑾 , 吴婷 , 罗晶晶 , 等 . 骆驼蓬种子中一种具抗肿瘤活
性蛋白的分离纯化及鉴定［J］. 天然产物研究与开发 , 2012,
24 ：1020-1025.
［17］赵晶 , 吕慧 , 段晓梅 , 等 . 重组骆驼蓬脂转移蛋白对 B16 实体
瘤的抑制作用［J］. 生物技术 , 2013, 23（6）：86-89. .
［18］王军 , 谭诗云 , 陈建华 , 等 . 多肽 Pll0 结合顺铂对多种肿瘤细
胞杀伤作用的研究［J］. 中国药理学通报 , 2011, 27（12）：
1728-1731.
［19］万婷 , 李连宏 . 顺铂肾毒性机制及其防护的研究进展［J］. 中
华临床医师杂志 , 2013, 7（14）：192-193.
［20］赵晶 , 吕慧 , 贾依娜古丽·朱玛拜 , 等 . 骆驼蓬脂转移蛋白基
因真核表达载体的构建及其体内外抗瘤效应的研究［J］. 中
国生物工程杂志 , 2014, 34（8）：7-13.
［21］蔡先彬 , 荆绪斌 , 胡辉 , 等 . 活性氧在顺铂诱导食管癌细胞
EC-109 凋亡中的作用［J］. 癌症 , 2006, 25（4）：427-431.
［22］尤寿江 , 石际俊 , 张艳林 , 等 . ROS 介导的自噬及其在相关
疾病中的作用［J］. 中国病理生理杂志 , 2011, 27（1）：187-
190.
［23］梁晓松 , 陈素钻 , 俞晶 , 等 . 大黄素联合顺铂对食管癌 EC9706
细胞增殖的影响［J］. 广东医学 , 2011, 32（14）：1819-1821.
［24］孙建平 , 谭竹钧 , 韩雅莉 . 细胞凋亡检测方法的研究进展［J］.
生物技术通报 , 2012（1）：54-59.
［25］刘浩 , 蒋琛琛 , 程秀 , 等 . 白藜芦醇对人黑色素瘤细胞增殖及
凋亡的影响［J］. 中国药理学通报 , 2011, 27（7）：998-1002.
（责任编辑 李楠）